Abstract
B 림프구 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 처음에 IgM 항체 등의 IgA, IgE 항체와 IgG의 다른 고등학교의 이소 타입으로 전환 표현 된 것을 특징으로하는 과정이다. 시험 관내 IGH CSR의 측정은 분자 세포 면역학의 측면 DNA 재조합 및 수리에 이르기까지 생물학적 공정 수의 연구를위한 중요한 방법이다. 관내 CSR 분석은 활성화 된 B 세포에 대한 유세포 측정면 IG 표현식을 수반한다. 의 IgA와 IgG의 서브 클래스의 측정이 간단하지만,이 방법으로 IgE 항체의 측정으로 인해 용해 IgE 항체가 FcεRII에 결합에 문제가있다 / CD23 활성화 B 세포의 표면에 발현. 여기에서 우리는 문화에 CSR을받은 마우스 B 세포를 IgE 항체가 생산의 정확한 측정을위한 고유 한 절차를 설명합니다. 방법 B에 의해 CY 계통 세포의 IgE가 생산의 검출을 허용 세포 표면에 대한 IgE CD23 복합체 트립신 - 매개 절단에 기초toplasmic 염색. 이 절차에 대한 IgE의 CSR 유세포 분석을위한 편리한 해결책을 제공한다.
Introduction
마우스와 인간 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR) 중, 고등학교의는 일정한 지역 엑손 (Cμ가) 삭제 및 다운 스트림 일정한 지역 엑손의 여러 세트 중 하나 (C의 H s의) (예를 들어 Cγ로 대체 μ IG 다른 클래스 (예를 들면 IgG를, IgE 항체, 또는 적 IgA)의 제조에 대한 IgM 항체의 생산에서 발생 Cε 스위치 및 Cα). CSR은 C H의 1의 각 세트 5 '위치 1-10킬로바이트 시퀀스는 스위치 (S) 지역 내에서 발생합니다. 활성화 - 유도 시티 딘 데 아미나 제 (AID) 효소는 시티 딘의 탈 아미노 활동을 통해 CSR을 시작합니다.
IgE 항체는 알레르기 질환 2의 주요 중재자 및 IgE의 생산 및 아토피 질환에 대한 새로운 치료 방법으로 문을 열 수 있습니다 규제 방법에 대한 이해이다. 마우스와 인간에서의 IgE는 가장 엄격하게 규제 IG 이소 타입이다. IgE 항체는 일반적으로 팀의 수준 수천에서 감지ES 다른 IGH 미만 3 아이소 타입이지만 높은 질환 상태 4에서 증가 될 수있다. 그러나 IgE 항체에 CSR은 불완전하게 이해된다. B 세포의 체외 활성화는 IL-4 항 CD40 또는 LPS 중 하나와 조합은, 모두의 IgG1과 IgE의 5 CSR을 유도하여. 활성화 된 B 세포를 용해 IgE 항체가 CSR 후 문화 분비 결합 선호도가 낮은의 IgE 수용체 FcεRII / CD23 2,6-을 표현한다. 유동 세포 계측법으로 분석 할 때 따라서, 수용체에 결합 된 IgE의 얼룩 B 세포는 유사 내생 적 IgE 항체 (7)를 발현하는 세포를 B로. 그것은 그 마우스 B를 알려져 있지만 세포는의 IgG1에 클래스 전환의 측정에 방해가 나타나지 않는 우리의 경험에서 선호도가 낮은 IgG의 수용체 FcγRIIB1 (CD32) 8을 표현한다. 배양에서 B 세포 활성화 후 IgE의 전환을 측정하는 경우에는, 표면 - 결합 특이성 IgE 항체는 분석을 가릴 수있다. 공통 염색 방법과 비 IgE 항체 발현 세포가 IgE에 대해 긍정적으로 염색.
여기에 설명 된 마우스 (9)로부터 참의 IgE 발현 B 세포를 CSR 세이를 수행하고 검출하는데 이용 된 전략 - 11. 트립신으로 활성화 된 B 세포의 치료는 일반적인 실험실 시약은 단백질을 소화, 세포 친화 및 막 모두 결합 된 표면의 IgE는 제거합니다. 세포질 IgE에 대한 후속 투과성으로 염색 따라서 진정한 IgE 항체 생산 세포를 보여준다.
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Protocol
참고 : 여기에 설명 된 모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라했고, 동물 연구 아동 병원 (ARCH), 보스턴, 질량에 의해 승인했다.
시약 1. 준비
- 1000 배 스톡 IL-4 : H 2 O 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 20 μg의 / ㎖ 묽은 IL-4 사이토 카인. -20 ℃에서 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 및 상점을 200㎕ 분량 씩 분주한다.
- 1,000 배 안티 CD40 : 4 ℃에서 1.0 ㎎ / ㎖, 가게에서 제조 업체에서 얻습니다.
- B 세포 자극 미디어 : RPMI-1640 배지 425 mL의 추가, 75 갓 해동 소 태아 혈청의 ㎖ (FCS), 1.0 M HEPES 버퍼, 5 ML의 L 글루타민 재고 10 ㎖, 5 ml의 페니실린 : 스트렙토 마이신 주식, 5 2- 머 캅토 에탄올 ml의 최소 필수 중간 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA), 3.5 μL. 일주일에 최대 4 ℃에서 둡니다. IL-4 (20 NG / ㎖) 및 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖)에 사용 직전에 추가단지 필요한 미디어의 볼륨.
- 2 % FCS-FACS 버퍼 : 1X PBS의 490 ml의 FCS의 10 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 배 트립신 EDTA 용액 : 1X PBS 20ml에 10 배 트립신 EDTA 원액 (5.0 g 트립신, 리터 당 2.0 g의 EDTA) 5 mL를 희석. 저장 트립신 EDTA는 2 배에서 4 ° C에서 분주 작업. 사용하기 전에 실온으로 가온시킨다.
- 태아 혈청은 : 최대 2 주 동안 4 ℃에서 해동 FCS를 유지합니다. 세포질 염색 절차 전에 얼음 15 분에 놓습니다.
- 중성 완충 포르말린 : 10 % 포르말린 용액 (3.7 % 파라 포름 알데히드)를 준비한다. 포르말린은 독성이 적절한 PPE를 착용하는 동안 따라서 실험실 흄 후드를 처리 할 수 있습니다. 화학 스토리지 캐비닛을 실온에서 보관 포르말린.
- 메탄올 : -20 ° C에서 보관 절대 메탄올 (100 %)의 세포 투과 가능하게 할 준비가 될 때까지. 그 메탄올이 가연성 적절한 냉동실에 보관해야합니다.
2.정제 된 B 세포의 활성화
- 갓 수확 된 마우스의 비장에서 부드럽게 3 ㎖ 주사기의 플런저와 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 장기를 눌러 단일 세포 현탁액을 제조. 15 ml의 원추형 원심 분리 관에서, 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에서 1X PBS 10ml에 세포를 수집하고 원심 분리기.
- 5 분 동안 적혈구 용혈 완충액 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 펠렛을 따르다. 5 분 동안 300 XG에서 1X PBS 13.5 ml의 원심으로 중화.
- (선택 사항) 자기 (磁 气) 제조업체의 지침에 따라 MACS 정화 프로토콜 다음, 구슬을 방지 CD45R (B220)를 사용하여 B 세포를 표지 된 구분합니다.
- 37 ° C에서 IL-4 (20 NG / ml) 및 오일에 대한 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖) 함유 가온 B 세포 자극 배지에서 1.0 × 106 세포 / ml으로 정제 된 B 세포를 자극한다. 6 웰 배양 판 (4 ml의 각)의 두 우물로 나누어 문화의 8 ml로 시작합니다.
