Introduction
Мышь обонятельный эпителий в полости носа состоит из 6-10 млн биполярных обонятельных сенсорных нейронов 1. Каждый обонятельный нейрон выбирает один из 1200 одоранта рецепторных генов для экспрессии. Обнаружение пахучих веществ начинается с одоранта связывания обонятельного рецептора 2, который затем активирует АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ типа III (ACIII) 3 с помощью обоняния специфического белка G Gα олф 4. В результате рост циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) открывает циклических нуклеотидов закрытого (CNG), неселективный катион канал, ведущий к притоку Ca 2+ и Na +, а впоследствии Ca 2+ приток приводит к открытию Са 2+ активированного Cl - канал 5,6. Полученный наружу Cl - поток способствует высокой внутриклеточной Cl - концентрация поддерживается устойчивый Cl - поглощение, вероятно, через Na + / K + / Cl - котранспортера NKCC1,Cl - / HCO 3 - теплообменник SLC4A1, и, возможно, дополнительные еще не определены перевозчики 6-8.
Биполярные обонятельные нейроны имеют одно-, неразветвленные аксоны, которые выступают непосредственно к обонятельной луковице, и дендриты, который проходит к поверхности эпителия и заканчивается в качестве специализированного отделения, дендритных ручки. С этой ручкой, 10-30 ресничек, которые могут достигать в длину до 50-60 мкм, исходят в слизи, покрывающей поверхности эпителия 9. Белки канонической каскада трансдукции сигнала в основном локализованы в мембране этих ресничек. Увеличился сенсорная поверхность эпителия усиливает способность обнаруживать отдушки. Из-за плотности сенсорных нейронов, реснички, проходящую от соседних дендритных ручки смешиваются. Это смешение приводит к случайной смеси ресничек из различных нейронов, экспрессирующих различные типы обонятельные рецепторы, на поверхности эпителия. Выявление и клетокулар распределение цилиарных белков, которые присутствуют только в подгруппе сенсорных нейронов поэтому трудно в криосрезов. Кроме того, точная локализация таких белков вдоль ресничек едва возможно, поскольку, как правило, криосрезы тоньше, чем средняя длина ресничек.
Чтобы включить расследование мерцательного локализации до сих пор не охарактеризованных мембранных белков в обонятельных нейронов, мы оптимизировали собственная методика подготовки лица, которая позволяет детальный анализ локализации белка в ресничками. Вкратце, мышь умерщвляют и глава разделена рядом с линии. Раковин, носа и лобной кости удаляют, чтобы обнажить перегородки. Перегородки с обонятельной части футеровки эпителия ослаблен за счет сокращения всех соединений в полость носа. После ввода перегородки в чашку Петри, заполненную раствором Рингера, эпителий отслаивают унд передается на предметное стекло с нанесенным покрытием. После короткого fixatионная шаг, Иммуноокрашивание процедуры могут быть выполнены, если обращение является как можно более плавными, чтобы избежать повреждения хрупкого ткани. Мы демонстрируем достижимое разрешение путем сравнения окраски двух различных мембранных белков в обонятельной ресничек в классических криосрезов и в ванной подготовки лица описаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были обработаны в Шарите или университетской клинике Йены в соответствии с немецкими законами по уходу за животными, избегая каких-либо необоснованных страданий животных.
1. Подготовка решения и Препарирование на рабочем месте
- Решения
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте следующие решения до начала вскрытия эпителия.- Решения для процедуры вскрытия:
- Подготовьте раствор Рингера (рН 7,4) с концентрацией 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, и 10 мМ глюкозы.
- Подготовка PBS - / - раствор (рН 7,4) с концентрацией 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH 2 PO 4, 136 мМ NaCl, и 8,1 мМ Na 2 HPO 4.
- Подготовьте фиксирующий раствор (рН 7,2) с концентрацией 1x PBS - / -, 0,2 мМ CaCl 2, 4% сахарозы, 4% параформальдегида. Сахарозы в закрепляющего раствора улучшает криосекционирования и пикап криосрезов. Хранить при -20 ° С.
- Решения для процедуры окрашивания
- Подготовьте PBS + / + решение с концентрацией 1x PBS - / -, 0,48 мМ MgCl 2, 0,9 мМ CaCl 2.
- Подготовка PBST + / + раствор с концентрацией 1X PBS + / + и 0,1% Triton X-100.
- Подготовьте блокирующий раствор с концентрацией 1x PBST + / + и 1% желатина.
- Решения для процедуры вскрытия:
- Рабочее место
- Для вскрытия рабочем месте, использовать рассекает микроскоп с яркого освещения, а также в виде жидкости-блокатор ручку.
- Подготовка Петри, наполненную раствором Рингера и клеевых стеклах.
- Получить следующие хирургические инструменты: пару хирургических ножниц с одним острым и одним тупым кончиком, пара пружинных ножниц с прямыми форме иглы, два пинцета с тонкой изогнутой формы наконечника и лезвием бритвы (
2. Подготовка носовой перегородки
- Дом животные в утвержденных клетках с регулярным доступом к пище и воде и соответствующего цикла день / ночь.
- Выполните анестезию в закрытый сосуд, содержащий марли, смоченной 100% изофлуран и монитора обезболивания путем тестирования задние рефлексы ног. Так смещения шейных позвонков может привести кровь в полости носа, непосредственно обезглавить наркотизированных мышей.
- Снимите кожу, чтобы выставить кость всего черепа и носа, и вытереть оставшуюся кровь и ткани тщательно с использованием бумажным полотенцем. Снимите нижнюю челюсть и передние зубы.
- Надрезать спинной кости носа с двух сторон в 1-2 мм Расстояние параллельно линии шва, чтобы отделить одну сторону перегородки (медиально) от верхней челюсти (в поперечном направлении). Сплит нос одного разреза. Если кости и остатки раковин все еще привязаны к перегородке, удалить их тщательно, чтобы разоблачить перегородку полностьюне касаясь его.
- Удалить спинной носовой кости, сдвинув мелкий изогнутый кончик пинцетом вдоль спинной стороне перегородки между перегородкой и носовой кости. Применить небольшое давление на кости, нажмите на нее и извлеките его.
- Чтобы обеспечить доступ к двум перегородки тканей, по одному от каждой полости, осторожно снимите верхнюю челюсть к другой стороне головы. При подготовке старых животных (Р> 28), снимите наконечник лобной кости, покрывающей обонятельных луковиц.
- Определить обонятельный эпителий его слегка желтого цвета (рис 1б). Граничащих эпителия дыхательных путей белый и показывает движение подвижных ресничек, которые можно увидеть под микроскопом рассекает. Сокращение вдоль границы между обонятельной и эпителия дыхательных путей с парой тонких весенних ножницами.
- Расширение вырезать и отделить перегородкой из брюшной подключения к сошника кости. Затем вырежьте вдоль границы между перегородкой и решетчатой пластинки из решетчатого Osе. Перегородки в настоящее время полностью изолирован от всех подключений к голове. Используйте режущие позиции, показанные на рисунке 1С.
3. Изоляция обонятельного эпителия для Иммуноокрашивание
- Поместите клейкую предметное стекло в чашку Петри, заполненную раствором Рингера. Поместите его на край чашки Петри, так что одна половина стакана состоит в раствор Рингера (фиг.1А).
- Используйте пинцет, чтобы аккуратно поместите решетчатой кости с обонятельного эпителия в чашке Петри. Поднимите его без захвата его пинцетом советы.
- Возьмите перпендикулярной пластинкой решетчатой кости с одним пинцетом и использовать второй осторожно удалите эпителия с одной стороны перегородки. Вставьте изогнутый кончик между перпендикулярной пластинкой и эпителия, чтобы очистить эпителий выключен.
- Будьте всегда уверены, чтобы определить ресничек сторону, в случае эпителия сальто в Soluti Рингерана. Если эпителий сальто, вряд ли можно определить ресничек сторону впоследствии. Главным образом, эпителий закатывает с мерцательной поверхности внутри.
- Сравните поступил форму ткани с режущими положениях, показанных на рис 1С. Возьмите эпителий в положении на границе и потяните ее на стекло. Не прикасайтесь к ресничек сторону пинцетом, чтобы избежать поражения ткани.
- Поверните перегородку и повторите процедуру с эпителием с другой стороны.
- Высушите стекле вокруг обеих частях обонятельного эпителия с бумажным полотенцем и окружить ткани с жидким блокатора пера.
- Закрепить ткань с 150 мкл фиксирующего раствора в течение 10 мин при комнатной температуре. Что касается стабильности и целостности реснички, используйте короткие сроки фиксации для различных тестируемых антител. В течение этих 10 мин ресничек являются фиксированными, но, вероятно, не вся эпителий тканей. Таким образом, непосредственная визуализировать под микроскопом, следующего за Sсодержащие процедуры. Тем не менее, фиксирующие время может меняться для отдельных антител.
4. Протокол окрашивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте ткани очень осторожно, чтобы сохранить ресничные структуры обонятельных сенсорных нейронов. Удалить решения с помощью пипетки. Не отбрасывайте растворы непосредственно на эпителий, как механические силы могут нарушить тонкую реснички. Выполните все шаги при комнатной температуре, если не указано иное.
- Снимите фиксирующий раствор и промыть 2 раза PBS + / +.
- Инкубируйте эпителий, по крайней мере, 1 часа с блокирующим раствором.
- Получают раствор первичного антитела путем растворения антитела в блокирующем растворе (1: 200 для антител, использованных в данном исследовании) и центрифуги в течение 5 мин при полной скорости, чтобы удалить любые осадки.
- Инкубируйте эпителия с раствором антител во влажной камере при 4 ° CO / N.
- Промыть эпителия с PBS + / + в течение 5 мин по меньшей мере, три раза.
- Получают раствор вторичного антитела путем растворения антитела в блокирующем растворе (1: 500) и центрифуги в течение 5 мин при полной скорости.
- Инкубируйте эпителия с вторичного раствора антител в течение 1 часа в темную камеру.
- Промыть эпителия с PBS + / + в течение 5 мин по меньшей мере, три раза.
- Удалить жидкость-блокатор при помощи лезвия бритвы или бумажным полотенцем. Промыть эпителия с дистиллированной водой в течение 5 с.
- Сохранение ткани в antifade монтажа реагента.
ПРИМЕЧАНИЕ: фоновой флуоресценции быстро возрастает в течение нескольких дней; Микроскопическое исследование не позднее, чем через 2 дня после встраивания в монтажную среду Поэтому рекомендуется. Особое внимание должно быть принято не выжать ткань при поиске правильного фокальной плоскости, так как это может привести к серьезному повреждению подготовки. Из-за вышедшего из фокуса флуоресценции, дальнейшее расследование с конфокальной микроскопии рекомендуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обонятельный эпителий фас препаратов может быть использован для исследования локализации белков в ресничками сенсорных нейронов, позволяя детальное исследование белков, локализация непонятно после анализа криосрезов. Эта проблема может быть проиллюстрировано в случае окрашивания для Kin из IRRE-подобный белок 2 (Kirrel2). Kirrel2 (также называемый Neph3) является членом иммуноглобулина (Ig) суперсемейства мембранных белков и функционирует как гомофильной белка адгезии. Было показано, играют важную роль в аксона для содействия в обонятельной системе, и быть выражена в подгруппе обонятельных нейронов в деятельности зависимым способом 10.
Иммуноокрашивание для Kirrel2 в типичном cryosection через обонятельный эпителий показал локализацию Kirrel2 в аксонов, Сома и дендриты (рис 2а). Все растворы готовили как описано выше для ванной способа приготовления лица. Хотя некоторые лabeling появляется в верхней части слоя, состоящего из дендритных ручки, локализация цилиарного оставалась неопределенной после анализа криосрезах. Некоторые нейроны выставлены окрашивание и вокруг их обонятельной ручки, но единичные реснички было трудно определить. В отличие от этого, ан подготовки лица на обонятельный эпителий, выполняемой в соответствии с описанным выше протоколом однозначно показали, цилиарное локализацию Kirrel2 (фиг.2В). Интересно, что было высказано Kirrel2 только в ресничек относительно небольшой подгруппе обонятельные нейроны, хотя анализ окрашенных криосрезах показали экспрессию в гораздо больший процент нейронов. Кроме того, ванная подготовка лицо не только продемонстрировать окрашивание ресничек в целом, но и показали, изменения в паттернах экспрессии ресничек, начиная от нейронов с долгих ресничек нейронов всего за несколько коротких ресничек. В некоторых клетках, Kirrel2 был обнаружен в дендритной ручки, но не в ресничек, выступающих из этой ручки. C AUSE и функциональный актуальность этого вывода еще предстоит выяснить, но он иллюстрирует потенциал собственной подготовки лица, чтобы обеспечить новому взглянуть на локализации белков в обонятельной системе.
Кроме того, мы провели иммуногистохимическое обонятельной рецептора Мор-например, который проявляет выражение сильный ресничек 11. Рецептор уже четко идентифицировать в цилиарной слоя в криосрезов (рис 3А). Тем не менее, анализ детальных характеристик, таких как количество ресничек на ручке или длины индивидуальной ресничек невозможно. Использование собственной подготовку лица, определение ресничек от нейронов, выражающих обонятельный рецептор легко можно (рис 3б, в). Ru ПОДГОТОВКА лицо может быть выполнена с животными разных возрастов. Даже реснички от пренатальной животных были успешно окрашены и визуализировать (рис 3D).
Содержание "> фас препаратов, следовательно, представляют собой инструмент хорошо подходит для анализа цилиарной морфологию и локализацию известных цилиарных белков подробно.
Рисунок 1. Подготовка руководителя мыши. () Организация рассечение рабочем месте. Чашки Петри заполнена раствором Рингера и имеет клейкую предметное стекло. Хирургические инструменты, рекомендуются для приготовления ен лица. (В) После удаления половину головы мыши, перегородка обнажена. Перегородка покрыта обонятельный эпителий (OE) и респираторного эпителия (RE). OB: обонятельная луковица, В:. Вомероназальный орган (C) Для выделения части перегородки выложены обонятельного эпителия, вырезать перегородку вдоль продемонстрировали линий с парой тонких ножниц. с: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Сравнение Kirrel2 иммуноокрашивания в криосрезов и анфас препаратов. () Конфокальной изображение (максимальный выступ) послеродовой день 60 (P60) cryosection иммуноокрашиванию для Kirrel2 показывает локализацию белка в обонятельных сенсорных нейронов. Холост обонятельные ручки показывают сильное окрашивание и Kirrel2 локализация в ресничками предполагается (звездочка), но неопределенным. (B) конфокальной изображение (максимальная проекция) в P65 обонятельного эпителия Ru ПОДГОТОВКА лицо имеет четкое окрашивание Kirrel2 в ресничками подмножества обонятельных сенсорных нейронов , (Масштаб баров, 10 мкм)9 / 52299fig2large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Сравнение Мор-EG иммуноокрашивания в криосрезов и анфас препаратов. () Конфокальной изображение (максимальный выступ) из P60 cryosection иммуноокрашиванию для обонятельной рецептора Мор-EG. Локализация Мерцательная уже обнаружено. (B) конфокальной образ P65 Ru ПОДГОТОВКА лица иммуноокрашиванию для обонятельной рецептора Мор-EG. Мор-EG сильно выражено в ресничками подмножества обонятельных сенсорных нейронов. В отличие от криосрезах, реснички характеристики в отношении длины, количество ресничек на ручку точной локализации и белок может быть проанализирована. (С) более высокое увеличение в штучной упаковке в области (В). (D) Confocаль образ эмбриональный день 18 (E18) EN подготовки лица иммуноокрашиванию для обонятельной рецептора Мор-EG. Окрашивание ресниц можно ясно увидеть. (масштаб баров, 10 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P.
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
