Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए Organotypic स्लाइस संस्कृति

Published: March 4, 2015 doi: 10.3791/52353
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

Summary

यहाँ हम organotypic टुकड़ा संस्कृति तकनीक का उपयोग कर हिप्पोकैम्पस प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए एक तकनीक का वर्णन है। इस विधि वयस्क न्यूरोजेनेसिस की इन विट्रो में हेरफेर के लिए अनुमति देता है और सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस को औषधीय एजेंटों के प्रत्यक्ष आवेदन के लिए अनुमति देता है।

Abstract

यहाँ हम organotypic टुकड़ा संस्कृति तकनीक का उपयोग कर कृंतक मस्तिष्क में हिप्पोकैम्पस प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए एक तकनीक का वर्णन है। विकासशील हिप्पोकैम्पस दांतेदार गाइरस को औषधीय एजेंटों के प्रत्यक्ष आवेदन की अनुमति देता है, जबकि इस विधि हिप्पोकैम्पस की विशेषता स्थलाकृतिक आकृति विज्ञान रखता है। इसके अतिरिक्त, टुकड़ा संस्कृतियों अप करने के लिए चार हफ्तों के लिए बनाए रखा जा सकता है और इस तरह, एक नवजात ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की परिपक्वता की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं। जटिल चर छोड़कर जबकि टुकड़ा संस्कृतियों ऐसे हिप्पोकैम्पस की गहरी शारीरिक स्थान के साथ ही रक्त मस्तिष्क बाधा से संबंधित अनिश्चितताओं के रूप में हिप्पोकैम्पस स्लाइस की कुशल औषधीय हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं। इन कारणों के लिए, हम प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के लिए विशेष रूप से organotypic टुकड़ा संस्कृतियों का अनुकूलन करने की मांग की।

Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं टोरंटो विश्वविद्यालय में तुलनात्मक चिकित्सा विभाग के पशु स्वास्थ्य और कल्याण के दिशा-निर्देशों के लिए पुष्टि।

Hippocampal स्लाइस की 1. तैयारी

  1. 125 डिग्री सेल्सियस पर ड्राई आटोक्लेव का उपयोग कर निम्नलिखित उपकरणों जीवाणुरहित: स्केलपेल संभाल (# 3) (2), मानक स्वरूप संदंश, बड़े (1), छोटे चीड़फाड़ कैंची (पक्ष के लिए angled) (1), माइक्रो चम्मच (चम्मच और फ्लैट रंग समाप्त होता है) (1), गोल माइक्रो spatulas (और पतला सिरों गोल) (2), ललित तूलिका (1), आग पॉलिश पाश्चर विंदुक (2), धुंध चौराहों, 2 एक्स 2 इंच (5)।
  2. जब बाँझ, एक बाँझ कंटेनर में उपकरणों डाल दिया है और उपयोग करें जब तक कवर रखने के। इसके तत्काल बाद विच्छेदन से पहले, एक 70% इथेनॉल समाधान में उपकरणों विसर्जित कर दिया।
  3. 35 डिग्री सेल्सियस एक इनक्यूबेटर में थाली में अच्छी तरह से / संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ने और भंडारण के द्वारा विच्छेदन प्रक्रिया शुरू होने से पहले संस्कृति डालने के साथ एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली तैयार करेंएन डी 5% सीओ 2।

2. बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में विच्छेदन उपकरण की व्यवस्था

  1. 70% इथेनॉल के साथ लामिना का प्रवाह हुड स्प्रे और शराब से निष्फल विच्छेदन उपकरणों को हटा दें। एक बाँझ पेट्री डिश पर आराम शराब और विच्छेदित मस्तिष्क के ऊतकों के बीच संपर्क से बचने के लिए, जबकि उपकरणों सूखे की अनुमति दें।
  2. 2 बड़े बाँझ पेट्री डिश में निष्फल बर्फ ठंड विदारक समाधान की जमा 5-7 मिलीलीटर। एक डिश ठंडा होगा और सिर (गंदा), ठंडा और बाहर पकड़े जाते मस्तिष्क (स्वच्छ) rinsing के लिए एक दूसरे को साफ करेंगे। मस्तिष्क बाहर विदारक के लिए पेट्री डिश पलकों में से एक में एक निष्फल फिल्टर पेपर रखें।
  3. हिप्पोकैम्पस बाहर विदारक के लिए छोटे पेट्री डिश ढक्कन में से एक में एक छोटी सी, निष्फल फिल्टर पेपर रखें। 2 छोटे, बाँझ पेट्री डिश में निष्फल बर्फ ठंड विदारक समाधान की जमा 3-5 मिलीलीटर। एक डिश एक हिप्पोकैम्पस वर्गों की जुदाई के दौरान वर्गों का आयोजन करेगा, बाहर पकड़े जाते हिप्पोकैम्पस का आयोजन करेगाविच्छेदन खुर्दबीन के नीचे।
  4. काटने चरण के लिए निष्फल फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के टेप और एक बाँझ धार बढ़ते द्वारा ऊतक हेलिकॉप्टर तैयार करें। निष्फल विदारक समाधान के साथ फिल्टर पेपर गीले।
  5. शराब के साथ एक साफ जैव बैग स्प्रे और लामिना का प्रवाह साफ बेंच में जगह है।

