Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
La retinitis pigmentosa (RP) es un trastorno hereditario que causa la pérdida generalizada de los fotorreceptores, que son las células en la capa más externa de la retina responsable de la transducción de la luz, en forma de fotones, en la actividad neural. Es importante destacar que, los pacientes con RP tienen típicamente neuronas residuales en las otras capas de la retina que todavía son funcionales. Prótesis de retina son capaces de restaurar algo de visión limitada a estos pacientes por la orientación de estas neuronas supervivientes con estimulación eléctrica para activar su 1,2 vía visual. Resultados de percepción de los ensayos clínicos han mostrado resultados iniciales prometedores y recientemente algunos dispositivos han sido aprobados para su uso comercial. Actualmente, hay tres principales localizaciones anatómicas en el que las prótesis de la retina clínicos se han posicionado epiretinally: 3,4, 5,6 y subretinally suprachoroidally 7,8. Diferentes dispositivos utilizan diferentes materiales y su forma es personalizadoa la ubicación en la que se implantan. Sin embargo, todos ellos crean percepciones visuales mediante la activación de las neuronas residuales de la retina con impulsos eléctricos.
Existe el potencial para cualquier prótesis médica para dañar el tejido circundante debido a los efectos mecánicos de la colocación inicial o fuerzas en curso posteriores. En el caso de estimuladores implantables, tales como prótesis de la retina, está la consideración adicional de que los parámetros eléctricos deben estar dentro de los límites de seguridad. La seguridad del paciente es de suma importancia, por lo que los dispositivos deben ser rigurosamente en estudios preclínicos antes de avanzar a establecer una clínica 9-15. En nuestro compañero artículo, se describe un método para evaluar la histopatología localizada del ojo que rodea a un implante colocado en el espacio supracoroidal 16. En el presente manuscrito, se describe una técnica para la visualización de tejido del ojo que rodea una matriz de electrodos viró a la retina epiretinally, en un preclínica (Femodelo de línea) (Figura 1).
La ubicación epirretiniana es la posición más comúnmente utilizado para la localización de una prótesis visual. Conjuntos de electrodos situados aquí suelen colocarse en la retina con una tachuela de metal que penetra en todas las capas del ojo 17-20. Antes de las técnicas descritas en el presente manuscrito, era difícil evaluar con precisión la retina y otros tejidos que rodean una tachuela. La fijación del ojo estándar utilizando formalina tamponada neutra dio lugar a daño en la retina de artefactos debido al movimiento diferencial de la retina y la esclerótica en contra de la punta de la tachuela fijo. Por lo tanto cualquier daño real causado por la pegajosidad y la matriz epirretiniana no se pudo observar con precisión. Además, seccionar el tejido ocular no pudo realizarse con el puño de amura de la retina in situ como objetos de metal no se pueden cortar fácilmente con aparatos histológico tradicional; la eliminación de la pegajosidad antes del procesamiento histológico fue tambiénindeseable ya que esto también llevó a daño en la retina artefactos.
El objetivo del presente estudio fue doble: 1) para reducir el artefacto desprendimiento de retina por lo que los daños causados por la adherencia y la matriz de implante epiretinal se puede evaluar de forma fiable; y 2) para visualizar la arquitectura de la retina adyacente a la pegajosidad sin eliminarlo. A fin de lograr objetivo 1, se utilizó una nueva técnica de fijación (como se describe en el artículo de compañía 16), lo que reduce la deslaminación de la retina artefactual. A fin de lograr objetivo 2, modificamos una incrustación, molienda y pulido técnica, desarrollado originalmente para la observación in situ de electrodos de implantes cocleares 21-23. Los métodos descritos en este manuscrito permiten la visualización de la retina circundante y adyacente a una tachuela in situ mientras se minimiza el daño de la retina artefactual y por lo tanto permite una evaluación precisa de cualquier daño potencial causado por el puño de amura y la matriz epirretiniana.
Técnicas histológicas estándar son incapaces de procesar los implantes de metal duro in situ debido a las limitaciones en cortar estos objetos de metal, vidrio o incluso discos de diamante. En nuestro documento complementario 16, se demostró que el uso de una técnica de fijación de ojos conjunto modificado podría reducir la delaminación retina artefactos. En el manuscrito actual, una molienda establecido y técnica de pulido para la visualización de los implantes cocleares 21-23 in situ se modificó para las prótesis de retina. Una tachuela de titanio, utilizado para asegurar un conjunto de electrodos a la retina, epiretinally, se ha incrustado en epoxi junto con el tejido ocular circundante. A continuación, este bloque de resina estaba orientado de manera adecuada y suelo progresivamente / pulido con el fin de revelar la morfología del tejido inmediatamente adyacente a la pegajosidad metal. Imágenes de la superficie pulida del bloque a varias profundidades fueron tomadas con un potente microscopio de disección. Esta técnica es útil para: visualizar y evaluating la respuesta del tejido adyacente al implante epirretiniana; para evaluar el trauma quirúrgico asociado con la implantación del implante; para determinar la reacción biológica a los componentes de metal duro; y para medir la distancia entre el implante y la superficie de la retina.
Esta técnica será útil en estudios de seguridad futuras para la visualización in situ de la región adyacente a una tachuela de retina u otros (por ejemplo, metálico) objetos duros en el ojo. Esto tiene aplicación directa en la evaluación de la seguridad preclínica de prótesis clavados a la retina epiretinally. También puede ser útil para evaluar el daño tisular en las regiones de la retina en contacto con los implantes situados en la ubicación sub-retinal.
Hay varias maneras de verificar que la técnica se ha realizado correctamente. En cada etapa, la retina debe permanecer adherida a las capas externas del ojo. Si hay desprendimiento de retina artifactual bruto, esto puede Indiccomió un problema con la fijación. Cuando se incrusta la muestra y re-orientado en la resina final bloquear la retina debe estar cerca ortogonal con la superficie de rectificación del bloque; esto reducirá al mínimo de corte oblicuo. Es útil para comprobar que el número de pasos incrementales de molienda (de tamaño de paso conocido) requerido para atravesar un objeto (tal como una tachuela de la retina) se correlaciona en consecuencia con las dimensiones del objeto.
La técnica se puede optimizar de varias maneras. Los arañazos en la superficie del bloque de epoxi asociado con el proceso de molienda se puede reducir con el pulido progresivamente más fino grado. Para el presente estudio, hemos utilizado 800, 1000, 1200, 2400, 4000 y papel de carburo de silicio de grado. Pasta de diamante también se podría utilizar para mejorar el acabado de superficie. Un acabado superficial más fino da una imagen de mayor calidad, pero a costa de tiempo de pulido adicional. Otra consideración crítica para mejorar el resultado de esta técnica es la elección y la calidad de la optics e iluminación utilizados para la captura de imágenes. Otras tinciones histológicas básicas – en particular las manchas de Nissl, se pueden utilizar en lugar de azul de toluidina, pero pueden requerir una mayor optimización. Algunas manchas se mancha la resina, así como el tejido (por ejemplo, Eosina), por lo tanto, un pulido superficial puede ser necesaria después de la tinción de fondo para eliminar la decoloración. Manchas especializados, colorantes fluorescentes y tinción inmunohistoquímica no se intentó, pero menos que se desee un resultado muy específico, el tiempo requerido para realizar estas manchas en cada nivel de molienda es probable que sea prohibitivo. Sin embargo, puede ser posible manchar el tejido en su conjunto antes de la etapa incrustación (paso 3.4) 24.
La principal limitación de esta técnica es que una vez que la región de interés se ha molido de distancia, no puede ser recuperada, por lo tanto, es prudente para capturar muchas imágenes (posiblemente redundantes) en una variedad de aumentos en cada etapa de esmerilado y pulido. EsTambién es importante utilizar pequeños incrementos para cada ajuste de la profundidad de molienda. Otra limitación de esta técnica es la de la ampliación óptica y la resolución en comparación con montado en un portaobjetos de vidrio y se ve con un estándar (transmisión) microscopio de luz de tejido. A los efectos de creación de prototipos y la evaluación de la seguridad de un dispositivo de implante novela, la evaluación patológica bruto es de interés primordial. Esta técnica proporciona un método eficiente para observar el daño clínicamente relevante asociada con una tachuela de la retina. Con la práctica, el tiempo total necesario para reunir moler, pulir y fotografiar una muestra dada (una vez integrados) es comparable al tiempo que se tardaría en sección de un bloque de parafina o sección de congelados.
Hay también el potencial de las presentes técnicas para extenderse a aplicaciones fuera del ámbito de aplicación de implantes de retina. Esta técnica es adecuada para evaluar el tejido adyacente a un implante duro, donde la extracción del implante no es feasible o dañarían la interfaz. Por ejemplo, esta técnica podría ampliarse para evaluar los implantes hechos de metal (por ejemplo, platino, nitinol, etc.) que no se puede cortar con técnicas histológicas convencionales, tales como algunos cerebral profunda o electrodos de los nervios periféricos, cánulas para la entrega de drogas, stents vasculares o prótesis ortopédicos.
The authors have nothing to disclose.
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
Light microscope | Leica | MZ16 | |
Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |