Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) er en kraftfuld optisk billeddannelse teknik, der har gjort det muligt visualisering, overvågning og kvantificering af forskellige biologiske begivenheder i realtid og i levende dyr. Denne teknologi har i høj grad avancerede vores forståelse af fysiologiske processer og patogen-medierede fænomener i specifikke organer.
I denne undersøgelse er IVM påføres muselever og protokoller er designet til at afbilde in vivo kredsløbssystemet af leveren og måle røde blodlegemer (RBC) hastighed i individuelle hepatiske fartøjer. At visualisere de forskellige fartøj undertyper, der karakteriserer den hepatiske orgel og udfører blodgennemstrømning hastighedsmålinger, er C57BL / 6-mus injiceret intravenøst med en fluorescerende plasma reagens, som mærker leveren vaskulatur. IVM muliggør in vivo, realtid, måling af RBC hastighed i et bestemt fartøj af interesse. Etablering af denne metode vil gøre det muligt atundersøge lever- hæmodynamik under fysiologiske og patologiske tilstande. I sidste ende vil dette imaging-metode være vigtig for at studere indflydelsen af L. donovani infektion på hepatiske hæmodynamik.
Denne metode kan anvendes på andre infektiøse modeller og museorganer og kunne forlænges yderligere præklinisk afprøvning af et lægemiddels virkning på inflammation ved at kvantificere dets virkning på blodgennemstrømningen.
Introduction
Organspecifikke hæmodynamik er vigtige fysiologiske funktioner i enhver mammal organ. Abnormaliteter i blodstrømmen kan være konsekvensen af inflammation og et tegn på organdysfunktion 1. Således blodgennemstrømning organisation, struktur og funktion vises som kritiske parametre til analyse under fysiologiske og patologiske tilstande. De teknikker, der har været almindeligt anvendt til analyse af blodgennemstrømning i et bestemt organ indeholde flere begrænsninger, herunder opløsning grænse for selve teknikken (f.eks Doppler-billeddannelse af blodgennemstrømning), kapaciteten til måling af absolut blodgennemstrømning kun (volumen af blod pr enhed betjener et organ) (f.eks Optical Sammenhæng tomografi) og målingen af gennemsnitlige ændringer i hastighed i en stor og heterogen population af blodkar 2,3. Leveren er kredsløbssygdomme forbinder forskellige fartøj undertyper, der er heterogene i deres størrelse, struktur og funktion. Idenne undersøgelse intravital mikroskopi (IVM) imaging-teknologi anvendes til at evaluere lever hæmodynamik in vivo, i realtid, ved høj opløsning og parallelt at afdække de egenskaber ved de enkelte blodkar, der omfatter den hepatiske organ. Den seneste udvikling i denne kraftfulde optiske imaging teknik gør det muligt for forskeren at indsamle dynamiske data om levende dyr på en høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Ved at lade den direkte visualisering og real time overvågning af specifikke og hurtige biologiske processer in vivo, IVM giver en unik mulighed for at forskeren til billedet individuelle blodkar, og måle og kvantificere hastigheden af enkelte røde blodlegemer (RBC) inden for et specifikt udvalgt hepatisk fartøj.
I denne undersøgelse har vi implementeret den IVM teknik i muselever at undersøge indflydelsen af muse infektion med hepatotropisk Leishmania-parasitten på leveren hæmodynamik. L. donovanier agent ansvarlig for visceral leishmaniasis, en alvorlig sygdom kendetegnet ved akutte mod kroniske inflammatoriske responser og en patologi, der er til stede i multiple organer, herunder milten og leveren. I en eksperimentel musemodel af visceral leishmaniasis, leveren infektion er selvstændig løsning henviser miltcentret infektion er progressiv 4. Disse resultater af Leishmania-infektion i forhold til de enkelte organer er stadig ikke helt forstået. Undersøgelse af lever og milt hæmodynamik under patologiske tilstande vil kaste nyt lys over vært-parasit interaktioner og sygdom patogenese.
Vores eksperimentelle model er baseret på at udsætte og billeddannelse leveren af en bedøvet mus, der fik intravenøs injektion af specifikke fluorescerende farvestoffer til mærkning af den hepatiske intravasculature. Leveren er et gunstigt organ for intra-vital mikroskopi. Efter at have udført en lille incision i maven, er leveren blidt eksternaliseres og placeres på våd gaze, derefter et dækglas med det mål at reducere eventuelle bevægelsesartefakter grundet hjerteslag og åndedræt. Leveren placeres derefter inden visningen af et mikroskop linse. Sammenlignet med milt og lymfeknude, som kræver brug af to foton mikroskopi for IVM undersøgelser, fordelen af leveren ligger i dens homogen 3D arkitektur / anatomi, der tillader anvendelse af en konventionel konfokal mikroskop med en maksimal indtrængningsdybde ca. 50 um, for intravital mikroskopi billeddannelse 5-8.
Denne undersøgelse beskriver to uafhængige billeddannende metoder til kvantitativ måling af RBC hastighed og blodgennemstrømning hastighed i de enkelte blodkar. Ved den første metode, er levergennemblødning erhvervet ved anvendelse af en xy bi-dimensional tilstand over tid. De resulterende XYT data analyseres ved hjælp af MtrackJ plugin i det frie ImageJ software, som muliggør sporing af individual RBC over tid. Ved den anden metode anvendes en enkelt blodkar udvalgt og dets tilsvarende blodgennemstrømning er analyseret ved anvendelse af linieskanning hurtig dataopsamling af konfokal laser-scanning-mikroskop. Fartøjet af interesse scannet ved høj frekvens langs dens centrale akse gennem en aksial linie. Blodet strømningshastighed kvantificeres derefter baseret på forskellen i kontrast mellem umærkede mørke erythrocytter og fluorescensmærket plasma. Fluorescensintensiteterne af RBC'er og plasma erhvervet langs linien scanning afsættes mod tiden til opnåelse af striber, vinklerne af hvilke er proportionale med hastigheder af en individuel RBC.
Målet med denne artikel er at give en enkel og reproducerbar metode til billedbehandling og måle blodgennemstrømning hastighed inden for de enkelte blodkar i leveren og til at stille de grundlæggende værktøjer for en vellykket udførelse af mus kirurgi, IVM og kvantitative analyser af hastigheden af individuelle RBC. Thans tilgang vil give forskerne at få ny indsigt i blod hastighed under patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og protokoller, der blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Aix-Marseille Université, Frankrig. Female C57BI / 6 mus på 8-10 uger blev kommercielt fremstilles og håndteres i overensstemmelse med reglerne i dekret nr 8 87-848 19. oktober, 1987, Paris. Alle eksperimenter under anvendelse af L. donovani LD1S parasitter blev gennemført i overensstemmelse med biosikkerhed regler fra det franske og EU-lovgivning.
1. Mus Infektion med L. donovani Promastigote Parasitter
- Forbered dyrkningsmediet til in vitro opretholdelse af L. donovani promastigote parasitter, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Bruge M199-medium. Supplere M199-medium med 10% føtalt kalveserum (varmeinaktiveret ved 56 ° C i 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO3, 1 mM glutamine, RPMI 16040 vitamin mix, 10 mM folinsyre, 100 mM adenosin, 7,6 mM hemin, 50 U / ml penicillin og 50 mg / ml streptomycin.
- Kultur LD1S parasitter i 10 ml komplet M199-medium ved 26 ° C i en 25 cm2 kolbe ventileret.
- Ved hjælp af successive differentialcentrifugering trin, udarbejde en befolkning på promastigote parasitter, der er beriget med metacyclic former.
- Høste en mid-log-fase parasit kultur. Regne med en hemocytomer. Resuspender 5 x 10 5 parasitter / ml i 10 ml komplet M199-medium. Grow parasitten kultur i anaerobe betingelser, indtil de når den sene stationære fase (i ca. 5-6 dage).
- Spin LD1S kulturen ved 1.200 xg i 10 minutter ved 26 ° C for at pelletere ikke-metacyclic parasitter, genvinde supernatanten og spin det igen ved 2500 xg ved 26 ° C i 10 min.
Bemærk: Denne endelige pellet højt beriget i metacyclic promastigote parasitter. - Pellet resuspenderes i 100 pi PBS. Fjerne en lille portion til fiksering med 25% glutaraldehyd 1/100 v: v og tælle parasitter ved hjælp af et hæmocytometer.