3. Hippocampal विच्छेदन

  1. लामिना का प्रवाह साफ बेंच के बाहर 70% इथेनॉल के साथ P7 Sprague Dawley चूहे पिल्ला स्प्रे और जल्दी से लामिना का प्रवाह बेंच के अंदर बड़े बाँझ शल्य कैंची का उपयोग पशु सिर काटना। सिर पेट्री डिश में से एक में ठंडा विदारक समाधान में छोड़ दें।
  2. पेट्री डिश में, खून से कुल्ला और जल्दी से नीचे निष्फल फिल्टर पेपर के लिए सिर, उदर पक्ष हस्तांतरण।
  3. बाण के समान विमान में पृष्ठीय सतह के साथ काटा स्केलपेल का उपयोग करना, अंतर्निहित खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए। मुलायम और टी के चूहों में आसानी से दिखाऊ है जो अंतर्निहित हड्डी, त्वचा के माध्यम से कट, लेकिन नहींउनकी उम्र। इस के अलावा "गंदा" स्केलपेल सेट और मस्तिष्क के ऊतकों पर प्रयोग नहीं करते।
  4. छोटे चीड़फाड़ (पक्ष के लिए angled) कैंची और संदंश का प्रयोग, शीर्षस्थान के लिए खोपड़ी के बाण के समान सिवनी साथ राज्याभिषेक सीवन बाण के समान सिवनी से लंबरूप intersected है जहां खोपड़ी पर संरचनात्मक बिंदु खोपड़ी खुला काटा। खोपड़ी के midline से ऊपर और दूर खोपड़ी फ्लैप खींच संदंश का प्रयोग करें।
  5. धीरे खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क लिफ्ट करने के लिए, ब्रेन स्टेम के नीचे मस्तिष्क के नीचे, पर सूक्ष्म चम्मच रखें। मस्तिष्क के बेसल सतह पर ऑप्टिक नसों और घ्राण बल्ब का पर्दाफाश करने के लिए मस्तिष्क लिफ्ट। पूरी तरह से खोपड़ी से मस्तिष्क को अलग करने के लिए छोटे कैंची से इन संरचनाओं काटें। निकालें और ठंडा विदारक समाधान युक्त अन्य बड़े पेट्री डिश को बरकरार मस्तिष्क हस्तांतरण।
  6. माइक्रो चम्मच का प्रयोग, बाँझ फिल्टर पेपर से युक्त एक छोटा सा पेट्री डिश ढकने के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण। एक बाँझ पाश्चर विंदुक के साथ, जिले की कुछ बूंदों के साथ मस्तिष्क कुल्लासमाधान secting ऊतक नम रखने के लिए।
  7. एक "साफ" स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग अलावा दो गोलार्द्धों काटा। माइक्रो चम्मच के साथ बड़े पेट्री डिश के लिए वापस छोड़ दिया गोलार्द्ध स्थानांतरण और बाद में उपयोग के लिए बर्फ ठंड विदारक समाधान में नीचे गोलार्द्ध पिया ओर जगह है।
  8. सही गोलार्द्ध के औसत दर्जे का चेहरा देखें और धार तोरणिका, हिप्पोकैम्पस के औसत दर्जे का बढ़त के साथ सफेद पदार्थ के एक प्रमुख बैंड की पहचान। एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करना, तोरणिका के माध्यम से एक बाण के समान कटौती करने के लिए, लेकिन स्केलपेल टिप का केवल 0.5 सेमी तोरणिका कटौती करने के लिए पर्याप्त होगा क्योंकि ख्याल रखना।
  9. 2 माइक्रो-spatulas का प्रयोग, ब्रेन स्टेम पर दाएँ हाथ-रंग रखने और बाएं हाथ के रंग के साथ overlying प्रांतस्था उठाने के द्वारा सही गोलार्ध से पहले हिप्पोकैम्पस को हटा दें। धीरे हिप्पोकैम्पस के पार्श्व वेंट्रिकल और औसत दर्जे की सतह प्रकट करने के लिए कोर्टेक्स उठा। एक सफेद वक्र रेखा, fimbria, अब दिखाई जानी चाहिए।
  10. Curva साथ रंग की वक्रता संरेखितfimbria की संरचना और धीरे fimbria के तहत रंग दबाएँ। छोड़ रंग स्लाइड और व्याख्यान चबूतरे वाला दुम अक्ष के साथ सवारी और फिर हिप्पोकैम्पस को दूर करने के पृष्ठीय दिशा में रंग उठा।
  11. बर्फ ठंड विदारक समाधान के साथ एक 2 एन डी छोटे पेट्री डिश के लिए हिप्पोकैम्पस स्थानांतरण। बाएं हिप्पोकैम्पस दूर करने के लिए छोड़ दिया गोलार्द्ध पर एक ही प्रक्रिया दोहराएँ।
  12. एक माइक्रो रंग का प्रयोग, ध्यान ऊतक हेलिकॉप्टर चरण के लिए हिप्पोकाम्पी हस्तांतरण। हेलिकॉप्टर ब्लेड की धुरी के लिए एक दूसरे के लिए और सीधा उन्हें आसन्न और समानांतर व्यवस्था करो। ऊतक स्थिति और हिप्पोकाम्पी के शीर्ष पर विदारक समाधान की कुछ बूँदें जोड़ने के लिए एक तूलिका का प्रयोग करें।
  13. व्यक्तिगत स्लाइस को हटाने के लिए रोक के बिना 400 माइक्रोन स्लाइस में ऊतक में कटौती (आमतौर पर वे ब्लेड का पालन नहीं करेंगे)। पूरे हिप्पोकैम्पस कटौती की गई है, के बाद धीरे विच्छेदन समाधान के साथ एक 2 एन डी छोटे पेट्री डिश के लिए वर्गों को हस्तांतरण करने की तूलिका का उपयोग करें।
  14. विज्ञापन के नीचेमाइक्रोस्कोप issecting, ध्यान से amicro-रंग और तूलिका का उपयोग कर अस्थायी स्लाइस अलग।
  15. एक लामिना का प्रवाह हुड में इनक्यूबेटर और जगह से संस्कृति डालने के साथ पूर्व तैयार संस्कृति की थाली निकालें।
  16. एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग, संस्कृति डालने झिल्ली के शिखर की सतह के लिए पिपेट और हस्तांतरण स्लाइस में 4-5 स्लाइस आकर्षित। इसके बाद, एक तूलिका के साथ स्थिति को समायोजित करने और अलग अलग वर्गों और संस्कृति डालने की सीमा के बीच की जगह छोड़ दें।
  17. एक बाँझ पाश्चर विंदुक का प्रयोग, झिल्ली के शिखर सतह से अतिरिक्त विदारक समाधान निकालें।
    नोट: पिपेट में ऊतक वर्गों ड्राइंग समाधान से बचने के हटाए जाने के दौरान। वैकल्पिक रूप से, धीरे-धीरे समाधान निकालने के लिए निष्फल पिपेट सुझावों के साथ एक नियमित पिपेट (P200 या P1000 है) का उपयोग करें।
  18. सीरम युक्त मध्यम संस्कृति और 35 डिग्री सेल्सियस पर वापस इनक्यूबेटर में hippocampal स्लाइस और 5% सीओ 2 के साथ संस्कृति की थाली रखें।
    नोट: प्रयोग कहता हैकई जानवरों से संस्कृतियों पैदा करने के लिए, अच्छी तरह से dissections के बीच लामिना का प्रवाह साफ बेंच साफ। शराब के समाधान के लिए उपकरणों लौटें और सभी पेट्री डिश, फिल्टर कागजात और दूसरा विच्छेदन करने से पहले बाँझ रेज़र ब्लेड की जगह।