- cultu 확인1.0 × 106 세포 / ml로 유지하기 위해 매일 재. 다른 웰로 분할 신선한 IL-4와 항 CD40을 함유하는 B 세포 자극 매체 배양을 희석하여 농도를 조정한다.
3. 트립신, 고정 및 투과성으로
- 트립신
- 5 분 300 XG에, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 배양 세포의 최대 1.0 × 10 (7)를 수집, 상층 액을 가만히 따르다.
- 셀 수집 미디어에서 잔류 단백질을 제거하기 위해 PBS의 10 ml로 세척 할 것. 원심 분리 단계를 반복하여 상층 액을 가만히 따르다.
- (약 100 μL)을 경사 분리 한 후 잔류 체적의 세포 펠렛을 재현 탁.
- 조심스럽게 세포에 실온 0.1 % (2 배) 트립신 EDTA의 800 μl를 추가합니다. 원추형 튜브의 측면 아래로 45 ° 각도로 천천히 디스펜스.
- 튜브를 닫고 액체가 관 5-6 시간의 길이를 따라 실행되도록 튜브를 기울여 부드럽게 혼합의. 힘줄, 백색 침전물은 용액 중에 형성 할 수있다. 분 아래에 트립신 시간을 제한합니다.
- 감기 FCS 1ml의 트립신 처리로 반응을 켄칭. 즉시 차가운 PBS 10 ㎖를 첨가하여 희석 FCS.
- 4 ° C에서 5 분 300 XG에 원심 분리 한 후 상층 액을 가만히 따르다과 얼음에 튜브를 반환합니다.
- 정착
- 경사 분리 후 잔류 체적의 세포를 재현 탁. 필요한 경우, 차가운 PBS 100 μL에 볼륨을 가져.
- 흄 후드에서, 세포에 10 % 중성 완충 포르말린 용액 800 μL를 추가하고 상하 피펫. 튜브는 포르말린 첨가시 따뜻하게. 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 투과성으로
- 부드러운 흔들림 속도로 벤치 탑 와류 믹서를 설정합니다.
- 10 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 추운 (-20 ° C) 메탄올 9 ml에 그립니다.
- 와류 믹서를 통해 세포를 포함하는 튜브를 잡고 부드럽게 흔들리는 시작g 세포.
- 튜브는 여전히 떨고 메탄올을 지속적으로 혼합되는 동안이 세포에 적가 쓰러 튜브에 냉 메탄올을 추가합니다. 메탄올 2ml의 제 후에 분배 속도가 느린 스트림으로 증가 될 수있다.
- 30 분 투과성으로를 완료 할 때 튜브가 얼음에 앉아 보자. 대안 적으로, 세포는 개월까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
의 IgG1과 IgE의 클래스 전환 4. 형광 염색
- 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에 샘플은 메탄올 용액 캔트. 백색 침전물을 세포 펠릿있다.
- 5 분 세포를 씻어 300 XG에서 객실 PBS 1X 온도와 원심 분리기 10 ML을 추가합니다. 한 번 반복합니다. 참고 : 실온 PBS와 펠렛을 세척하는 단계 4.1 이후에 형성 할 수있다 여분의 침전물을 용해.
- 2 % FCS-FACS 완충액 10 mL로 추가 세척을 수행합니다.
- 바닥 판 라운드 96 웰에 샘플을 배포5 분 동안 원심 분리기 (300) XG. 상층 액을 가만히 따르다과 얼음에 접시를 넣어.
- 다음과 같은 항체를 희석 잘 2 % FCS-FACS 버퍼의 60 μL에 얼룩 : 안티 IgM 항체 RPE / Cy7, 1 : 200, 안티의 IgG1 PE, 1 : 600, 안티 IgE에 FITC, 1 : 100, 안티 - CD45R (B220)를 PerCP-Cy5.5, 1 : 200
- 5 분 염색 한 후, 300 x g에서 5 분 동안 2 % FCS-FACS 완충액 원심 150 μL로 플레이트를 세척한다.
- 5 ML의 FACS 튜브에 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 2 % FCS-FACS 버퍼와 피펫 400 μL에 재현 탁.
5. 다음 게이팅 전략을 사용합니다 :
- FSC / SSC 플롯 (그림 1)에있는 발파 림프구 인구에서 CD45R (B220) 양성 세포를 분리합니다.
- B220 양성 세포에서 해당 인구를 나타 내기 위해 IgE 항체와의 IgG1 플롯을 사용합니다.
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Representative Results
이 절차가 성공적으로 마우스 B 세포에서 IgE 항체에 CSR을 연구하기 위해 구현되었습니다. 앞서 설명한 바와 같이 11 CSR 측정에서 효율을 입증하기 위해, 우리는 항 CD40 및 IL-4와 마우스 비장 B 세포를 자극. 자극 5 일 후, 세포를 수거하고, 프로토콜 형광 표지 IgM이, IgG1에, IgE 항체, 및 B220 (CD45R) 항체 상술과 염색을 이용하여 처리 하였다. (도 1), + 세포의 IgE에 명확한 인구 깔끔하게 트립신 처리 (도 2a)없이 판별 될 수 블라스팅 림프구 게이트. 그러나, 고정 및 투과성으로 이전에 세포의 트립신으로 인해 표면 바인딩 IgE 항체의 제거에 IgE 항체 생산 세포 (그림 2b)의 분리를 할 수 있습니다.
그림 1 : ForwIL-4 및 안티 CD40와 문화에 자극 5 일 후 마우스의 비장의 B 세포의 측면 분산 FACS 플롯 대 ARD. 발파 림프구는 총 획득 한 사건의 63 %를 차지합니다.
그림 2 :. 활성화 된 B 세포의 IgE와의 IgG1의 세포질 염색에 트립신의 효과 (A, B) 문화의 활성화 후 129 / B6 혼합 된 배경 마우스에서 비장 B 세포를 폭파에 게이트 외과 (위) 플롯과 막대 그래프 (아래) 항 CD40 및 IL-4 5 일 동안. 단독으로 고정 및 메탄올 투과성으로 (a) 및 트립신 (b)의 첨가로 나타낸다.
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Discussion
항 CD40 및 IL-4와 문화에 마우스 비장 B 세포의 자극의 IgG1과 IgE의 5 T 도우미 2 형 (T H 2) 상호 작용을 격려 클래스 전환을 시뮬레이션합니다. B 세포는 비장 세포 총 12 또는 정제 된 비장의 B 세포 (11)의 맥락에서 CSR을 위해 활성화 될 수있다. 프로토콜 (단계 2.3)에서 설명한 바와 같이, B 세포 농축은 선택 사항이며, 그것은 유익 할 것이다 있는지 확인 실험자의 판단이다. CD45R (B220)를 사용하여 B 세포의 양성 자성 비드 분리가 여기에 사용된다 -labeled. 분리 후, B 세포 농도를 적절한 항체 및 사이토킨 자극에 1.0 × 106 세포 / ml로 조절 될 수 있도록하여 FACS 세포 순도를 확인할 것을 권장한다. 또한이 냉동 / 해동 사이클을 거쳤다 IL-4 단백질 활성을 감소 수도 있음에 유의해야한다.
이전의 고정 및 투과성으로하는 세포의 트립신은 정확도는 허용(그림 2) 유동 세포 계측법을 통해 클래스 전환의 측정을 먹었다. 세포의 적절한 트립신이 절차의 성공적인 응용 프로그램에 매우 중요합니다. FCS는 트립신을 억제 할 수있는 것처럼, 1X PBS 세척 전에 트립신 단계로 수행됩니다. 우리는 실온에서 30 초 배양이 완료 소화하기에 충분했습니다. 더 긴 내구 띄게 세포 생존에 영향을 미칠 수있다.
분석하기에 앞서 흔적 메탄올을 제거하는 PBS로 세포를 여러 번 세척하는 것이 필수적이다. 메탄올 이월 13 항체 결합을 변경할 수 있고, 하류 유세포 분석 (14)에 사용 된 FCS에서 단백질을 침전 수있다. 이 점에있어서, 투과성으로 다른 방법 (즉, 사포닌) 메탄올 대신 사용할 수있다. 메탄올은 세제 막 (15)의 무결성을 방해하면서, 막 지질을 용해시키는 유기 용제이다. 메탄올 투과성으로에 장점은 확장 된 스토리지의 기능입니다-20 C 14 ° 고정 된 세포의.
이 절차를 사용할 때주의해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 절단 단백질 잔류 물을 트립신 때문에 일부 FACS 얼룩은 치료 후 다른 나타나거나 아예 에피토프를 대상으로 결합 할 수있는 능력을 잃을 수 있습니다. 또한, 트립신 처리 후 세포 수의 손실이 발생할 수 있습니다. 우리가 각각의 하이 브리 도마 클론 항체 (11)의 분비를 측정으로부터 수집 클래스 스위칭 데이터 명확 필적이 방법을 발견하지만, 이것 CSR IgE의 측정의 정확도에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
다른 방법은 IgE 항체 생산 마우스 B 세포를 검출하기 위해보고되었다. 18 - 한 가지 방법은 셀 (16)을 IgE 항체가 발현에 막 결합 IgE에 염색을하는 수용체에 결합 된 IgE 항체 전에 제거 산 세척 절차를 사용합니다. 또 다른 방법은 셀 permeabiliz 전에 모든 표면의 IgE을 차단하는 모노클로 날 항 - 면역 글로불린 항체를 사용하여IgE에 발현하는 세포 (19)의 세포 내 IgE에 대한 ATION 및 염색. 더욱이, 최근의 연구는 IgM이 +, IgD의 +, IgA와 IgG의 + + B 세포 서브 세트 (20)를 제외하여 인간 IgE에 교환 B 세포 개체군을 식별 여덟 색 FACS 패널 프로파일. 이러한 다른 방법에 비해, 여기에서 설명한 방법은, 산 세척 변성의 사용을 회피하고, 과량의 항체가 필요하지 않다.
이 절차에 대한 장점은 CSR에 대한 IgE의 측정에 대한 특정 모노클로 날 항체를 규정하지 않는다는 것이다. 대안 항 IgE의 모노클로 날 항체는 내인성 면역 글로불린 분자를 검출하는 것으로 나타났다. 하이 브리 도마 클론 R1E4은하지 세포 친화 IgE 항체가 CD23 (21, 22)에 결합 만 내생 표면 분자에 특이적인 쥐 항 - 마우스 단일 클론의 IgE 항체를 생산하고 있지만 상업적으로 사용할 수 없습니다. 그것은 일반적인 실험실 reage를 사용하기 때문에 위에서 설명한 프로토콜은 편리하고 경제적이다국세청. 가능성이 여기에 사용되는 항 면역 글로불린 항체는 수용체 결합에 의한 세포 친화 IgE 항체에 대한 IgE 신호가 치료 후 감소하기 때문에, 트립신 매개 분열에 민감한 사이트에서 IgE 항체 (그림 2)에 결합한다. 이 프로토콜을 실행하는 실험 연구자 시판 클론의 범위에서 선택할 수있는 자유가 그러나. 더욱이, 세포 표면 단백질을 제거하기 위해 트립신을 사용하는 개념은 FACS 분석에 의해 다른 세포 마커의 검출에 확장 될 수있다.
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Acknowledgments
DRW는 NIH 보조금 AI089972과 AI113217,에 의해 점막 면역학 연구 팀에 의해 지원하고, 버로우즈 웰컴 기금 의료 과학자에 대한 경력 상을 보유하고있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
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