Summary
Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.
Abstract
Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale nel cervello dei roditori utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo mantiene la morfologia caratteristica topografica dell'ippocampo pur consentendo l'applicazione diretta di agenti farmacologici per le sviluppo giro dentato dell'ippocampo. Inoltre, culture fetta possono essere mantenuti fino a 4 settimane e, quindi, permettono di studiare il processo di maturazione dei neuroni granulari neonati. Culture fetta consentono efficace manipolazione farmacologica di fettine ippocampali escludendo variabili complesse quali incertezze relative alla posizione anatomica profonda dell'ippocampo e la barriera ematoencefalica. Per queste ragioni, abbiamo cercato di ottimizzare culture fetta organotipiche specificamente per la ricerca neurogenesi postnatale.
Protocol
NOTA: Tutte le procedure sugli animali conformi alle linee guida per la salute e il benessere degli animali del Dipartimento di Medicina comparata presso l'Università di Toronto.
1. Preparazione di fettine di ippocampo
- Sterilizzare i seguenti strumenti che utilizzano l'autoclave secco a 125 ° C: manico bisturi (# 3) (2), pinze modello standard, di grandi dimensioni (1), Piccolo dissettore forbice (angolato a lato) (1), Micro cucchiaio (cucchiaio e piatto estremità spatola) (1), Micro-spatole (arrotondati e arrotondati estremità rastremate) (2), pennello fine (1), Fuoco lucidato pipetta Pasteur (2), le piazze garza, 2 x 2 pollici (5).
- Quando sterili, mettere gli strumenti in un contenitore sterile e mantenere coperta fino al momento dell'uso. Immediatamente prima dissezione, immergere gli strumenti in una soluzione di etanolo al 70%.
- Preparare una piastra di coltura da 6 pozzetti con inserto cultura prima di iniziare la procedura di dissezione aggiungendo 1 ml di terreno di coltura / pozzetto e memorizzare la piastra nella incubatore a 35 ° C unand 5% di CO 2.
2. Disporre strumenti di dissezione in cappa sterile a flusso laminare
- Spruzzare la cappa a flusso laminare con il 70% di etanolo e rimuovere strumenti di dissezione sterili da alcol. Lasciare gli strumenti per asciugare mentre riposa su una piastra di Petri sterile per evitare il contatto tra l'alcol e il tessuto cerebrale sezionato.
- Deposito 5-7 ml di soluzione di dissezione ghiacciata sterilizzato in 2 grandi piastre sterili. Un piatto sarà raffreddare e pulire la testina (sporca), l'altro per il raffreddamento e il risciacquo del cervello scavato (pulito). Inserire un filtro di carta sterilizzata in uno dei coperchi piatto Petri per sezionare il cervello.
- Inserire un piccolo, carta da filtro sterilizzato in una piccola capsula di Petri coperchio per sezionare l'ippocampo. Deposito 3-5 ml di soluzione di dissezione ghiacciata sterilizzato in 2 piccoli, piastre sterili. Un piatto terrà l'ippocampo scavato, si terrà sezioni durante la separazione delle sezioni di ippocampoal microscopio dissezione.
- Preparare il chopper tessuto con nastro adesivo un pezzo di carta da filtro sterile per la fase di taglio e il montaggio di una lama di rasoio sterile. Bagnare la carta da filtro con una soluzione sterilizzata dissezione.
- Spruzzare un bio-bag pulito con alcool e collocarlo in flusso laminare banco pulito.
3. ippocampale Dissection
- Spruzzare il ratto pup P7 Sprague Dawley con il 70% di etanolo al di fuori del banco pulito flusso laminare e decapitarlo rapidamente l'animale con grandi forbici chirurgiche sterili all'interno del banco a flusso laminare. Lasciate che la testa cadere nella soluzione dissezione ghiacciata in una delle piastre di Petri.
- Nella capsula di Petri, lavare via il sangue e velocemente trasferire la testa di carta da filtro sterilizzato, lato ventrale verso il basso.
- Usando il bisturi, tagliare lungo la superficie dorsale nel piano sagittale per esporre il cranio sottostante. Tagliare attraverso la pelle, ma non l'osso sottostante, che è morbido e facilmente penetrabili in ratti di tla sua età. Mettere da parte il bisturi "sporco" e non usare su tessuto cerebrale.
- Utilizzando le piccole forbici dissettore (angolato a lato) e pinze, taglio aperto il cranio lungo sutura sagittale del cranio di bregma, il punto anatomica sul cranio dove la sutura coronale è intersecato perpendicolarmente dalla sutura sagittale. Usare pinze per tirare lembi cranio alto e lontano dalla linea mediana del cranio.
- Posizionare il micro cucchiaio sul lato inferiore del cervello, sotto il tronco cerebrale, per sollevare delicatamente il cervello dal cranio. Sollevare il cervello per esporre i nervi ottici e bulbo olfattivo sulla superficie basale del cervello. Tagliare queste strutture con piccole forbici per staccare completamente il cervello da teschio. Rimuovere e trasferire il cervello integro e il loro piatto Petri grande contenente soluzione dissezione ghiacciata.
- Utilizzando il micro cucchiaio, trasferire il cervello di un piccolo coperchio Petri-piatto contenente carta da filtro sterile. Con una pipetta Pasteur sterile, lavare il cervello con qualche goccia di dissecting soluzione per mantenere il tessuto umido.
- Utilizzando un "clean" bisturi tagliare i due emisferi a parte. Trasferire l'emisfero sinistro torna a grande piatto di Petri con micro cucchiaio e posizionare emisfero lato pia dalla soluzione di dissezione ghiacciata per un uso successivo.
- Guarda la faccia mediale dell'emisfero destro e identificare il fornice bordo, una fascia importante della sostanza bianca lungo il bordo mediale dell'ippocampo. Usando un bisturi sterile, fare un taglio sagittale attraverso il fornice, ma prendersi cura perché solo 0,5 cm di punta bisturi saranno sufficienti per tagliare il fornice.
- Usando 2 micro-spatole, rimuovere il primo dell'ippocampo da emisfero destro mettendo la destra-spatola su tronco cerebrale e sollevando la corteccia sovrastante con la spatola sinistra. Sollevare delicatamente la corteccia per rivelare il ventricolo laterale e la superficie mediale dell'ippocampo. Una linea curva bianca, la fimbria, dovrebbe essere visibile.
- Allineate la curvatura della spatola con la curvatura della fimbria e premere delicatamente la spatola sotto la fimbria. Far scorrere la spatola sinistra e corsa lungo l'asse rostrale-caudale e poi sollevare spatola in direzione dorsale per rimuovere ippocampo.
- Trasferire l'ippocampo di un piccolo piatto ° 2 Petri con una soluzione di dissezione ghiacciata. Ripetere la stessa procedura sul emisfero sinistro per rimuovere l'ippocampo sinistro.
- Usando una micro spatola, trasferire accuratamente l'ippocampo alla fase chopper tessuti. Disporre loro adiacenti e parallele fra loro e perpendicolari all'asse della lama chopper. Utilizzare un pennello per posizionare il tessuto e aggiungere qualche goccia della soluzione dissezione sulla parte superiore del ippocampi.
- Tagliare il tessuto in 400 micron fette senza pause per rimuovere singole fette (di solito non si atterranno alla lama). Dopo tutto ippocampo è stato tagliato, utilizzare il pennello per trasferire delicatamente le sezioni per un piccolo piatto ° 2 Petri con una soluzione dissezione.
- Sotto annuncioissecting microscopio, separare accuratamente le fette galleggianti con amicro-spatola e pennello.
- Rimuovere la piastra di coltura pre-preparati con inserto cultura dal termostato e posto in una cappa a flusso laminare.
- Usando una pipetta Pasteur fuoco lucido, disegnare 4-5 fette nelle fette pipetta e trasferire alla superficie apicale della membrana inserto cultura. Quindi, regolare il posizionamento con un pennello e lasciare uno spazio tra le singole sezioni e il bordo dell'inserto cultura.
- Usando una pipetta Pasteur sterile, rimuovere la soluzione dissezione in eccesso dalla superficie apicale di membrana.
NOTA: Durante la rimozione soluzione evitare di tracciare sezioni di tessuto nella pipetta. In alternativa, utilizzare una pipetta regolare (P200 o P1000), con punte per pipette sterilizzate per rimuovere lentamente soluzione. - Posizionare la piastra di coltura con siero contenente terreno di coltura e le fettine di ippocampo posteriore in incubatore a 35 ° C e 5% di CO 2.
NOTA: Se le chiamate esperimentoper la generazione di colture da più animali, pulire accuratamente il banco pulito flusso laminare tra dissezioni. Strumenti Torna a soluzione alcolica e sostituire tutti Petri-piatti, filtri di carta e lame di rasoio sterile prima della seconda dissezione.
4. Alimentazione e Mantenimento Organotipica Slices
- Culture mangimi in un banco pulito flusso laminare sterile.
- Eseguire la prima alimentazione delle sezioni coltivate due giorni dopo la dissezione. Aspirare il terreno vecchia cultura usando pipetta di vetro sterilizzati.
- Utilizzare sterile 5 ml pipetta sierologica aggiungere 1 ml di fresco sterili, medium, il siero contenente ai pozzetti.
- Sostituire delicatamente l'inserto cultura e prendersi cura di eliminare eventuali bolle d'aria che possono essersi formate sotto la superficie della membrana.
- Dopo la prima alimentazione, cambiare media ogni altro giorno.
5. incubazione fette di tessuto con timidina Analoghi etichettare Newborn Neuroni
- Per studiarela maturazione e l'integrazione dei granuli dentato dell'ippocampo, incubare le fette organotipiche con un analogo della timidina, come ad esempio Bromodeossiuridina (BrdU) o Chlorodeoxyuridine (CldU). Qui, usiamo CldU causa della sua elevata solubilità in soluzione salina.
- Dopo 3DIV, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml soluzione madre CldU in soluzione fisiologica a 1 ml di terreno di coltura per una concentrazione finale di 10 mg / ml. Se viene utilizzato BrdU, correggere la concentrazione delle differenze di peso molecolare. Aggiungere mezzo con CldU ai pozzetti cultura e incubare il tessuto con CldU contenenti media per 2 ore a 35 ° C.
- Dopo 2 h di incubazione a 35 ° C, rimuovere il terreno contenente CldU e sostituirlo con il mezzo d'alimentazione normale per riprendere programma di alimentazione normale (descritto sopra).
6. I tessuti Fissazione e bagagli
- Stabilire un calendario per l'applicazione di trattamenti e fissaggio campioni di tessuto prima di avviare esperimenti di coltura (Figura 2b). <li> A un giorno prestabilito post-dissezione, preparare quanto segue in una cappa di laboratorio: un bicchiere 10-50 ml contenente 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato (PBS); un bicchiere vuoto per mezzo di coltura scartato; pinzetta; e una pipetta 1000 ml con punte monouso.
- Rimuovere la piastra di coltura (s) dalla camera di incubazione e trasferimento in una cappa aspirante. Inclinare singoli inserti piastre e con una pinza. Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere terreno di coltura e trasferirla in un bicchiere di smaltimento. Inclinare la piastra di coltura con un angolo per contribuire a garantire che tutti i medium di coltura viene rimosso.
- Termina rimozione mezzo per una piastra di coltura per volta. Quando medio è stato rimosso, aggiungere 1 ml di 4% PFA per ogni cultura bene e sigillare bene piatto con parafilm. Ripetere l'operazione per il maggior numero di piastre di coltura come piatti necessari e trasferimento in frigorifero a 4 ° C per 24 ore.
- Dopo 24 ore, di preparare le seguenti in una cappa aspirante: 10-50 bicchiere ml contenente 0,1% di sodio azide in PBS; un vuotobecher per scartato PFA (seguire le precauzioni di sicurezza quando scartando sostanze tossiche); pinzetta; e 1.000 ml pipetta con punte monouso.
- Seguire la procedura descritta in 6.4 per l'aggiunta di PFA, ma aggiungere 1 ml di PBS con sodio azide invece. Una volta completamente trasferita, piastre di tenuta e per un utilizzo futuro avvolgendo bordi in parafilm e conservare in frigorifero a 4 ° C.
7. sezionamento del tessuto per immunoistochimica
- Eseguire il tessuto sezionamento con un vibratome. La seguente serie di passi aiutano a massimizzare la resa di sezioni di tessuto utilizzabili da colture organotipiche.
NOTA: Immediatamente dopo dissezione dell'ippocampo e placcatura di fette, il tessuto ha uno spessore di circa 400 micron. Tuttavia, dopo 2-3 settimane nella camera di incubazione, fette di tessuto inizieranno ad appiattirsi, causando uno spessore sezione finale di 150-300 micron. - Preparare le seguenti voci alla sezione di tessuto coltivato: una # 11 bisturi blade e gestire, una piastra di Petri di vetro contenente ghiaccio freddo PBS, un micro-dissezione forcipe, e una fase di taglio vibratome pulito per montare il tessuto.
- Utilizzare un bisturi per tagliare attentamente lungo il perimetro della membrana inserto circolare in modo che possa essere staccato dalla custodia inserto in plastica. Lasciare ampio spazio tra la fetta colta e il bisturi.
- Trasferire la membrana inserto distaccato di una piastra di Petri contenente PBS. Dopo lavaggio in PBS, utilizzare pinze per trasferire la membrana alla fase di montaggio vibratome.
- Quindi, utilizzare il bisturi per eliminare l'eccesso di membrana che circonda le fette in coltura e tagliare il materiale in eccesso per creare bordi puliti. Questo passaggio garantirà la membrana è piana e può facilmente aderire alla superficie di taglio.
- Mettere 1-2 gocce di colla sul palco taglio vibratome e diffondere in strato uniforme con un ago 22 G. Distribuire adesivo in una forma rettangolare, con il lato lungo parallelo alla lama di taglio del vibratome. Eseguire questo passaggiorapidamente, per evitare che l'adesivo si secchi.
- Utilizzare pinze per trasferire la membrana rifilato contenente fettine di ippocampo per la fase di taglio e delicatamente posizionare la membrana sulla colla e assicurarsi che non vi siano bolle d'aria.
- Come la supercolla asciuga, trasferire il palco vibratome con la membrana incollato torna alla piastra di Petri contenente PBS. Preparare la lama vibratome e 48 pozzetti contenente azide di sodio per memorizzare sezioni di tessuto.
- Utilizzare il vibratome di generare 30 micron sezioni del tessuto fetta organotipica e trasferimento in un 48 pozzetti contenente sodio azide per lo stoccaggio e la successiva colorazione immunoistochimica.
- Fare riferimento alle pre-esistenti protocolli per la colorazione immunoistochimica 26,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Determinare se colture organotipiche sarebbe adatto per la ricerca neurogenesi adulta richieste che soddisfano due criteri principali: 1) che le fette di mantenere le peculiari caratteristiche morfologiche delle fettine di ippocampo dopo 10-21 giorni in vitro (DIV), e 2) che DGCS neonati possono essere quantificati utilizzando tecniche di immunoistochimica standard, comunemente impiegati nella ricerca neurogenesi adulta. Per quanto riguarda il primo criterio, Figure 1A e 1B evidenziare la morfologia dell'ippocampo conservato. Tratti caratteristici come il giro dentato (DG), regioni CA1 e CA3 sono facilmente identificabili.
Per quanto riguarda il secondo criterio, Figura 1C (pannello superiore) fornisce un campione rappresentativo di DGCS neonati co-esprimono il marcatore endogena neuronale, Doublecortin (DCX) in verde e l'analogo della timidina esogeno, 5-cloro-2'-deossiuridina (CldU) in rosso. Questi neuroni si trovano nella sub-grzona anulare della dell'ippocampo DG. Al fine di garantire la corretta datazione nascita di neuroni, identifichiamo CldU + nuclei che co-express DCX. La microscopia confocale è necessaria in questa fase per identificare con successo neuroni doppio marcati perché le cellule candidati devono co-esprimono il marcatore di interesse per tutta la Z della cella. Dati campione ottenuto con tale rendimento doppio etichettatura circa il 17% dei CldU + cellule che esprimono DCX e il 35% delle CldU + cellule che esprimevano CABP a 12 giorni dopo l'applicazione CldU. Il valore DCX è molto simile, mentre il valore CABP è notevolmente inferiore a quello dato comparabile ottenuto in vivo 26. Condizioni di coltura di tessuti standard possono essere responsabili di una percentuale relativamente bassa di + cellule CABP.
Figura 2A illustra le fasi di dissezione che procedono da sinistra a destra (1-8): partendo con decapitazione di animali (1), la rimozione del cervello (2), trasferimento di cervello di dissezione soluzione ghiacciata (3), sezionareion dell'ippocampo da sinistra e emisferi destro (4), stoccaggio di ippocampi sezionato in soluzione dissezione ghiacciata (5), trasferendo entrambe ippocampi a Stoelting chopper tissutale e sezionamento a 400 micron (6), la separazione delle singole fette al microscopio da dissezione (7), e la placcatura del tessuto su inserti di coltura cellulare (8). Procedendo in questo modo aiuta a mantenere un ambiente sterile tutto il processo di coltura.
Infine, dal momento che il tempo-corso di sviluppo è una caratteristica importante della neurogenesi ippocampale, abbiamo scelto di incubare le fette coltivate con CldU esattamente 2 ore dopo 3 DIV all'etichetta divisione delle cellule staminali neurali. La finestra di tempo stretto per somministrazione CldU stato scelto per migliorare la probabilità che i neuroni etichettati costituivano una popolazione omogenea di cellule approssimativamente alla stessa fase di maturazione (Figura 2). Per quanto riguarda l'etichettatura CldU, una caratteristica fondamentale della neurogenesi per la funzione ippocampale è che a un gitempo ven vi è una popolazione eterogenea di cellule granulari dentate in varie fasi di maturazione 27,28.
Figura 1. Esempio di fotografie al microscopio a fluorescenza evidenziando conservati morfologia dell'ippocampo. (A) fetta Organotipica da 12 giorni dopo la dissezione immunolabeled per CldU (verde) e CABP (rosso), 20x immagine composita aria (bar Scala = 500 micron). (B) del campione al microscopio della fetta da 21 giorni successivamente dissezione immunolabeled per CldU ( rosso) e DCX (verde) (opposto colore-schema della figura 1A), 20x dell'aria (Scala bar = 100 micron). (C) del pannello superiore. Rappresentante confocale microscopio fotografia di cellule co-esprimono ClXdU e endogena immaturo marcatore neuronale, DCX. DGCS co-esprimono DCX (verde) e CldU (rosso) sono considerati come i neuroni neonati. La freccia indica un doppio-labecondotto cellule in fase iniziale di sviluppo, 40X-immersione in olio (Scala bar = 10 micron). Cellule simili sono stati osservati 10 giorni post-etichettatura in vivo 26. Pannello inferiore. Immagini fluorescenti rappresentative di cellule co-esprimono CldU (verde) e CABP (rosso). La freccia indica una cella doppia etichetta, 40X microscopio a fluorescenza (Scala bar = 10 micron). Giro DG-dentato. GCL-granuli strato di cellule. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. (A) Illustrazione dei passaggi sequenziali per dissezione dell'ippocampo in flusso laminare banco pulito. La linea tratteggiata indica "sterili" (a sinistra) e "sterile" (a destra) zone dell'area dissezione. (B) Timeline per organoculture fetta typic preparate da cuccioli di ratto P7 (avvio). Notazioni indicano applicazione analogica timidina, CldU *, e "trattamento", che possono includere diversi agenti farmacologici adatti alla domanda sperimentale. Le culture sono fissati con paraformaldeide in tempi di permanenza desiderati dall'applicazione CldU (Fix Culture). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Nome del reagente / attrezzature | Azienda | Numero di catalogo | Commenti / Descrizione |
| 5-cloro-2'-deossiuridina (CldU) | MP Biomedicals | 105.478 | Pericolosi, cancerogeni |
| Colture cellulari inserisce, 30 mm di diametro, 0,4 micron pDimensioni ore | Thermo Scientific | 140660 | Rivestimento delta Nuclon su questi inserti fornisce una migliore aderenza dei tessuti e migliora la qualità fetta. |
| Conico Centrifuga tubi (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Forbici dissettore (angolato a lato) | Strumenti Belle Scienza | 14082-09 | |
| Mezzo essenziale minimo (MEM) | Gibco | 11095; liquido | Conservare a 4 ° C |
| Microscopio a fluorescenza Eclipse Ni-U | Nikon | ||
| Colla per tessuti | Krazy Glue | KG585 | Utilizzare quantità minima di colla per ottenere l'adesione come qualsiasi tessuto esposto a colla sarà inutilizzabile per IHC. |
| Balanced Salt Solution di Hank (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Conservare a 4 ° C |
| Horse Serum inattivato al calore (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Fare 50 ml aliquote e conservare a -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Pipette di vetro modificati (fondo della pipetta Pasteur rimosso e bordo lisciato con Bunsen fiamma) | |||
| Petri (100 mm x 15 mm) e (60 mm x 15 mm) | Fisher Marca | FB0875712 e FB0875713A | |
| Lame bisturi # 11 | Strumenti Belle Scienza | 10011-00 | |
| Manico bisturi # 3 | Strumenti Belle Scienza | 10003-12 | |
| Pipette sierologiche | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Forcipe modello standard | Strumenti Belle Scienza | 11000-12 | |
| Filtro a vuoto sterile | Thermo Scientific- | 565-0020 | |
| Forbici chirurgiche | Strumenti Belle Scienza | 14054-13 | |
| Siringa guidato unità filtro | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper con palco mobile | Stoelting | 51425 | |
| Belle punta pennello |
Tabella 1. Materiali e reagenti
| Soluzione | Ingredienti e le istruzioni |
| Soluzione Dissection | a) 500 ml di Hank &# 39; s soluzione salina bilanciata (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| b) Aggiungere 2,2 g D-glucosio. | |
| c) Aggiungere 0,5 g di saccarosio. | |
| d) Aggiungere 1,787 g HEPES. | |
| e) Mescolare per 30 minuti con piastra di agitazione magnetica. | |
| f) Uso pHmetro garantire soluzione ha un pH finale = 7,4. | |
| g) Utilizzare osmometro per garantire osmolalità finale = 320-330 mOsm. | |
| h) Sterilizzare soluzione in cappa a flusso laminare sterile filtrazione sotto vuoto attraverso filtri 0,2 micron. | |
| -Siero contenente terreno di coltura: 100 ml Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco 11095), 50 ml di siero di cavallo (Gibco 16.050-122), 50 ml HBSS. | a) Aggiungere il seguente a 50 ml HBSS in bicchiere e sciogliere in 37 ° C bagnomaria. Mescolare con agitatore magnetico. |
| b) 1,3 g di D-glucosio. | |
| c) 36 mg MgSO 4. | |
| d) 17,6 mg di acido ascorbico. | |
| e) 5 ml di 2M CaCl 2 soluzione stock. | |
| f) Aggiungere 50 ml antibiotici antimicotici (100x magazzino, sterile; GIBCO 15.140-062). | |
| g) 1 mg / ml di insulina. | |
| h) Sterilizzare sopra soluzione mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 micron. | |
| i) Soluzione miscela filtrata con 100 ml MEM e 50 ml di siero di cavallo in cappa a flusso laminare. | |
| j) Fare 50 ml aliquote in provette coniche sterili (Fisher Scientific-14-432-22) e conservare a 4 ° C. | |
| 4% soluzione Paraformaldeide fissativo. | a) Preparare tampone fosfato salino (PBS) aggiungendo la seguente per 300 ml di H 2 O distillata e miscelazione sulla piastra di agitazione magnetica. |
| b) Aggiungere 2,7 g di sodio fosfato monobasico (NaH 2 PO 4). | |
| c) Aggiungere 11,5 g di sodio phosphate bibasico (NaHPO 4). | |
| d) Aggiungere 9,0 g di cloruro di sodio (NaCl). | |
| e) Scaldare circa. 700 ml di H 2 O distillata a 55 ° C e spegnere il calore. | |
| f) Aggiungere 40 g paraformaldeide (PFA) e mescolate in 700 ml di acqua con piastra di agitazione magnetica. | |
| g) combinare il PBS (a, b, c, d), e soluzioni PFA (e, f), regolare il pH a 7,4 e superiore fino al volume finale di 1000 ml. | |
| 0,1% di sodio azide Solution | a) Aggiungere 1 g di azide di sodio in polvere (NaN 3) 1 L di soluzione di PBS. |
| b) Mix con piastra di agitazione magnetica e conservare a 4 ° C. |
Tabella 2. Soluzioni e Ricette
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dopo CldU (o BrdU) amministrazione, la linea temporale di applicazione di agenti farmacologici può essere scelto a bersaglio DGCS neonato durante particolari finestre di sviluppo. Ad esempio, un agente ipotetico può essere applicato durante la seconda settimana post-iniezione CldU, che si propone di coincidere con l'età di neuroni immaturi che sono in fase di sviluppo in cui viene depolarizzante GABA. Futuri studi che utilizzano questo protocollo potrebbe adattare l'agente farmacologico e la finestra di esposizione di "personalizzare" l'approccio alla questione sperimentale di interesse specifico.
Un criterio importante per la determinazione di tale culture fetta sono un valido modello per la ricerca neurogenesi postnatale è la capacità di macchiare e quantificare neuroni neonati nell'ippocampo. I due risultati principali a sostegno di questa ipotesi erano che l'analisi microscopica ha rivelato reattività immunoistochimica per CldU e marcatori proteici endogeni negli stessi neuroni.Se utilizzato in combinazione con marcatori neuronali endogeni, analoghi della timidina quali BrdU e CldU sono strumenti potenti per la ricerca neurogenesi.
L'applicazione di analoghi della timidina, come BrdU, tramite iniezioni intraperitoneali è comunemente utilizzato nella ricerca neurogenesi ai neuroni sottoposti etichette fase S della mitosi 29. Approcci simili possono essere impiegati in colture organotipiche con alcune modifiche. Ad esempio, gli studi precedenti somministrati BrdU (0,5 micron per 3 giorni) per affettare colture dopo ~ 14 DIV 18. Analizzando i dati presentati in tale documento rivela che alcuni dei parametri utilizzati per quantificare neurogenesi non impiegare le tecniche standard utilizzate nel campo neurogenesi, cioè, la quantificazione stereologica 30. Ad esempio, quando riferisce il co-espressione di BrdU e neuronali-nuclei (NeuN) cellule positive, indicano un numero totale di cellule "per la cultura" invece di fornire informazione relativa zona di tessuto o di volume.
Studi successivi hanno migliorato su questo metodo sezionando le fette in coltura per 10 singole sezioni micron, che hanno migliorato i protocolli di visualizzazione e di immunoistochimica, consentendo anticorpi permeano più facilmente i campioni di tessuto 31. Bunk et al. 28 hanno riportato doppia marcatura con BrdU (10 micron per 3 giorni), come il numero di cellule co-etichettati per 10 micron sezione, ma non ha fornito informazioni sulla zona comparativo o specifica regione ippocampale studiato cioè, CA1, CA3 o DG. Inoltre, l'analisi delle immagini di microscopia confocale e fluorescenza non dimostra in modo convincente che la morfologia dell'ippocampo è stata mantenuta con successo.
È importante sottolineare che entrambi gli studi hanno utilizzato un periodo di esposizione BrdU di 3 giorni, che si è associato inconvenienti. Etichettatura BrdU ha notevolmente aiutato studi neurogenesi, consentendo agli investigatori di monitorare le cellule nuove divise in VAregioni cerebrali rious. Tuttavia, la tossicità BrdU è stato ben caratterizzato. Il suo uso è stato dimostrato di causare anomalie morfologiche e comportamentali 32,33 ed effetti negativi sul ciclo cellulare, la differenziazione, la migrazione e la sopravvivenza delle cellule staminali neurali 34-36. La somministrazione prolungata di BrdU negli studi sopra menzionati potrebbe essere introdotto variabili confondenti che hanno alterato la fisiologia dell'ippocampo e mentre alcuni effetti collaterali da amministrazione BrdU possono essere inevitabile, il nostro protocollo sperimentale è stato progettato per limitare alcune di queste complicazioni incubando il tessuto con analoghi della timidina per 2 hr. Inoltre, abbiamo scelto di utilizzare CldU invece di BrdU perché ha mostrato una migliore solubilità di BrdU durante la preparazione della soluzione di incubazione. Anche se il protocollo 3 giorni può essere utile per alcuni progetti sperimentali per esempio, massimizzando l'etichettatura delle cellule proliferanti, questo protocollo 2 ore ha un vantaggio di impulsi etichettatura di una relativamente piccola populazione di cellule che possono essere studiati in tempi di sopravvivenza desiderati (vedi Figura 2B).
Confrontando il livello di produzione neuronale a seguito due diversi metodi di applicazione BrdU, Namba et al. Ha dato un contributo importante per le tecniche di etichettatura in culture fetta organotipica 37. Gli autori intraperitoneale rispetto (IP) iniezione di BrdU (50 mg / kg) in giorno 5 (P5) ratti postnatali con colture in vitro che hanno ricevuto un terreno di coltura contenente 1 mM BrdU per 30 min immediatamente dopo espianto di tessuto. Riferiscono differenza statisticamente significativa tra in-vivo e in vitro precoce iniezione BrdU in in tessuti in coltura. Gli autori non hanno presentato le immagini chiare che delineano la struttura dell'ippocampo, ma riportano immunoreactivity BrdU come percentuale di cellule totali nello strato di cellule dei granuli. Mentre impiegano conteggio stereologica, fornendo una misura per zona o il volume sarebbe utile. Generalmente, Gli studi citati presenti colture organotipiche come approfondito dettaglio di postnatali culture fetta dell'ippocampo, con le applicazioni per lo studio della neurogenesi e perturbazioni farmacologiche. Usando questa tecnica, fettine ippocampali possono essere mantenuti fino a 21 giorni in vitro (DIV) e farmaci possono essere aggiunti al mezzo in qualsiasi punto del periodo di coltura per studiare l'effetto sulla neurogenesi.
Il nostro obiettivo era quello di etichettare una discreta popolazione relativamente omogenea di DGCS fornendo una breve 'impulso' applicazione CldU per 2 ore. Una strategia comunemente impiegata per studiare la neurogenesi implica identificazione della fase di maturazione del neurone tramite colorazione immunoistochimica per vari marcatori endogeni con un analogo della timidina. Confocale e microscopia a fluorescenza ha confermato la presenza di nuclei che incorporavano le CldU timidina analogici e sono stati quindi sottoposti attivamente mitosi durante il periodo di coltura. Figura 2 in vivo possono essere adattati per culture fetta.
In particolare, un metodo comunemente utilizzato nella ricerca neurogenesi è effettuare colorazione immunoistochimica per la proteina associata ai microtubuli, DCX, che è prevalentemente espressa nei neuroni immaturi di giorno 3-21 e il marcatore neuronale maturo, calbindin (CABP), che è pienamente espresso seguente 28 giorni dopo la mitosi. Il fenotipo delle cellule CldU + è stato determinato utilizzando questi endogena marcatori 26.
Miglioramento dei metodi per mantenere le culture fetta per periodi più lunghi possono avere l'ulteriore vantaggio di consentire più CldU + neuroni per raggiungere la maturità, CABP + stage. Attualmente, un limite dell'approccio coltura organotipica è che il tessuto cambia continuamente durante il periodo di coltura. Ad esempio, subito dopo dissezione ippocampale e placcatura di fette, TISSUE ha una larghezza di circa 400 micron. Tuttavia, dopo 2-3 settimane nella camera di incubazione, fette di tessuto inizieranno a sottile, che si traduce in una larghezza finale tra 250-350 micron. Ciò limita la quantità di tessuto che può essere utilizzato per immunoistochimica e dovrebbe essere considerato quando si pianifica quanti animali da utilizzare per un progetto. Ulteriori esperimenti aiuteranno caratterizzano i cambiamenti funzionali nella fisiologia dell'ippocampo che si verificano in vitro.
Il protocollo per il sezionamento e la colorazione fettine di ippocampo è stato sviluppato per analizzare i cambiamenti cellulari e morfologiche che si svolgono durante il periodo di coltura. Culture fetta offrono l'opportunità di testare l'effetto di vari agenti farmacologici come Dgcs dell'ippocampo passano attraverso fasi di sviluppo distinte durante la maturazione e rappresentano uno strumento prezioso per i futuri studi neurogenesi adulta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