4. दूध पिलाने की और organotypic स्लाइस को बनाए रखने

  1. एक बाँझ लामिना का प्रवाह साफ बेंच में फ़ीड संस्कृतियों।
  2. सुसंस्कृत वर्गों दो दिनों के बाद विच्छेदन के पहले खिला प्रदर्शन करते हैं। निष्फल गिलास पिपेट का उपयोग महाप्राण पुरानी संस्कृति के माध्यम से।
  3. वेल्स को ताजा, बाँझ, सीरम युक्त मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए बाँझ 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें।
  4. धीरे संस्कृति डालने की जगह है और झिल्ली सतह के नीचे का गठन हो सकता है कि किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए ध्यान रखना।
  5. पहली खिलाने के बाद, हर दूसरे दिन मध्यम बदल जाते हैं।

Thymidine analogues के साथ 5. incubating ऊतक स्लाइस नवजात न्यूरॉन्स लेबल के लिए

  1. पढ़ने के लिएपरिपक्वता और हिप्पोकैम्पस में दांतेदार ग्रेन्युल कोशिकाओं के एकीकरण, ऐसे Bromodeoxyuridine (BrdU) या Chlorodeoxyuridine (CldU) के रूप में एक thymidine एनालॉग, साथ organotypic स्लाइस सेते हैं। यहाँ, हम क्योंकि खारा में अपने उच्च घुलनशीलता की CldU का उपयोग करें।
  2. 3DIV के बाद, 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए संस्कृति के माध्यम से 1 एमएल खारा में 10 मिलीग्राम / एमएल CldU शेयर समाधान की एक μl जोड़ें। BrdU के लिए किया जाता है, तो आणविक वजन में अंतर के लिए एकाग्रता सही। संस्कृति वेल्स को CldU के साथ मध्यम जोड़ें और 35 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मध्यम CldU युक्त साथ ऊतक सेते हैं।
  3. 35 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 2 घंटे बाद, CldU युक्त मध्यम हटाने और (ऊपर उल्लिखित) सामान्य भोजन कार्यक्रम फिर से शुरू करने के लिए नियमित रूप से खिला मध्यम के साथ बदलें।

6. ऊतक निर्धारण और संग्रहण

  1. उपचार लागू करने और संस्कृति प्रयोगों (चित्रा 2B) शुरू करने से पहले ऊतकों के नमूनों फिक्सिंग के लिए एक समय स्थापित करना।
    2. <एक पूर्व निर्धारित दिन के बाद विच्छेदन पर li> एक प्रयोगशाला धूआं हुड में निम्न तैयार: एक 10-50 मिलीलीटर बीकर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% paraformaldehyde (पीएफए) युक्त; त्याग संस्कृति के माध्यम के लिए एक खाली बीकर; छोटे संदंश; डिस्पोजेबल सुझावों के साथ और एक 1000 एमएल पिपेट।
  2. एक धूआं हुड के लिए ऊष्मायन चैम्बर और हस्तांतरण से संस्कृति की थाली (ओं) को हटा दें। संदंश के साथ व्यक्तिगत अच्छी तरह से थाली आवेषण झुकाएँ। इसके बाद, एक निपटान बीकर संस्कृति मध्यम और हस्तांतरण को दूर करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें। सभी संस्कृति के माध्यम से निकाल दिया जाता है कि यह सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए एक कोण पर संस्कृति की थाली झुकाएँ।
  3. एक समय में एक संस्कृति की थाली के लिए मध्यम हटाने खत्म करो। मध्यम निकाल दिया गया है, अच्छी तरह से प्रत्येक संस्कृति के लिए 4% पीएफए ​​के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और अच्छी तरह से parafilm के साथ थाली मुहर। 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर के लिए आवश्यक है और हस्तांतरण प्लेटों के रूप में के रूप में कई संस्कृति प्लेटों के लिए दोहराएँ।
  4. 24 घंटे के बाद, एक धूआं हुड में निम्न तैयार: 10-50 पीबीएस में 0.1% सोडियम azide युक्त मिलीलीटर बीकर; एक खालीत्याग पीएफए ​​(विषाक्त पदार्थों discarding जब सुरक्षा सावधानियों का पालन करें) के लिए बीकर; छोटे संदंश; डिस्पोजेबल सुझावों के साथ और 1000 एमएल पिपेट।
  5. पीएफए ​​जोड़ने के लिए 6.4 में उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करें, लेकिन इसके बजाय सोडियम azide साथ पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक बार पूरी तरह से parafilm में किनारों लपेटकर और 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में भंडारण के द्वारा भविष्य में उपयोग के लिए, सील अच्छी तरह प्लेटें स्थानांतरित कर दिया।

7. immunohistochemistry के लिए ऊतक सेक्शनिंग

  1. एक vibratome का उपयोग सेक्शनिंग ऊतक प्रदर्शन करते हैं। कदम के निम्नलिखित श्रृंखला organotypic संस्कृतियों से प्रयोग करने योग्य ऊतक वर्गों की उपज को अधिकतम मदद करते हैं।
    नोट: तुरंत हिप्पोकैम्पस विच्छेदन और स्लाइस की चढ़ाना के बाद, ऊतक लगभग 400 माइक्रोन की मोटाई है। हालांकि, ऊष्मायन कक्ष में 2-3 सप्ताह के बाद, ऊतक स्लाइस 150-300 माइक्रोन के अंतिम खंड मोटाई, जिसके परिणामस्वरूप समतल करने के लिए शुरू हो जाएगा।
  2. खंड सुसंस्कृत ऊतक के लिए निम्न आइटम तैयार: # 11 स्केलपेल बीभार रखना और संभाल, ऊतक माउंट करने के लिए बर्फ के ठंडे पीबीएस, एक माइक्रो-विच्छेदन संदंश, और एक साफ vibratome काटने चरण युक्त एक गिलास पेट्री डिश।
  3. यह प्लास्टिक डालने के आवास से अलग किया जा सकता है ताकि एक स्केलपेल का उपयोग सावधानी से परिपत्र डालने झिल्ली की परिधि के साथ कटौती करने के लिए। सुसंस्कृत टुकड़ा और स्केलपेल के बीच पर्याप्त जगह छोड़ दें।
  4. पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश के लिए अलग डालने झिल्ली स्थानांतरण। पीबीएस में rinsing के बाद, vibratome बढ़ते चरण के लिए झिल्ली हस्तांतरण करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  5. इसके बाद, सुसंस्कृत स्लाइस आसपास के अतिरिक्त झिल्ली को खत्म करने और साफ किनारों को बनाने के लिए अतिरिक्त सामग्री दूर कटौती करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। झिल्ली सुनिश्चित करेगा यह कदम फ्लैट है और आसानी से काटने की सतह का पालन कर सकते हैं।
  6. Vibratome काटने के मंच पर चिपकने के 1-2 बूँदें प्लेस और यहां तक ​​कि एक 22 जी सुई का उपयोग परत में फैल गया। Vibratome के काटने ब्लेड के लिए लंबी बढ़त समानांतर के साथ एक आयताकार आकार में चिपकने वाला बिखरा हुआ है। इस चरण पर कार्यवाईजल्दी सूखने से चिपकने को रोकने के लिए।
  7. काटने चरण के लिए hippocampal स्लाइस युक्त छंटनी की झिल्ली हस्तांतरण और धीरे गोंद पर झिल्ली की स्थिति और कोई हवाई बुलबुले हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
  8. Superglue सूख जाता है, के रूप में वापस पीबीएस युक्त पेट्री डिश के लिए चिपके झिल्ली के साथ vibratome मंच हस्तांतरण। Vibratome ब्लेड और ऊतक वर्गों स्टोर करने के लिए एक 48 अच्छी तरह से थाली युक्त सोडियम azide तैयार करें।
  9. भंडारण और बाद immunohistochemical धुंधला के लिए एक 48 अच्छी तरह से थाली युक्त सोडियम azide के लिए organotypic टुकड़ा ऊतक और हस्तांतरण के 30 माइक्रोन वर्गों उत्पन्न करने के लिए vibratome का प्रयोग करें।
  10. Immunohistochemical धुंधला 26,29 के लिए प्रोटोकॉल पूर्व मौजूदा संदर्भ लें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1) स्लाइस इन विट्रो में 10-21 दिन (DIV) के बाद hippocampal स्लाइस की विशेषता रूपात्मक सुविधाओं का कहना है कि, और 2) नवजात DGCs मात्रा निर्धारित किया जा सकता है: organotypic संस्कृतियों वयस्क न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के लिए उपयुक्त होगा निर्धारण अगर वे दो मुख्य मानदंड को पूरा आवश्यक है कि आमतौर पर वयस्क न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के क्षेत्र में कार्यरत मानक immunohistochemical तकनीक का उपयोग कर। पहली कसौटी के बारे में, चित्रा 1 ए और 1 बी संरक्षित हिप्पोकैम्पस आकृति विज्ञान पर प्रकाश डाला। ऐसे दांतेदार गाइरस (डीजी) के रूप में विशेषता सुविधाओं, सीए 1, और सीए 3 क्षेत्रों को आसानी से पहचाना जाता है।

दूसरी कसौटी के बारे में, चित्रा 1C (ऊपरी पैनल) नवजात DGCs हरे रंग में अंतर्जात neuronal मार्कर, Doublecortin (DCX) और exogenous thymidine एनालॉग, 5-क्लोरो-2'- deoxyuridine (CldU) में सह व्यक्त करने का एक प्रतिनिधि नमूने प्रदान करता है लाल। इन न्यूरॉन्स उप जीआर में स्थित हैंहिप्पोकैम्पस के महानिदेशक की anular क्षेत्र। न्यूरॉन्स की सही जन्म डेटिंग सुनिश्चित करने के क्रम में, हम DCX-एक्सप्रेस सह कि CldU + नाभिक की पहचान। Confocal माइक्रोस्कोपी उम्मीदवार कोशिकाओं सेल के Z अक्ष भर में ब्याज की मार्कर सह-व्यक्त करना चाहिए क्योंकि सफलतापूर्वक डबल लेबल न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए इस स्तर पर की जरूरत है। नमूना डेटा ऐसे डबल लेबलिंग उपज के साथ DCX और CldU आवेदन के बाद 12 दिनों में CaBP व्यक्त की कि CldU + कोशिकाओं के 35% व्यक्त की कि CldU + कोशिकाओं का लगभग 17% प्राप्त की। CaBP मूल्य विवो 26 में प्राप्त तुलनीय आंकड़ा की तुलना में काफी कम है जबकि DCX मूल्य बहुत समान है। मानक टिशू कल्चर शर्तों CaBP + कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम प्रतिशत के लिए जिम्मेदार हो सकता है।

2A चित्रा अधिकार (1-8) के लिए छोड़ दिया से आगे बढ़ना है कि विच्छेदन चरणों प्रस्तुत करता है: पशु के कत्ल के साथ (2), मस्तिष्क के हस्तांतरण ठंडा विच्छेदन समाधान (3) के लिए मस्तिष्क की (1), हटाने शुरू, काटनासे हिप्पोकैम्पस के आयन को छोड़ दिया और विच्छेदित हिप्पोकाम्पी की सही गोलार्द्धों (4), भंडारण ठंडा विच्छेदन समाधान में (5), Stoelting ऊतक हेलिकॉप्टर को दोनों हिप्पोकाम्पी के हस्तांतरण और विदारक माइक्रोस्कोप के तहत व्यक्तिगत स्लाइस के 400 माइक्रोन (6), जुदाई में सेक्शनिंग सेल संस्कृति आवेषण पर (7), और चढ़ाना ऊतक (8)। इस तरीके में आगे बढ़ संस्कृति की प्रक्रिया में एक बाँझ वातावरण बनाए रखने में मदद करता है।

विकास के समय पाठ्यक्रम हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस की एक महत्वपूर्ण विशेषता है, क्योंकि अंत में, हम वास्तव में दो घंटा लेबल करने के लिए div 3 के बाद तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए CldU साथ सुसंस्कृत स्लाइस सेते के लिए चुना है। CldU प्रशासन के लिए संकीर्ण समय खिड़की न्यूरॉन्स कोशिकाओं का एक सजातीय जनसंख्या में लगभग एक ही maturational चरण (चित्रा 2) गठित लेबल वाली संभावना है कि सुधार करने के लिए चुना गया था। CldU लेबलिंग करने के साथ संबंध है, हिप्पोकैम्पस के कार्य के लिए न्यूरोजेनेसिस की एक महत्वपूर्ण विशेषता एक सैनिक पर यह है किवेंचर समय विभिन्न maturational चरणों 27,28 पर दांतेदार ग्रेन्युल कोशिकाओं की एक विषम आबादी है।

चित्र 1
चित्रा 1. नमूना प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी तस्वीरें हिप्पोकैम्पस आकृति विज्ञान संरक्षित पर प्रकाश डाला। CldU (हरा) और CaBP (लाल), 20x हवा समग्र छवि के लिए immunolabeled 12 दिनों के बाद विच्छेदन से (ए) organotypic टुकड़ा (स्केल बार = 500 माइक्रोन) 21 दिनों से टुकड़ा की। (बी) नमूना माइक्रोग्राफ CldU के लिए immunolabeled विच्छेदन (पोस्ट लाल) और DCX (हरा) चित्रा 1 ए के (विपरीत रंग-योजना), 20x हवा (स्केल बार = 100 माइक्रोन)। (सी) ऊपरी पैनल। कोशिकाओं के प्रतिनिधि confocal खुर्दबीन तस्वीर सह व्यक्त ClXdU और अंतर्जात अपरिपक्व neuronal मार्कर, DCX। DGCs सह व्यक्त DCX (हरा) और CldU (लाल) नवजात न्यूरॉन्स के रूप में गिना जाता है। तीर एक डबल labe इंगित करता हैविकास, 40X तेल विसर्जन (स्केल बार = 10 माइक्रोन) के प्रारंभिक चरण में सेल का नेतृत्व किया। तुलनात्मक कोशिकाओं विवो 26 में 10 दिनों के बाद लेबलिंग मनाया गया है। लोअर पैनल। कोशिकाओं के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों सह व्यक्त CldU (हरा) और CaBP (लाल)। तीर एक डबल लेबल सेल, 40X फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ (स्केल बार = 10 माइक्रोन) इंगित करता है। डीजी-दांतेदार गाइरस। GCL-दाना सेल परत। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
लामिना का प्रवाह साफ बेंच में हिप्पोकैम्पस विच्छेदन के लिए अनुक्रमिक चरणों की चित्रा 2 (ए) के चित्रण। बिंदीदार रेखा विच्छेदन क्षेत्र के "unsterile" (बाएं) और "बाँझ" (दाएं) क्षेत्रों को दर्शाता है। Organo के लिए (बी) के समयP7 चूहा पिल्ले (शुरू) से तैयार typic टुकड़ा संस्कृतियों। अंकन thymidine एनालॉग, CldU *, और प्रयोगात्मक प्रश्न करने के लिए अनुकूल विभिन्न औषधीय एजेंटों शामिल कर सकते हैं जो "इलाज" के आवेदन संकेत मिलता है। संस्कृति CldU आवेदन (संस्कृतियों फिक्स) से वांछित ध्यान केन्द्रित करना समय पर paraformaldehyde के साथ तय कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक / उपकरण का नाम कंपनी सूची की संख्या टिप्पणियाँ / विवरण
5-क्लोरो-2'- deoxyuridine (CldU) सांसद Biomedicals 105,478 खतरनाक, कैंसर
सेल संस्कृति 30 मिमी व्यास, 0.4 माइक्रोन पी, सम्मिलित करता हैअयस्क आकार वैज्ञानिक थर्मो 140,660 इन आवेषण पर Nuclon डेल्टा कोटिंग बेहतर ऊतक आसंजन प्रदान करता है और टुकड़ा गुणवत्ता में सुधार।
शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब (बाँझ) फिशर साइंटिफिक 14-432-22
चीड़फाड़ कैंची (पक्ष के लिए angled) ललित विज्ञान उपकरण 14,082-09
न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) Gibco 11,095; तरल स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर
ग्रहण नी-यू फ्लोरोसेंट खुर्दबीन NIKON
ऊतक के लिए गोंद क्रेजी गोंद KG585 गोंद के संपर्क में किसी भी ऊतक आईएचसी के लिए अनुपयोगी हो जाएगा के रूप में आसंजन प्राप्त करने के लिए गोंद की न्यूनतम राशि का उपयोग करें।
हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) (500 मिलीलीटर) Gibco 14025-092 स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर
हार्स सीरम हीट निष्क्रिय (500 मिलीलीटर) Gibco 16050-122 -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर aliquots और दुकान बनाओ
Kimwipes किम्बर्ली-क्लार्क TW 31KYPBX
संशोधित कांच pipettes (लेम्प लौ के साथ smoothed पाश्चर विंदुक हटा दिया है और धार के नीचे)
पेट्री डिश (100 मिमी x 15 मिमी) और (60 मिमी x 15 मिमी) फिशर ब्रांड FB0875712 और FB0875713A
स्केलपेल ब्लेड # 11 ललित विज्ञान उपकरण 10,011-00
स्केल्पल संभाल # 3 ललित विज्ञान उपकरण 10,003-12
सीरम विज्ञानी Pipettes Sorfa मेडिकल प्लास्टिक कं P8050
मानक स्वरूप संदंश ललित विज्ञान उपकरण 11,000-12
बाँझ वैक्यूम फिल्टर थर्मो-वैज्ञानिक 565-0020
शल्य कैंची ललित विज्ञान उपकरण 14,054-13
सिरिंज संचालित फिल्टर यूनिट Millipore-Millex SLGP033RS
जंगम मंच के साथ ऊतक हेलिकॉप्टर Stoelting 51,425
ठीक टिप तूलिका

