Abstract
सेल प्रत्यारोपण के उपचारात्मक प्रभाव में सुधार करने के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित, इंजेक्शन spheroids के प्रत्यारोपण प्रणाली विकसित की गई थी। सेल spheroids एक thermosensitive बहुलक के साथ लेपित micropatterned प्लेटों पर एक संस्कृति प्रणाली में तैयार कर रहे हैं। Spheroids की संख्या एक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) मैट्रिक्स द्वारा लेपित हैं कि गैर चिपकने वाला क्षेत्रों से घिरा नियमित रूप से एक दो आयामी तरीके से तैनात कर रहे हैं कि 100 माइक्रोन व्यास की कोशिका आसंजन क्षेत्रों के लिए इसी प्लेटों पर बनते हैं। spheroids आसानी से प्लेटों के तापमान को कम करके एक तरल निलंबन के रूप में ठीक किया जा सकता है, और उनकी संरचना अच्छी तरह से (27 जी) के ऊपर एक पर्याप्त बड़ी क्षमता के साथ इंजेक्शन सुई के माध्यम से उन्हें गुजर द्वारा बनाए रखा है। आनुवंशिक संशोधन अंडाकार आकृति संरचना में बाधा पहुँचा के बिना कोशिकाओं में जीन को शुरू करने में सक्षम है, जो मूल गैर वायरल जीन वाहक, पॉलीप्लेक्स nanomicelle, का उपयोग करते हुए जीन अभिकर्मक द्वारा हासिल की है। रस्मी के लिएएल्बुमिन अभिव्यक्ति द्वारा संकेत के रूप में एक luciferase व्यक्त जीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट आरे hepatocyte spheroids, luciferase लिए sustainably, संरक्षित hepatocyte समारोह के साथ साथ, प्रतिरोपित पशुओं में प्राप्त किया जाता है। इस प्रणाली के mesenchymal स्टेम सेल सहित सेल प्रकार की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
कोशिका प्रत्यारोपण चिकित्सा विभिन्न असभ्य रोगों के इलाज के लिए व्यापक ध्यान आकर्षित किया है। प्रतिरोपित कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं कि गतिविधि और bioactive कारकों में से आधा जीवन एक कोशिका प्रत्यारोपण प्रणाली के बेहतर चिकित्सीय प्रभावशीलता के लिए आवश्यक हैं। प्रत्यारोपण के लिए पहले कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन को विनियमित और bioactive कारकों का स्राव सहित सेलुलर कार्यों, हेरफेर करने के लिए एक लाभकारी तकनीक है। यह कोशिका मृत्यु या सेल गतिविधि के नुकसान से बचने के लिए कोशिकाओं के लिए एक अनुकूल माइक्रोएन्वायरमेंट बनाए रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है। सेल करने वाली सेल बातचीत अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं, जिसमें तीन आयामी (3 डी) अंडाकार आकृति सेल संस्कृति, (प्राथमिक hepatocytes से एल्बुमिन स्राव में सुधार और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से बहु-वंश भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए, उदाहरण के लिए, इस उद्देश्य के लिए MSCs का वादा किया है ) 1-7।
Spheroi के इस अध्ययन में, एक उपन्यास संयोजन प्रणालीडी संस्कृति और जीन अभिकर्मक आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल प्रत्यारोपण के लिए एक मंच के रूप में सेवा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अंडाकार आकृति कोशिकाओं को बनाने के लिए, micropatterned संस्कृति प्लेटों पर एक अंडाकार आकृति संस्कृति प्रणाली का इस्तेमाल किया जाता है। इन प्लेटों पर, 100 माइक्रोन व्यास की कोशिका आसंजन क्षेत्रों में नियमित रूप से एक दो आयामी तरीके से तैनात कर रहे हैं और एक खूंटी मैट्रिक्स 3 से लेपित गैर चिपकने वाला क्षेत्रों से घिरे हैं। कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या बोने करके, व्यास में 100 माइक्रोन के 3 डी spheroids की सरणियों micropatterned संस्कृति बिस्तर करने के लिए इसी का गठन कर रहे हैं।
spheroids एक thermosensitive बहुलक, पाली (आईएसओ-propylacrylamide) के साथ लेपित रहे थे कि thermosensitive सेल संस्कृति प्लेटों का उपयोग करके अपने 3 डी संरचना, (PIPAAm) 8-10 बाधा पहुँचा के बिना बरामद कर रहे हैं। micropatterned वास्तुकला thermosensitive प्लेटों पर निर्माण किया है (कस्टम निर्मित)। बस प्लेटों के तापमान को कम करके, spheroids संस्कृति बिस्तर से अलग और फैलाने कर रहे हैंफॉस्फेट में डी खारा (पीबीएस) बफर। इस प्रकार, 100 माइक्रोन की एक समान आकार के साथ spheroids की एक बड़ी संख्या एक इंजेक्शन के निलंबन के रूप में प्राप्त किया जा सकता है।
चित्रा 1. एक micropatterned प्लेट पर अंडाकार आकृति संस्कृति प्रणाली की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। जेनेटिक संशोधन मूल गैर वायरल जीन वाहक, पॉलीप्लेक्स nanomicelle का उपयोग कर जीन अभिकर्मक द्वारा हासिल की है। यह प्लास्मिड डीएनए (pDNA) और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) -polycation copolymers ब्लॉक 11 से बना है। ये एक विशेषता कोर-खोल संरचना, एक पेग खोल और गाढ़ा pDNA के एक भीतरी कोर से मिलकर उपचारात्मक उद्देश्यों के 11 के लिए कोशिकाओं में सुरक्षित और प्रभावी जीन शुरूआत की इजाजत दी है। थी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंएस आंकड़ा।
चित्रा न्यूक्लिक एसिड और खूंटी-ब्लॉक-polycation copolymers ब्लॉक के जटिल द्वारा गठित पॉलीप्लेक्स nanomicelle 2. संरचना। इस अध्ययन में, इस तकनीक का प्राथमिक लाभ अंडाकार आकृति संरचना nanomicelles द्वारा जीन अभिकर्मक के दौरान बाधित नहीं है। चूहे प्राथमिक hepatocyte spheroids की nanomicelle की मध्यस्थता transfections के बाद, लंबे समय तक transgene अभिव्यक्ति untransfected spheroids 12 के बराबर एक स्तर पर hepatocytes से निरंतर एल्बुमिन स्राव के साथ अधिक से अधिक एक महीने के लिए प्राप्त की है। spheroids से transgene अभिव्यक्ति और एल्बुमिन स्राव भी thermosensitive प्लेटों से वसूली के बाद रखा जाता है। यह nanomicelles सुरक्षित रूप से एचईपी की जन्मजात कार्यों आई बिना जीन शुरूआत की सुविधा कर सकते हैं कि स्पष्ट हैatocytes। इस प्रकार, जीन परिचय nanomicelles का उपयोग कर आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिका प्रत्यारोपण के लिए एक आशाजनक मंच है साथ thermosensitive micropatterned प्लेटों पर सुसंस्कृत अंडाकार आकृति कोशिकाओं के संयोजन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Protocol
सभी जानवरों के अध्ययन में टोक्यो विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति, टोक्यो, जापान के अनुमोदन के साथ आयोजित की गई।
1. सेल तैयार
- प्राथमिक hepatocytes के लिए, एक संशोधित दो कदम collagenase पाचन प्रक्रिया 13,14 से चूहे से hepatocyte अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें।
- Isoflurane के साथ साँस लेना संज्ञाहरण के तहत Sprague Dawley (एसडी) चूहों (पुरुष, 5 सप्ताह पुराने) anesthetize। चैम्बर के लिए isoflurane प्रदान करने के लिए एक संज्ञाहरण मशीन से जुड़े एक कक्ष में एक चूहा रखें। सो गिरने के बाद चूहे बाहर ले लो, और एक मुखौटा का उपयोग वेंटिलेशन के साथ ऑपरेटिंग मेज पर यह निर्धारित किया है। चूहे की शर्तों की जाँच करके 0.7 एल / मिनट - isoflurane के 0.4 लगभग प्रवाह को नियंत्रित। 8 ग्राम / एल सोडियम क्लोराइड से बना एक विशेष समाधान (NaCl), 400 मिलीग्राम / एल पोटेशियम क्लोराइड (KCl), 78 मिलीग्राम के साथ यकृत पोर्टल शिरा से Sprague Dawley (एसडी) चूहों (पुरुष, 5 सप्ताह की उम्र) के यकृत छिड़कना / एलसोडियम dihydrogen फॉस्फेट dihydrate (नाह 2 पीओ 4 · 2H ओ 2), 151 मिलीग्राम / एल disodium हाइड्रोजन फॉस्फेट dodecahydrate (ना 2 HPO 4 · 12H 2 ओ), 2.38 ग्राम / एल 2 [4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazinyl] ethanesulfonic एसिड (HEPES), 190 मिलीग्राम / एल इथाइलीन ग्लाइकॉल tetraacetic एसिड (EGTA), 350 मिलीग्राम / एल सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (3 NaHCO), और 900 मिलीग्राम / एल ग्लूकोज।
- जिगर के माध्यम से collagenase समाधान प्रसारित।
नोट: समाधान 500 मिलीग्राम / एल collagenase, 9.8 ग्राम / एल हांक बफर नमक, से बना है 2.38 ग्राम / मिलीलीटर HEPES, 556 मिलीग्राम / एमएल कैल्शियम क्लोराइड हाइड्रेट (2 CaCl · एच 2 ओ), 350 मिलीग्राम / एल 3 NaHCO, और पीएच के साथ 50 मिलीग्राम / एल trypsin अवरोध करनेवाला, 7.2 करने के लिए समायोजित। - ध्यान से जिगर निकालें, और एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर एक डिश पर धीरे यह कीमा, जोड़ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक (DMEM), और एक 100 माइक्रोन के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टरनायलॉन जाल। अतिरिक्त मलबे को हटाने के लिए, 1 मिनट के लिए 20 × जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। इस चरण में, hepatocytes सतह पर तैरनेवाला में हैं।
- दो बार centrifugation कदम (तीन centrifugations की कुल) दोहराएँ। 3 मिनट में एक गोली के रूप में उन्हें ठीक करने के लिए अंत में, 50 × छ पर hepatocytes अपकेंद्रित्र।
- 10% FBS के साथ पूरक DMEM से बना एक विशेष संस्कृति के माध्यम में 4 × 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता, 1% पेन Strep-भरमार (PSQ), 1% डाइमिथाइल sulfoxide को hepatocytes पुनः निलंबित (DMSO), 0.1 μmol / एल dexamethasone, / एमएल इंसुलिन 0.5 माइक्रोग्राम, 10 mmol / एल निकोटिनामाइड, 0.2 mmol / एल phosphorylated एस्कॉर्बेट (एएससी-2P), और 10 एनजी / एमएल मानव epidermal वृद्धि कारक (hEGF) 15। यह विशेष मध्यम इन विट्रो शर्तों के तहत यकृत समारोह के संरक्षण के लिए अनिवार्य है।
- चूहे MSCs प्राप्त करने के लिए, isoflur के अत्यधिक प्रशासन द्वारा Sprague Dawley (एसडी) चूहों (पुरुष, 5 सप्ताह पुराने) euthanizeane। Femurs और tibias विभाजित है, और DMEM के 10 एमएल के साथ 10% FBS के साथ पूरक इसे बाहर निकलवाने की हड्डी की शाफ्ट में एक 22 जी सुई डालने से हड्डी marrows इकट्ठा। एक 100 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से छानने का काम से कोशिकाओं को इकट्ठा।
- DMEM 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त का उपयोग कर 10 सेमी संस्कृति व्यंजन पर कोशिकाओं बीज। अंडाकार आकृति प्रयोगों के लिए, 5 मार्ग के भीतर MSCs का उपयोग करें।
3 डी सेल spheroids की 2. तैयारी
- व्यावसायिक रूप से सेल चिपकने वाला क्षेत्रों में नियमित रूप से खूंटी मैट्रिक्स द्वारा लेपित गैर चिपकने वाला क्षेत्रों से घिरा हुआ है, एक दो आयामी तरीके से 100 माइक्रोन व्यास पर तैनात कर रहे हैं, जिस पर micropatterned संस्कृति प्लेटों, प्राप्त करते हैं।
नोट: सेल प्रत्यारोपण के लिए, thermosensitive बहुलक PIPAAm के साथ एक अतिरिक्त कोटिंग प्लेटों ठंडा करके सेल टुकड़ी की अनुमति आवश्यक है (5.1 कदम देखें)। तापमान के उतार चढ़ाव इस बहुलक रसायन शास्त्र में परिवर्तन पैदा कर सकते हैं8-10। 37 डिग्री सेल्सियस, PIPAAm कोशिकाओं सामान्य परिस्थितियों में संवर्धित किया जा करने की इजाजत दी, थोड़ा हाइड्रोफोबिक है। कोशिकाओं की सहज टुकड़ी के लिए अग्रणी बहुलक का तेजी से जलयोजन में 32 डिग्री सेल्सियस के परिणामों के नीचे के तापमान में कमी,। - अच्छी तरह से 5% सीओ 2 से युक्त एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें andincubate / 4 × 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर 12 अच्छी तरह से micropatterned प्लेटों पर hepatocytes या MSCs बीज। कोशिकाओं micropatterned आसंजन क्षेत्रों पर जमा है और धीरे धीरे 2 दिनों में गोल spheroids बनेगी।
नोट: एक monolayer संस्कृति में नियंत्रण कक्षों की तैयारी के लिए, सामान्य 12 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करें और ऊपर वर्णित के रूप में एक ऐसी ही प्रक्रिया के बाद, एक समान घनत्व में कोशिकाओं बीज।
पॉलीप्लेक्स Nanomicelles 3. तैयारी
- (खूंटी मेगावाट = 12 एक ब्लॉक copolymer, खूंटी PAsp (DET) से (पाली [(2-aminoethyl) -2-aminoethyl] aspartamide - - [एन एन ']) synthesize000, polymerization की डिग्री PAsp (DET) के खंड (डीपी) = 59), और पहले लेखकों 11 द्वारा वर्णित प्रक्रियाओं के बाद, केवल धनायनित खंड [PAsp (DET)] (डी पी = 55) से बना है कि एक homopolymer, 16, 17।
- 33.3 माइक्रोग्राम बहुलक एकाग्रता का समायोजन करके 10 मिमी HEPES बफर (पीएच 7.3) में अवशिष्ट एमिनो समूहों की एक समान दाढ़ अनुपात में खूंटी PAsp (DET) से ब्लॉक copolymer की एक मिश्रित समाधान और PAsp (DET) homopolymer तैयार करें / एमएल और क्रमश: 19.1 माइक्रोग्राम / एमएल,।
नोट: ऊपर वर्णित बहुलक सांद्रता भिन्न हो सकते हैं 10 एन / पी अनुपात की pDNA (एन / पी अनुपात) में फॉस्फेट समूहों के लिए दो पॉलिमर में कुल एमिनो समूहों की एक अवशिष्ट दाढ़ अनुपात के साथ nanomicelles तैयार करने के लिए प्रतिनिधि मान रहे हैं (विवरण के लिए, चर्चा देखें) सेल प्रकार और उद्देश्य पर निर्भर करता है। दो पॉलिमर के संयुक्त उपयोग endosomal बढ़ाने के लिए प्रभावी खूंटी परिरक्षण और PAsp (DET) के कामकाज को दोनों को प्राप्त कर सकते हैंभागने 18 (विवरण के लिए, चर्चा देखें)। - PCAG-जी एस प्लाज्मिड में संबंधित जीन व्यक्त खंड (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html क्लोनिंग द्वारा pDNA एन्कोडिंग Gaussia luciferase, GL4 luciferase, या erythropoietin तैयार करें ) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर सीएजी प्रमोटर / बढ़ाने के तहत अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए। एक सक्षम Escherichia कोलाई तनाव में pDNA बढ़ाना और एक endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए शोधन प्रणाली का उपयोग करते हुए यह शुद्ध। 10 मिमी HEPES बफर (पीएच 7.3) में 150 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान प्राप्त करने के लिए 260 एनएम के एक absorbance में pDNA एकाग्रता का निर्धारण।
- (मात्रा) के द्वारा 1: पॉलीप्लेक्स nanomicelles तैयार करते हैं, अच्छी तरह से pDNA समाधान (10 मिमी HEPES बफर में 150 माइक्रोग्राम / एमएल) और 2 के अनुपात में दो पॉलिमर के premixed समाधान मिश्रण।
Spheroids में 4. जीन अभिकर्मक
- (Hepatocytes कोशिकाओं को सेतेपरिपक्व spheroids के गठन के लिए अनुमति देने के लिए micropatterned प्लेटों पर बोने के बाद 72 घंटे के लिए या MSCS)। जीन अभिकर्मक के लिए, ताजा माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ संस्कृति के माध्यम से जगह के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए (pDNA के 10 माइक्रोग्राम से युक्त) पॉलीप्लेक्स nanomicelle समाधान के 100 μl जोड़ें। 24 घंटे के लिए nanomicelle समाधान के साथ ऊष्मायन जारी रखें।
- एक लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर एक नियंत्रण के लिए, लिपिड आधारित अभिकर्मक और nanomicelle विधियों दोनों के लिए बराबर होना pDNA की अंतिम खुराक को समायोजित 3. के एक वजन के अनुपात अभिकर्मक / pDNA पर अभिकर्मक के साथ pDNA समाधान मिश्रण।
सेल spheroids 5. रिकवरी और ट्रांसप्लांटेशन
- ठंडा पीबीएस के 200 μl के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें और बर्फ पर प्लेटें जगह है।
नोट: आम तौर पर, spheroids के बारे में 15 मिनट में अलग कर सकते हैं और प्रत्यारोपण के लिए एक निलंबन के रूप में बरामद किया जा सकता है। - धीरे 200 μl में कोशिकाओं महाप्राणइन विवो इंजेक्शन के लिए एक 23 जी या 27 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग निलंबन।
Transgene अभिव्यक्ति की 6. मूल्यांकन
- ठीक 24 बजे ताजा माध्यम के साथ की जगह के बाद मध्यम के 100 μl - संस्कृति के माध्यम में स्रावित Gaussia luciferase की अभिव्यक्ति के लिए इन विट्रो मूल्यांकन के लिए, 50 को इकट्ठा। एक वाणिज्यिक renilla luciferase परख प्रणाली और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक luminometer का उपयोग कर luciferase अभिव्यक्ति का अनुमान है।
नोट: Gaussia luciferase एक सप्ताह से भी अधिक के लिए संस्कृति के माध्यम में स्थिर बनी हुई है। इस प्रकार, transgene अभिव्यक्ति की वास्तविक समय की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए नमूना मध्यम इकट्ठा करने के लिए पहले ताजा एक साथ मध्यम बदलें। मध्यम परिवर्तन के समय को लचीला हो सकता है। - कोशिका प्रत्यारोपण निम्नलिखित मेजबान पशुओं में transgene अभिव्यक्ति के vivo मूल्यांकन के लिए, BALB / ग नग्न चूहों (महिला anesthetize, 7 सप्ताहisoflurane के साथ साँस लेना संज्ञाहरण के तहत पुराने)।
- चैम्बर के लिए isoflurane प्रदान करने के लिए एक संज्ञाहरण मशीन से जुड़े एक कक्ष में एक माउस रखें। सो गिरने के बाद माउस बाहर ले लो, और एक मुखौटा का उपयोग वेंटिलेशन के साथ ऑपरेटिंग मेज पर यह निर्धारित किया है। माउस की शर्तों की जाँच करके 0.5 एल / मिनट - isoflurane के 0.2 लगभग प्रवाह को नियंत्रित।
- पेट क्षेत्र के चमड़े के नीचे ऊतक में (4.1 में वर्णित) GL4 luciferase व्यक्त pDNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट spheroids युक्त सेल निलंबन के 200 μl इंजेक्षन।
- (150 मिलीग्राम / किग्रा, नसों में मार्ग) तुरंत डी luciferin इंजेक्शन लगाने के बाद, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार IVIS इमेजिंग प्रणाली का उपयोग luciferase अभिव्यक्ति को मापने।
- कोशिका प्रत्यारोपण की चिकित्सीय प्रभाव के मूल्यांकन के लिए, में erythropoietin एन्कोडिंग pDNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट spheroids युक्त सेल निलंबन के 200 μl इंजेक्षनपेट क्षेत्र के चमड़े के नीचे ऊतक।
- खून में 19 के लगभग 200 μl प्राप्त करने के लिए अवअधोहनुज खून बह रहा खून के नमूने ले लीजिए। एक खून का नमूना विश्लेषक का उपयोग हीमोग्लोबिन और हेमाटोक्रिट उपाय।
नोट: प्रत्यारोपण के लिए सेल नंबर प्लेट पर वरीयता प्राप्त संख्या से नियंत्रित किया जाता है। दुर्भाग्य से, यह spheroids अंदर संख्या मापा नहीं जा सकता क्योंकि सटीक सेल नंबर निर्धारित करने के लिए मुश्किल है।
- खून में 19 के लगभग 200 μl प्राप्त करने के लिए अवअधोहनुज खून बह रहा खून के नमूने ले लीजिए। एक खून का नमूना विश्लेषक का उपयोग हीमोग्लोबिन और हेमाटोक्रिट उपाय।
- प्रयोगों के बाद, संज्ञाहरण से जागरण जब तक एक तापमान नियंत्रक के साथ जुड़ा हुआ एक हीटिंग पैड पर चूहों जगह है।
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Representative Results
Gaussia luciferase व्यक्त pDNA के जीन अभिकर्मक पॉलीप्लेक्स nanomicelles या नियंत्रण लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक 12 का उपयोग कर hepatocytes या MSCs द्वारा गठित spheroids में प्रदर्शन किया गया था। नियंत्रण अभिकर्मक काफी अभिकर्मक (चित्रा 3) के बाद एक दिन संरचना बाधित जबकि nanomicelles, micropatterned प्लेटों पर गैर ट्रांसफ़ेक्ट spheroids के साथ तुलना में अंडाकार आकृति संरचना में लगभग कोई परिवर्तन प्रेरित किया। Nanomicelles, लगातार एल्बुमिन स्राव और transgene (Gaussia luciferase) अभिव्यक्ति का उपयोग अभिकर्मक के बाद अच्छी तरह से लगभग एक महीने के लिए बनाए रखा गया। नियंत्रण अभिकर्मक इस्तेमाल किया गया था जब transgene अभिव्यक्ति की डिग्री nanomicelles (चित्रा 4) 12 से प्राप्त करने के लिए इसी तरह की थी हालांकि, हालांकि, कोई एल्बुमिन स्राव, मनाया गया।
Thermosensitive micropatterned प्लेटें, 3 डी एस का उपयोग कर अंडाकार आकृति वसूली के दौरानspheroids की tructure अच्छी तरह से प्राथमिक hepatocytes और ठंडा प्लेटों से वसूली (चित्रा 5) के बाद निलंबन में MSCs दोनों के लिए संरक्षित किया गया था। संरचना भी अच्छी तरह से इस तरह के 23 (400 माइक्रोन) के रूप में, एक पर्याप्त बड़ी क्षमता के साथ इंजेक्शन सुई के माध्यम से spheroids गुजर रहा है और 27 जी (220 माइक्रोन) सुइयों के बाद बनाए रखा गया था।
बरामद hepatocyte spheroids के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद, luciferase अभिव्यक्ति (चित्रा 6) 20 कुछ सप्ताह से अधिक के लिए जानवरों में पाया गया था। प्रतिरोपित hepatocytes से Albumin अभिव्यक्ति सेल समारोह अंडाकार आकृति वसूली और प्रत्यारोपण की प्रक्रिया के माध्यम से संरक्षित किया गया था, सुझाव है कि मेजबान ऊतक 20 में मनाया गया। चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए अपनी क्षमता का परीक्षण करने के लिए, hepatocyte spheroids भी erythropoietin एन्कोडिंग pDNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। Erythropo व्यक्त spheroids के चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण के बादietin, एक महत्वपूर्ण हिमेटोपोयटिक प्रभाव एक महीने (चित्रा 7) 20 के लिए पशुओं में प्राप्त हुई थी।
पॉलीप्लेक्स nanomicelles (ए, सी) या लिपिड आधारित अभिकर्मक (बी, डी) का उपयोग जीन अभिकर्मक के बाद एक micropatterned प्लेट पर hepatocyte spheroids (ए, बी) और एमएससी spheroids (सी, डी) की चित्रा 3. सूक्ष्म छवियों के एक दिन,। स्केल बार:। 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Hepatocyte spheroids transfecting के बाद Gaussia luciferase चित्रा 4 (ए) transgene अभिव्यक्ति। (बी) से Albumin स्रावअभिकर्मक के बाद एक monolayer संस्कृति में hepatocyte spheroids या hepatocytes। Spheroids nanomicelle (●) या लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक नियंत्रण (○), या नग्न pDNA (▲) का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट गया। (spheroids (△) या monolayer की संस्कृति (×) में) नियंत्रण (untransfected) hepatocytes से एल्बुमिन स्राव भी दिखाया गया है। परिणामों की SEM ± मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं; एन = spheroids के लिए monolayer की संस्कृति और एन = 6 के लिए 4। (संदर्भ में 12 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा (ए) के माध्यम से उन्हें गुजर जाने के बाद निलंबन में hepatocyte spheroids 5. सूक्ष्म छवियों 23- या (बी) 27 जी इंजेक्शन सुई स्केल बार:। 100 माइक्रोन।
Hepatocyte प्रत्यारोपण के बाद मेजबान चूहों में 6 चित्रा luciferase अभिव्यक्ति। PDNA -encoding luciferase के साथ अभिकर्मक के बाद 24 बजे (GL4) के बाद, monolayer संस्कृतियों से hepatocyte spheroids और एकल कोशिका निलंबन पेट क्षेत्र के चमड़े के नीचे ऊतक में प्रत्यारोपित किया गया। मेजबान चूहों में luciferase अभिव्यक्ति (संदर्भ में 20 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित) एक IVIS इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Erythropoietin व्यक्त hepatocytes के प्रत्यारोपण के बाद चित्रा 7. hematopoiesis। Hepatocytes अंडाकार आकृति और monolayer संस्कृतियों में erythropoietin एन्कोडिंग pDNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। अभिकर्मक के 24 बजे के बाद, monolayer संस्कृतियों से spheroids और एकल कक्ष निलंबन subcutaneously माउस पेट में प्रत्यारोपित किया गया। प्रत्यारोपण के बाद 22 और 28 दिनों में, (ए) हीमोग्लोबिन और (बी) हेमाटोक्रिट स्तरों रक्त के नमूनों से मापा गया। डाटा SEM के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; एन = अनुपचारित नियंत्रण के लिए अंडाकार आकृति और monolayer के समूहों और एन = 6 के लिए 12। सांख्यिकीय महत्व (संदर्भ में 20 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित) 2-पुच्छ विद्यार्थी का टी परीक्षण। द्वारा निर्धारित किया गया था इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंgure।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, यह जीन परिचय और अंडाकार आकृति वसूली के चरणों के दौरान spheroids के 3 डी संरचना को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं कोशिका मृत्यु या सेल गतिविधि के नुकसान से बचने के लिए एक अनुकूल microenvironments बनाए रखने के लिए आवश्यक है। पारंपरिक monolayer की संस्कृति में hepatocytes तेजी से 12 बोने के बाद कुछ दिनों के उनके स्रावी क्षमता खो देते हैं, जबकि उदाहरण के लिए, एल्बुमिन स्राव, hepatocytes के एक प्रतिनिधि जन्मजात समारोह, ठीक है, hepatocyte spheroids में संरक्षित है। MSCs के लिए, spheroids काफी adipogenesis और अस्थिजनन में शामिल जीनों की वृद्धि की अभिव्यक्ति के स्तर के साथ, adipocytes या अस्थिकोरक में भेदभाव की उनकी क्षमता को बढ़ाने के लिए, और नीचे विनियमन जीनों के एमएससी आत्म नवीकरण फेनोटाइप 4 बनाए रखने के लिए है।
जीन परिचय के लिए, विभिन्न अभिकर्मक अभिकर्मकों लिपिड आधारित वाले (चित्रा 3, 4) और सहित, पहले से परीक्षण किया गया थाऐसे polyethylenimine के रूप में बहुलक आधारित हैं। दुर्भाग्य से, अभिकर्मकों में से कोई भी अंडाकार आकृति संरचना में बाधा पहुँचा के बिना सफल जीन परिचय प्रदान की है। Transgene अभिव्यक्ति भी micropatterned प्लेटों पर शेष कोशिकाओं में कुशल है, हालांकि विशेष रूप से, लिपिड आधारित अभिकर्मकों, spheroids की पूरी व्यवधान उत्पन्न करने के लिए करते हैं। यह लिपिड आधारित अभिकर्मकों उच्च transgene अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी महत्वपूर्ण झिल्ली अस्थिरता प्रेरित है, लेकिन अस्थिर सेल करने वाली सेल बातचीत प्रतिपादन द्वारा spheroids बाधित संभावना है।
इसके विपरीत, cationic बहुलक पॉलीप्लेक्सेस फार्म करने के लिए, विशेष रूप से कम एन / पी अनुपात की स्थिति में, लिपिड की तुलना में एक हद तक कम करने spheroids खलल डाल दिया। यहाँ दिखाए गए मानक प्रोटोकॉल खूंटी परिरक्षण अधिकारी पॉलीप्लेक्स nanomicelles का उपयोग करता है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के polyethylenimine के रूप में cationic homopolymers, साथ पॉलीप्लेक्सेस भी spheroids में जीन परिचय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दरअसल, cationiखूंटी सतह के बिना सी पॉलीप्लेक्सेस आम तौर पर अंडाकार आकृति प्रत्यारोपण के सेल प्रकार और उद्देश्य के आधार पर आकर्षक विकल्प के लिए इन विट्रो transfections में उच्च transgene अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं, और कर रहे हैं।
इस प्रोटोकॉल की एक विशेषता एक thermosensitive बहुलक के साथ लेपित micropatterned संस्कृति प्लेटों का इस्तेमाल होता है। micropatterned सरणियों एक समान व्यास के साथ सेल spheroids की एक बड़ी संख्या का उत्पादन कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के 100 माइक्रोन व्यास सरणियों का उपयोग करता है, लेकिन इस पहलू लचीला है; हालांकि, बहुत बड़े व्यास, जैसे 500 माइक्रोन, अक्सर spheroids (अप्रकाशित डेटा) के मूल में सेल नेक्रोसिस कारण। बस बर्फ पर प्लेटें ठंडा करके, spheroids एक सिरिंज के साथ कोमल आकांक्षा से एक इंजेक्शन के निलंबन के रूप में प्राप्त किया जा सकता है। इस तकनीक का एक संभावित सीमा spheroids इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया सुई के आकार है। यह एक 27-जी सुई को सुरक्षित रूप से 100 माइक्रोन diam साथ spheroids के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस बात की पुष्टि की गई थीeter। हालांकि, संकीर्ण सुई इन spheroids के लिए लागू नहीं किया जा सकता है। एक 27-जी सुई विशेष रूप से माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों में spheroids रोपाई के लिए बहुत बड़ी है, के बाद से, एक संभावित विकल्प के लिए उन्हें अंदर की कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए scaffolds के उपयोग करने के लिए है।
इस प्रोटोकॉल के संभावित सेल प्रत्यारोपण के कई उद्देश्यों के लिए लागू किया जा सकता है। निलंबन अंडाकार आकृति संस्कृति प्रणाली की तुलना में, micropatterned प्लेटों वर्दी व्यास के साथ spheroids के लिए पर्याप्त संख्या में आसानी से प्राप्त किया जा सकता है फायदा है। जीन शुरूआत की विधि लचीला हो सकता है जैसा कि पहले उल्लेख किया है,, खूंटी परिरक्षण के साथ पॉलीप्लेक्स nanomicelles अंडाकार आकृति व्यवधान से बचने के लिए विशेष रूप से प्रभावी हैं। उम्मीद है, इस प्रणाली प्रतिरोपित कोशिकाओं के उपचारात्मक प्रभाव में सुधार होगा।
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Acknowledgments
हम गहराई से thermosensitive micropatterned संस्कृति प्लेटों के साथ ही वैज्ञानिक सलाह प्रदान करने के लिए Toyo Gosei, टोक्यो, जापान में डॉ ताकेशी Ikeya और तकनीकी कर्मचारियों की सराहना करते हैं। हम भी पशु प्रयोगों के साथ तकनीकी सहायता के लिए सुश्री सतोमी ओगुरा, सुश्री एस ए इ सुजुकी, सुश्री असुका Miyoshi और सुश्री Katsue Morii धन्यवाद। इस काम के लिए आर्थिक रूप से JSPS KAKENHI सहायता अनुदान में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए द्वारा समर्थित किया गया था, अभिनव (COI) प्रोग्राम के केंद्र और जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST) से एस नवाचार कार्यक्रम, और JSPS Core- टू-कोर प्रोग्राम, ए एडवांस्ड रिसर्च नेटवर्क।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