- Fortynd det berigede-metacyclic parasit befolkning til 1 x 10 7/100 pi i PBS. Injicer parasitten suspension i halevenen af en bedøvet mus (se nedenfor) under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 30 G nål. For kontroldyr, injiceres 100 pi PBS i halevenen.
2. Kirurgiske Procedurer
- Desinficere arbejdsplads med et biocid desinficerende spray og alle de kirurgiske instrumenter med 70% ethanol i 30 min.
- Forberede en bedøvende opløsning, efter vægten af dyret, der indeholdt 125 mg / kg Ketamin og 12,5 mg / kg xylazin fortyndet i PBS.
- Musen veje og intraperitonealt injicere den passende dosis af bedøvelsesmiddel under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 30 G nål.
- Hold musen varm og kontrollere, at musen er helt anesthetized ved at klemme foden pad, før du fortsætter. Re-indsprøjte en halv dosis af den bedøvende opløsning i musen hver 60 min.
- Barbere musens mave, og rengør den med Vetedine. Lave et lille snit i huden og muskulaturen under brystkassen på venstre side af maven.
- Læg et stykke fugtig gaze på maven lige under den åbnede område. Expose leveren og placere den på gaze. Læg et stykke fugtig gaze over leveren.
- Placer en 24 x 60 mm 2 og 150 um tyk dækglas, cyanoacrylat-bundet til en metalramme, på leveren til visualisering under et mikroskop.
- Beskytte øjnene af musen med en våd gaze.
- Efter billeddannelse session, aflive bedøvet dyr ved cervikal dislokation.
3. Intravital Microscopy Imaging af Liver Architecture
- Udføre de intravital mikroskopi eksperimenter på et omvendt konfokal mikroskop udstyret medhermostatic kontrolleret kammer, et apokromatiske 63X olie glycerol nedsænkning mål (NA 1.4), Argon (488 nm) og HeNe (543 nm, 633 nm) lasere og en blå diode (405 nm).
- Placer musen på scenen af mikroskopet med dækglas dækker leveren forsiden nedad på målsætningen. Indstil temperaturen i kammeret til 29 ° C. Justere fokus med en lever autofluorescens at muliggøre visualisering af sinusoider.
- At visualisere vaskulaturen fremstilles en opløsning af 500 ug BSA-Alexa 647 fortyndet i 100 pi PBS, for hver mus. Injiceres opløsningen intravenøst i halevenen af den bedøvede mus ved anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 30 G nål.
- At visualisere levercelle kerner, forberede en opløsning af Hoechst 33342 i PBS. Injicere denne opløsning ved 8 mg / kg af mus intraperitonealt under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 30 G nål.
- Bruge den normale sekventielle tilstand, 63X nedsænkning objektiv og scanneren ved 400 Hz til billedet den hepatiskecellekerner og lever vaskulatur. Tænd for 405 nm blå diode for Hoechst excitation og 633 nm laser til BSA-Alexa 647 excitation. Tænd for Argon 488 nm laser og definere en stor erhvervelse band at visualisere leveren autofluorescens.
4. Intravital Microscopy Imaging af leveren for Blood Flow Speed Måling
- Åbn LAS software af mikroskopet (LAS-AF fremviser Version 3.1.0 build 8587). Vælg resonans scanner-tilstand, når du åbner mikroskop software.
- Klik på fanen konfiguration for at indstille hardware. Klik på laser og vælg HeNe 633 laser. Klik på Indstillinger, og vælg 12 bit opløsning.
- Klik på menuen overtagelsen. I pathway indstillingsvinduet bjælken Vælg målet 63X og opsætte 633 laser magt til 100%. Aktiver signal vinde og off indstillede parametre ved at vælge Alexa-633 fra PM1-3 drop down menuen.
- På fanen erhverve, vælge 'XYT' købtilstand. Indstil format bredde ved 1.024 x 1.024. Vælg hastighed ved 8.000 Hz. Vælg den pinhole af 3 Airy enheder. Vælg en zoom-faktor på 3. Vælg ikke den tovejs tilstand.
5. Kvantitativ analyse af RBC Velocity Brug af XYT Images (fremgangsmåde 1)
- Klik på "Live" ikonet for at visualisere blodgennemstrømningen på en live-mode. Vælge det område af interesse og vælg bestemt blodkar til analyse. Indstil fartøj af interesse for vandret position ved at justere "X", "Y" og scan felt rotation koordinater på USB kontrolpanel.
- Stop "Live" -mode, når skibet af interesse er indstillet. Ændre formatet sæt bredden til 1.024 x 256 i købet tilstand indstilling vindue, line gennemsnit = 1, frame gennemsnit = 1, skal du vælge "stakke" 150. Klik på 'start' for at erhverve billeder.
- Til kvantitativ analyse af RBC hastighed ved hjælp af "XYT" billeder åbner ImageJ software. Vælg 'Filer'fane i ImageJ, klik på "Åbn" og derefter vælge den fil af interesse.
- Gå til "plugin" menuen i ImageJ Vælg loci og Bio-formater importerer indstillinger. I dette vindue skal du vælge stakken visning parametre som "hyperstack«. I stakken For indstillingen, skal du vælge "xyzct". Bemærk: Dette åbner et vindue med alle de række opkøb.
- Klik på 'Plugins' på menuen ImageJ og vælg MTrackJ mulighed. Klik på ikonet "add" på det lille vindue og klik på RBC at spore. Klik på den samme RBC i hvert af de følgende ramme og klik på ikonet »foranstaltning« for at måle hastigheden.
Bemærk: Filen genereres kan gemmes i .exl format. - Spor mindst fem røde blodlegemer pr skib og analysere mindst tre individuelle fartøjer af samme størrelse.
6. Kvantitativ analyse af RBC Velocity Brug af xt Linje-billeder (metode 2)
- Klik på "Live" for at visualisere blodet flav i levende tilstand. Vælg en bestemt blodkar til analyse. Indstil fartøj af interesse for vandret position. Stop "Live" -mode, når skibet af interesse er indstillet.
- Vælg "XT" scanning mode og indstil centrale lumen for den valgte fartøj langs linjen scanning. Set format bredde ved 1.024 x 512, hastighed = 8,000Hz, line gennemsnit = 32, tid = 512. Klik på 'start' og erhverve de xt line billeder.
- Generer striber til kvantitativ analyse af RBC hastighed ved at åbne .lif filen og åbne xt line billede af interesse. I LAS-AF-software, skal du vælge "eksperimenter", skal du åbne .lif og vælg billedet. Bemærk: Det vil automatisk åbne en kymograph.
- Måle tiden (t, fås på Y-aksen), der kræves for en partikel streak (viser mørke refleksion) til at rejse en vis afstand (d, opnået på X-aksen) på denne kymograph. Vælg værktøjet "tegne line" og trække en linje vandret til streak. Bemærk afstanden ium, og den tid i sekunder, der genereres i fanen resultat ved bunden af billedet.
- Beregn hastighed som V = afstand / tid ved hjælp af de værdier, der opnås fra kymograph.
- Kvantificere mindst fem partikler striber pr xt image og mindst tre individuelle fartøjer af samme størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den specifikke arkitektoniske organisering af sinusoiderne i leveren kan visualiseres baseret på autofluorescerende egenskaben af dette organ (figur 1, felt B og C, grøn), intraperitoneal injektion af Hoechst for mærkning af hepatocyt kerner (figur 1B, blå) og intravenøs injektion af fluorescerende BSA til farvning af hepatiske kredsløb (figur 1C, rød). Leveren er sammensat af flere forskellige undertyper fartøj med forskellige funktioner og strukturer og størrelser lige fra 40 til 700 um 2 i diameter (D) (D i små kar er mellem 40-80 um 2 og D i store kar er over 300 um 2 ). Intravital mikroskopi billeddannelse af leveren muliggør visualisering ved høj opløsning af heterogenitet og kompleksitet af leveren vaskulatur (figur 1C).
For at overvåge blodgennemstrømningen hastighed i individuelle Vessels, er to forskellige metoder, der anvendes til erhvervelse og data billedanalyse af leveren blodkar in vivo. I den første metode, er real-time billeder af blodgennemstrømningen i et kar af interesse udføres ved hjælp af XYT scanningsfunktion (Movie 1). Kvantitativ analyse af hastigheden af en individuel RBC i en enkelt beholder udføres ved hjælp af MTrackJ plugin i ImageJ software (figur 2A og 2B). Mindst fem partikler pr fartøj spores i forskellige fartøjer, der spænder fra 40 til 80 um 2 i diameter. De opnåede resultater med denne metode giver ensartede og reproducerbare værdier på tværs af forskellige mus og evaluere RBC hastighed i små lever beholdere ved værdier mellem 25-35 um / sek (figur 2C).
Den anden metode består af gentagne scanning langs en linie parallelt med karvæggen, med den linje placeret i midten af karhulrummet.Figur 3 viser en xy ramme scanning (venstre paneler) med den tilsvarende xt linjescanning (højre paneler). Hastigheden af en individuel RBC er givet ved forholdet V = distance / tid og beregnes ved hjælp af retvinklede projektioner på X- og Y-aksen i streak opnået i xt billedet. I figur 3D og 3E, hvert datapunkt repræsenterer hastigheden af en individuel RBC fra forskellige små eller store fartøjer valgt blandt forskellige mus. Set fra fejlsøjlerne viser dataene en relativt lav variation mellem RBC hastigheder og viser, at blodgennemstrømningen hastighed er dramatisk hurtigere i store skibe end i små kar. Desuden blev en betydelig variation i hastighed, der opnås fra forskellige typer af store skibe observeret hvorimod blodgennemstrømningen hastighed er forholdsvis ens på tværs af forskellige typer af små fartøjer. Blood flow målinger med denne nyere metode genererer data, der kan sammenlignes med data fra de tidligere beskriverd metode under anvendelse MTrackJ (sammenlign figur 2C til fig 3D). Billedet i figur 3C repræsenterer et typisk eksempel på en suboptimal eksperiment, hvor xy ramme scanning frembringer en un-fortolkelige xt billede. I dette særlige tilfælde, at problemet skyldes både i) den hurtige internalisering af BSA i endotelceller foring fartøj af interesse, og ii) tilstedeværelsen af en samling mellem to skibe, der forstyrrer blodgennemstrømningen i det valgte område overtagelsestidspunktet. Hastigheden for internaliseringen af plasmaet reagens i endothelet foring blodkar er en kritisk parameter til at overveje, når blodgennemstrømningen hastighed måling, som internalisering vil ændre kvaliteten af det billede, der xt viser striber. Internalisering sats kritisk afhænger af den dosis af farvestoffet, der er injiceret intravenøst. I figur 4 viser vi, at 500 ug BSA-Alexa 647 og / eller 500 kDa dextran-FITC er de optimale doser, Should anvendes til kvantificering af blodgennemstrømning hastighed. Disse doser generere en meget lys signal, der giver mulighed for identifikation af RBC som mørke partikler mod en lys baggrund og muliggøre visualisering af blodstrømning i mindst 1 time, uden internalisering af det injicerede farvestof (figur 4, nederste panel). I modsætning hertil 50 ug BSA-Alexa 647 og / eller 500 kDa Dextran-FITC (ikke vist), samtidig med at visualisering af leveren vaskulære netværk, er en suboptimal dosis til måling af blodgennemstrømning hastighed på grund af den meget hurtige internalisering af farvestoffet, som starter ved 5 min efter injektion (figur 4, nederste panel).
Anvendes denne metode til leveren af inficerede dyr, observerede vi en signifikant stigning i blodets strømningshastighed, så snart 1 time efter infektion. Ændring af RBC hastighed opretholdes op til 24 timer efter infektion. Det i sidste ende når normale værdierved 72 timer efter parasitten injektion (figur 5). Således dette eksperiment validerer brugen af denne metode til at få ny indsigt i den indflydelse, patologiske tilstande på leveren hæmodynamik.
Figur 1: Intravital Mikroskopi af muselever (A) Lever kirurgi på musen.. Et lille område af en lever lap er eksponeret efter operationen, er to fugtige gaze stykker placeret omkring det og et objektglas er lagt på maven for at dække leveren før musen anbringes på scenen af et konfokalt mikroskop. (B, C) Billede af et repræsentativt område af leveren af et ikke-inficeret mus, der viser leveren sinusoider og de forskellige størrelser af fartøjer, der udgør den hepatiske organ. Lever autofluorescens er vist med grønt. Musen er injiceret med Hoechst 33342 (blå) til at mærke hepatocyte kerner (B) og injiceret med BSA-Alexa 647 (rød) til at visualisere leveren vaskulatur (C). Scale barer, 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Kvantitativ analyse af RBC Velocity fra en xy Frame Scan ved hjælp af ImageJ Software (A) Repræsentant xy billede af blodcirkulationen i en lille lever fartøj erhvervet af intravital mikroskopi imaging af musen leveren ved hjælp af den hurtige xy scanningsfunktion. Mørke områder svarer til RBC. Scale bar, 10 um. (B) Kvantificering af hastigheden af en enkelt RBC hjælp af MTrackJ plugin fra ImageJ. Lines (rød, gul, hvid) repræsenterer bane over tid af en individuel RBC. (C) RBC hastighed i de enkelte smalle (D er ca. 50 um 2) hepatiske fartøjer. Grafen afbilder værdien af hastigheden af fem uafhængige RBC'er sporet i individuelle leveren fartøjer, der blev udvalgt fra fem forskellige mus (1 til 5). D er diameteren af karret i um 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Lever Blood Flow Målinger af Intravital Microscopy Imaging af et blodkar ved hjælp af xt linje Scanning mode Repræsentative xy billeder (venstre paneler) af leveren fartøjer mærket med BSA-Alexa 647 og deres tilsvarende XT billeder (højre paneler) opnået fra en. line-scanning af den centrale lumen af det enkelte fartøj. (A, B) Små (A) og storeliver beholder (B). (C) Repræsentative data fra en sub-optimal eksperiment viser skæringspunktet mellem to blodkar og BSA internalisering i endotel. (D, E) Graferne plotte værdien af hastigheden af tre uafhængige RBC pr fartøj (små i D og store i E) udvalgt blandt fem forskellige mus. D er diameteren af karret i um 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Effekten af dosen af det fluorescerende Plasma Dye på Dens Internalisering i endothelet Lining sinusoider Dette billede sporer internaliseringen af BSA og Dextran 500 kDa i endothelet foring sinusoider, som en funktion af tid og dosis injektion.Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Virkning af L. donovani infektion på Lever Hæmodynamik. Denne graf plots værdierne i blodet hastighed fås fra flere individuelle blodkar fra ikke-inficerede mus (NI) og mus, som blev inficeret med L. donovani og analyseret 1 time, 24 timer og 72 timer efter infektion (pi). Hver prik repræsenterer gennemsnitsværdien af fem RBC hastighedsmålinger fremstillet i et enkelt blodkar på ca. 50 um 2. I hver tilstand (NI, 1 time pi, 24 hr pi og 72 timer pi) mindst tre mus blev analyseret for blodgennemstrømning hastighed. Stjernerne angiver en signifikant forskel i blodgennemstrømningen hastighed opnået 1 time og 24 timer pi forhold til NI-mus (P <0,01, envejs-ANOVA).
Film 1. Time-lapse Intravital mikroskopi Imaging af muselever. Movie 1 svarer til figur 3. Musen modtog en injektion af BSA-Alexa 647 at visualisere vaskulaturen. Blodgennemstrømningen i tre små fartøjer (d af 50 um 2) er vist. Sorte områder svarer til RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den seneste udvikling i intravital mikroskopi af musen leveren åbner nye muligheder for undersøgelse af fysiologiske respons på infektion in vivo og i realtid 5,9,10. Orgel blodgennemstrømning er en kritisk fysiologisk parameter, der ofte ændres i mange sygdomme. Men status for leveren hæmodynamik under fysiologiske og infektiøse tilstande er stadig et dårligt udforsket område. I denne undersøgelse IVM-baserede metoder, som tidligere var tilpasset til undersøgelse af milten og tumorvaskulatur, blev gennemført for at kvantificere levergennemblødning hastighed inden en enkelt beholder og måle individuel RBC hastighed in vivo 11,12. De metoder, der anvendes her stole på kontrasten mellem et plasma fluorophor intravenøst i musen, såsom fluorescerende BSA, og erythrocytterne, der forbliver mørke. In vivo blod flowmålinger har potentiale til at forbedre vores forståelse af sygdom proprocesser.
Her blev to metoder anvendt og sammenlignet med måle blodgennemstrømning i leveren fartøjer. Den første metode er tidskrævende og kræsen på sigt af dataanalyse, da det kræver, at brugerne manuelt at spore RBC bevægelse i det enkelte fartøj ved hjælp af MTrackJ plugin i ImageJ software. Den anden metode er enkel og hurtig, da det består af en analyse af et xt billede af et blodkar genereret fra en scanning erhvervelse linje med resonant scannerfunktionen. De to metoder giver sammenlignelige data for lignende fartøjer. På dette stadium er det næsten umuligt at sammenligne vores data med andre, som, så vidt vi ved, blodgennemstrømning hastighed er aldrig blevet kvantificeret i så små fartøjer og i muse-sinusoiden kapillærer med en bredde på ca. 10 um. IVM-baserede metoder tillader høj opløsning i xy 500 nm muliggør analysen af en sinusoid med en bredde på 10-50 um 13. I modsætning hertil kun Doppler-baserede teknikker har en maksimal resolution på 70 um, hvilket begrænser målingen af blodtilførslen til leveren arterier og vener portal 3.
En af de vigtigste skridt, der er afgørende for en vellykket gennemførelse af disse metoder er en vellykket operation og vedligeholdelse af den bedøvede mus i god fysiologisk tilstand under hele imaging session. At gøre det, må man omhyggeligt kontrollere temperaturen af mikroskopet kammeret og indsprøjte bedøvelsesmiddel hver time. Et andet afgørende skridt er internalisering af det fluorescerende plasma reagens i endothelium foring, der kan forekomme naturligt efter dets injektion. Sådan internalisering vil producere ufortolkelige XT billeder og un-kontrast xy billeder. Dette fænomen afhænger af den dosis af det injicerede farvestof og kan forebygges ved at indsprøjte en høj dosis af plasmaet reagens (figur 4).
Vigtigere, vellykket intravital mikroskopi billeddannelse af leveren blodgennemstrømningen kræver the overvejelse af flere kritiske aspekter. Heriblandt kompleksiteten af leveren vaskulatur systemet, tilstedeværelsen af forskellige undertyper af blodkar, der indeholder små og store fartøjer med forskellige strukturer og funktioner, forskellige blodkredsløbet med hurtig og langsom flux og hurtige RBC hastigheder. Den væsentligste begrænsning af metoden, der er baseret på en analyse af en xt billedet er hastigheden af erhvervelsen af fartøjet og manglen på Z resolution, som billedet er erhvervet i 3D (XYT). Mere specifikt den linje scan satser standardsystemer nå en grænse på følsomhed med hensyn til køb af store blodkar (diameter over 180 um 2), der er karakteriseret ved meget høje RBC hastigheder, hvilket er tilfældet med arterier. I den store beholder, kan RBC bane være ude af det afbildede fly og eventuelle komponenter, som er vinkelret på det scannede flyet vil blive udelukket fra analysen.
Den metode præsenteret here udgør et ideelt værktøj til in vivo og tidstro kvantificering af adskillige blodgennemstrømning parametre under forskellige patologiske tilstande. Undersøgelsen af leveren hæmodynamik vil kaste nyt lys på sygdomsprocesser og parasit patogenese i et bestemt organ. Vores bestræbelser på at få indblik i leveren mikrovaskulaturen system anvendt på en eksperimentel musemodel for Leishmania-infektion åbner mulighed for korrelation af flere blod strømningsparametre med parasit multiplikation og sygdomsudvikling i dette organ, i realtid. Videreudviklingen af reagenser, redskaber og metoden for den forbedrede karakterisering af leveren vaskulatur system ved IVM under infektion er af stor betydning for undersøgelsen af indflydelsen af parasit kolonisering på denne fysiologiske parameter og, gensidigt, påvirkning af blod strømme videre Leishmania patogenese. Denne strategi kan potentielt udvides til andre smitsommesystemer, hvor patogener målretter leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af INSERM, University of Aix-Marseille og en Karriereudvikling pris fra HFSPO opnået ved CL Forestier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