तालिका 1. आपूर्ति और अभिकर्मकों

समाधान सामग्री और निर्देश
विच्छेदन समाधान हांक के) 500 मिलीलीटर और# 39; बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) (Gibco-14025-092)।
ख) 2.2 जी ग्लूकोज़ जोड़ें।
ग) 0.5 ग्राम सुक्रोज जोड़ें।
घ) 1.787 जी HEPES जोड़ें।
ई) चुंबकीय हलचल थाली के साथ 30 मिनट के लिए मिश्रण।
समाधान सुनिश्चित करने के लिए एफ) का प्रयोग करें पीएच मीटर 7.4 = एक अंतिम पीएच है।
छ) अंतिम परासरणीयता = 320-330 mOsm सुनिश्चित करने के लिए osmometer का प्रयोग करें।
ज) 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से वैक्यूम निस्पंदन का उपयोग कर बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में समाधान जीवाणुरहित।
सीरम युक्त मध्यम संस्कृति: 100 मिलीलीटर न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) (Gibco 11,095), 50 मिलीलीटर घोड़े सीरम (Gibco 16050-122), 50 मिलीलीटर HBSS। क) बीकर में 50 मिलीलीटर HBSS के लिए निम्न जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में भंग। चुंबकीय दोषी साथ मिलाएं।
ख) 1.3 जी ग्लूकोज़।
ग) 36 मिलीग्राम MgSO 4।
घ) 17.6 मिलीग्राम Ascorbic एसिड।
ई) 2 एम 2 CaCl शेयर समाधान के 5 μl।
Gibco 15140-062); च) 50 μl एंटीबायोटिक antimycotic (100x स्टॉक, बाँझ जोड़ें।
छ) / एमएल इंसुलिन एक माइक्रोग्राम प्रति।
ज) एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा समाधान ऊपर जीवाणुरहित।
मैं) मिक्स फ़िल्टर्ड 100 मिलीलीटर सदस्य के साथ समाधान और लामिना का प्रवाह हुड में 50 मिलीलीटर घोड़े सीरम।
जम्मू) बाँझ शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 50 मिलीलीटर aliquots बनाओ (फिशर साइंटिफिक-14-432-22) और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
4% paraformaldehyde लगानेवाला समाधान। क) आसुत एच 2 ओ की 300 मिलीलीटर के लिए निम्न और चुंबकीय हलचल प्लेट पर मिश्रण जोड़कर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें।
ख) 2.7 ग्राम सोडियम फॉस्फेट अकेले आधार (नाह 2 पीओ 4) जोड़ें।
ग) 11.5 ग्राम सोडियम phosphat जोड़ेंई द्विक्षारकीय (NaHPO 4)।
घ) 9.0 ग्राम सोडियम क्लोराइड (NaCl) जोड़ें।
ई) लगभग हीट। 700 55 डिग्री सेल्सियस के लिए आसुत एच 2 ओ की मिलीलीटर और गर्मी बंद कर देते हैं।
च) 40 ग्राम paraformaldehyde (पीएफए) जोड़ें और चुंबकीय हलचल प्लेट का उपयोग कर पानी की 700 मिलीलीटर में हलचल।
छ) पीबीएस (ए, बी, सी, डी) गठबंधन और पीएफए ​​(ई, एफ) समाधान, 1000 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा 7.4 और ऊपर पीएच को समायोजित करें।
0.1% सोडियम azide समाधान क) पीबीएस समाधान का एक एल पाउडर सोडियम azide के 1G (नेन 3) जोड़ें।
ख) मिक्स 4 डिग्री सेल्सियस पर चुंबकीय हलचल प्लेट और दुकान का उपयोग कर।

तालिका 2 सॉल्यूशंस और व्यंजनों

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CldU (या BrdU) प्रशासन के बाद, औषधीय एजेंटों के आवेदन के समय विशेष रूप से विकास की खिड़कियों के दौरान नवजात DGCs लक्षित करने के लिए चुना जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक काल्पनिक एजेंट गाबा depolarizing है, जहां एक विकास के चरण में हैं कि अपरिपक्व न्यूरॉन्स की उम्र के साथ मेल खाना करने का प्रस्ताव है, जो दूसरे सप्ताह के बाद CldU इंजेक्शन के दौरान लागू किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग भविष्य के अध्ययन औषधीय एजेंट और "दर्जी" हित के विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्न के दृष्टिकोण के लिए जोखिम के खिड़की अनुकूलित कर सकता।

कि टुकड़ा संस्कृतियों प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के लिए एक वैध मॉडल हैं निर्धारित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी हिप्पोकैम्पस में नवजात न्यूरॉन्स दाग और यों की क्षमता है। इस परिकल्पना के समर्थन में दो मुख्य निष्कर्षों सूक्ष्म विश्लेषण CldU और एक ही न्यूरॉन्स में अंतर्जात प्रोटीन मार्करों के लिए immunohistochemical जेट से पता चला है कि थे।अंतर्जात न्यूरोनल मार्कर के साथ संयोजन में उपयोग करते हैं, तो इस तरह के BrdU और CldU के रूप में thymidine analogues के न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं।

intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से इस तरह के BrdU के रूप में thymidine analogues के, के आवेदन, सामान्यतः पिंजरे का बँटवारा 29 के एस चरण के दौर से गुजर लेबल न्यूरॉन्स के लिए न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोग किया जाता है। समान दृष्टिकोण कुछ संशोधनों के साथ organotypic संस्कृतियों में नियोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों (3 दिनों के लिए 0.5 माइक्रोन) ~ 14 DIV के 18 के बाद संस्कृतियों टुकड़ा करने के लिए BrdU दिलाई। उस अखबार में प्रस्तुत आंकड़ों की समीक्षा मेट्रिक्स के कुछ न्यूरोजेनेसिस क्षेत्र, यानी में इस्तेमाल मानक तकनीक, stereological मात्रा का ठहराव 30 को काम नहीं करते न्यूरोजेनेसिस बढ़ाता के लिए प्रयोग किया जाता है कि पता चलता है। BrdU और neuronal-नाभिक (NeuN) सकारात्मक कोशिकाओं के सह अभिव्यक्ति रिपोर्टिंग जब उदाहरण के लिए, वे सूचित प्रदान करने के बजाय "संस्कृति" प्रति कोशिकाओं की कुल संख्या का संकेतऊतक क्षेत्र या मात्रा के बारे में समझना।

बाद के अध्ययन एंटीबॉडी और अधिक आसानी से ऊतकों के नमूनों 31 तर करने की अनुमति देकर दृश्य और immunohistochemistry के प्रोटोकॉल में सुधार हुआ है, जो व्यक्ति 10 माइक्रोन वर्गों, को सुसंस्कृत स्लाइस सेक्शनिंग द्वारा इस पद्धति पर सुधार हुआ है। चारपाई एट अल। 28 10 माइक्रोन अनुभाग प्रति सह-लेबल की कोशिकाओं की संख्या के रूप BrdU के साथ डबल लेबलिंग (3 दिनों के लिए 10 माइक्रोन) सूचना दी, लेकिन तुलनात्मक क्षेत्र या विशिष्ट हिप्पोकैम्पस क्षेत्र का अध्ययन किया है, यानी सीए 1, सीए 3 या के बारे में जानकारी प्रदान नहीं किया डीजी। इसके अतिरिक्त, confocal और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों के विश्लेषण के खांसने हिप्पोकैम्पस आकृति विज्ञान सफलतापूर्वक बनाए रखा गया था कि नहीं दिखा है।

महत्वपूर्ण बात है, दोनों पढ़ाई कमियां संबद्ध किया गया है, जो तीन दिनों के BrdU के जोखिम अवधि का उपयोग किया था। BrdU लेबलिंग बहुत जांचकर्ताओं VA में नव विभाजित कोशिकाओं को ट्रैक करने की अनुमति देकर न्यूरोजेनेसिस पढ़ाई सहायता प्राप्त हैगंभीर मस्तिष्क क्षेत्रों। हालांकि, BrdU विषाक्तता भी अच्छी तरह से बताया गया है। इसका उपयोग रूपात्मक और व्यवहार असामान्यताएं 32,33 और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को 34-36 के सेल चक्र, भेदभाव, माइग्रेशन और अस्तित्व पर नकारात्मक प्रभाव पैदा करने के लिए दिखाया गया है। जैसा कि पहले उल्लेख अध्ययन में BrdU के लंबे समय तक प्रशासन हिप्पोकैम्पस शरीर क्रिया विज्ञान बदल दिया और BrdU प्रशासन से कुछ साइड इफेक्ट अपरिहार्य हो सकता है, जबकि हमारे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल thymidine analogues के लिए साथ ऊतक incubating द्वारा इन जटिलताओं के कुछ सीमित करने के लिए डिजाइन किया गया था कि confounding चर पेश किया है हो सकता है 2 घंटा। Incubating समाधान तैयार करते समय यह BrdU की तुलना में बेहतर घुलनशीलता दिखाया क्योंकि इसके अतिरिक्त, हम बजाय BrdU की CldU उपयोग करने के लिए चुना है। तीन दिन प्रोटोकॉल कुछ प्रयोगात्मक डिजाइन उदाहरण के लिए उपयोगी हो सकता है, proliferating कोशिकाओं की लेबलिंग अधिकतम, इस 2 घंटा प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत छोटी आबादी की नब्ज लेबलिंग का एक फायदा हैवांछित अस्तित्व समय पर अध्ययन किया जा सकता है, जो कोशिकाओं के tion के (चित्रा 2B देखें)।

Organotypic टुकड़ा संस्कृतियों 37 में लेबलिंग की तकनीक के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान दिया Namba एट अल। BrdU के आवेदन के लिए दो अलग अलग तरीकों का पालन न्यूरोनल उत्पादन के स्तर की तुलना करके। 30 मिनट के तुरंत ऊतक के explantation निम्नलिखित के लिए 1 माइक्रोन BrdU युक्त संस्कृति के माध्यम से प्राप्त किया है कि इन विट्रो संस्कृतियों के साथ प्रसव के बाद दिन 5 (पी -5) चूहों में BrdU (50 मिलीग्राम / किग्रा) के लेखकों की तुलना में intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी)। वे बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर यह है कि रिपोर्ट में vivo सुसंस्कृत ऊतक में और जल्दी में इन विट्रो BrdU के इंजेक्शन। लेखकों हिप्पोकैम्पस संरचना रूपरेखा स्पष्ट चित्र उपस्थित नहीं था, लेकिन वे दाना सेल परत में कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में BrdU के immunoreactivity रिपोर्ट। वे stereological गिनती रोजगार जबकि, क्षेत्र या मात्रा से एक उपाय उपलब्ध कराने के मूल्यवान होगा। सामान्य रूप मेंएक पूरी तरह से न्यूरोजेनेसिस और औषधीय perturbations के अध्ययन के लिए आवेदन के साथ, प्रसव के बाद हिप्पोकैम्पस टुकड़ा संस्कृतियों का ब्यौरा रूप में उद्धृत पढ़ाई उपस्थित organotypic संस्कृतियों। इस तकनीक का उपयोग करना, hippocampal स्लाइस इन विट्रो (DIV) में करने के लिए 21 दिनों के लिए बनाए रखा जा सकता है और दवाओं न्यूरोजेनेसिस पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संस्कृति की अवधि में किसी भी बिंदु पर माध्यम से जोड़ा जा सकता है।

हमारा उद्देश्य 2 घंटे के लिए CldU का एक संक्षिप्त 'पल्स' आवेदन उपलब्ध कराने के द्वारा DGCs के एक असतत, अपेक्षाकृत समरूप जनसंख्या लेबल करने के लिए किया गया था। न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए एक सामान्य नियोजित रणनीति एक thymidine एनालॉग के साथ विभिन्न अंतर्जात मार्करों के लिए immunohistochemical धुंधला के माध्यम से एक न्यूरॉन की maturational चरण की पहचान शामिल है। Confocal और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी thymidine एनालॉग CldU शामिल है और इसलिए सक्रिय रूप से संस्कृति की अवधि के दौरान पिंजरे का बँटवारा के दौर से गुजर रहे थे कि नाभिक की उपस्थिति की पुष्टि की। चित्रा 2 इन विवो ऊतक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल immunohistochemical प्रोटोकॉल टुकड़ा संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि सबूत उपलब्ध कराता है।

विशेष रूप से, न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के क्षेत्र में आमतौर पर इस्तेमाल किया पद्धति पूरी तरह से निम्नलिखित व्यक्त किया जाता है, जो मुख्य रूप से दिन 3-21 और परिपक्व neuronal मार्कर, Calbindin (CaBP) से अपरिपक्व न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, जो सूक्ष्मनलिका जुड़े प्रोटीन, DCX, के लिए immunohistochemical धुंधला प्रदर्शन करने के लिए है 28 दिनों के बाद पिंजरे का बँटवारा। CldU + कोशिकाओं के phenotype इन अंतर्जात मार्करों 26 का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।

लंबी अवधि के लिए टुकड़ा संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए उन्नत विधियों अधिक CldU + न्यूरॉन्स परिपक्व, CaBP + स्तर तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के अतिरिक्त लाभ हो सकता है। वर्तमान में, organotypic संस्कृति दृष्टिकोण की एक सीमा ऊतक लगातार संस्कृति की अवधि के दौरान बदल रहा है। उदाहरण के लिए, तुरंत स्लाइस की हिप्पोकैम्पस विच्छेदन और चढ़ाना के बाद, तीssue लगभग 400 माइक्रोन की चौड़ाई है। हालांकि, ऊष्मायन कक्ष में 2-3 सप्ताह के बाद, ऊतक स्लाइस 250-350 माइक्रोन के बीच एक अंतिम चौड़ाई में जो परिणाम, पतला करने के लिए शुरू हो जाएगा। इस immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक परियोजना के लिए उपयोग करने के लिए कितने जानवरों की योजना बनाते समय विचार किया जाना चाहिए कि ऊतक की राशि की सीमा। अतिरिक्त प्रयोगों इन विट्रो में पाए जाते हैं कि हिप्पोकैम्पस शरीर क्रिया विज्ञान में कार्यात्मक परिवर्तन को चिह्नित करने में मदद करेगा।

हिप्पोकैम्पस स्लाइस सेक्शनिंग और धुंधला के लिए प्रोटोकॉल संवर्धन की अवधि के दौरान जगह ले जा रहा सेलुलर और morphological परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था। टुकड़ा संस्कृतियों हिप्पोकैम्पस DGCs परिपक्वता के दौरान अलग विकास के चरणों से गुजरती हैं और भविष्य वयस्क न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व के रूप में विभिन्न औषधीय एजेंटों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) MP Biomedicals 105478 Hazardous, Carcinogenic
Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size Thermo scientific  140660 Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality.
Conical Centrifuge tubes (sterile) Fisher Scientific 14-432-22
Dissector scissors (angled to side) Fine Science Tools  14082-09
Minimum essential medium (MEM) Gibco 11095; liquid Store at 4 °C
Eclipse Ni-U fluorescent microscope Nikon
Glue for tissue Krazy Glue KG585 Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC.
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) Gibco 14025-092 Store at 4 °C
Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) Gibco 16050-122 Make 50 ml aliquots and store at -20 °C
Kimwipes Kimberly-Clarke TW 31KYPBX
Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame)
Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) Fisher Brand FB0875712 and FB0875713A
Scalpel blades #11 Fine Science Tools 10011-00
Scalpel handle #3 Fine Science Tools 10003-12
Serological Pipettes Sorfa Medical Plastic Co. P8050
Standard Pattern forceps Fine Science Tools 11000-12
Sterile vacuum filter Thermo-Scientific 565-0020
Surgical Scissors Fine Science Tools 14054-13
Syringe driven filter unit Millipore-Millex SLGP033RS
Tissue chopper with moveable stage Stoelting  51425
Fine tip paintbrush

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
  2. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  3. Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  4. Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
  5. Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
  6. Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
  7. Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
  8. Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
  9. Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
  10. Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
  11. Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  13. Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
  14. Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
  15. Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
  16. Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
  17. Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
  18. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).
  19. Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
  20. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  21. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
  22. Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
  23. Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
  24. Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
  25. Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
  26. McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
  27. Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
  28. Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
  29. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  30. Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
  31. Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
  32. Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
  33. Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
  34. Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
  35. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  36. Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
  37. Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 97 प्रौढ़ न्यूरोजेनेसिस organotypic संस्कृतियों हिप्पोकैम्पस BrdU CldU immunohistochemistry प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी औषध विज्ञान
प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए Organotypic स्लाइस संस्कृति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mosa, A. J., Wang, S., Tan, Y. F.,… More

Mosa, A. J., Wang, S., Tan, Y. F., Wojtowicz, J. M. Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52353, doi:10.3791/52353 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter