光化学誘起後方虚血性視神経障害のラットモデル

Summary

このプロトコルの目的は、光化学ラットにおける後部視神経に虚血損傷を誘導することです。このモデルは、後部の虚血性視神経症の病態生理学の研究、およびこれと他の視神経障害のためだけでなく、他のCNSの虚血性疾患の治療的アプローチに重要です。

Abstract

後方虚血性視神経症（パイ中間子）は、臨床診療における視覚壊滅的な疾患です。しかし、その病因と自然史はあまり理解残っていました。最近、我々は、パイ中間子の信頼性、再現可能な動物モデルを開発し、このモデル^1のいくつかの神経栄養因子の治療効果を試験しました。このビデオの目的は、後部虚血性視神経障害の我々の光化学的誘発モデルを実証するために、および網膜神経節細胞の逆行性標識して、その効果を評価することです。後部視神経、光増感色素、エリスロシンBの外科的露出の後に、静脈内に注入されたレーザ光は、視神経の表面上に集束されます。血小板血栓症および浮腫性圧縮によって媒介微小血管閉塞を促すエリスロシンBと照射損傷時のレーザ血管内皮の光化学的相互作用、。結果として虚血性傷害は緩やかなもののpronouncをもたらしますリモート、損傷誘導と臨床的に関連する結果 - 軸索入力の喪失に起因して、網膜神経節細胞の枯死を編。したがって、このモデルは、パイ中間子の病態生理学的経路を研究するための新規のプラットフォームを提供し、さらに、視神経症、ならびに他のCNSの虚血性疾患の治療アプローチを試験するために最適化することができます。

Introduction

50歳以上の患者では、虚血性視神経症（ION）は、急性視神経²の最も一般的なタイプです。条件は、特定の影響を受けた血液供給および臨床プレゼンテーションのソースに応じて2つのサブタイプの一つとして提示することができます：前方（AION）または後部（パイオン^）3。 AIONの病因とコースが広く^4-7研究されてきたが、パイ中間子が不十分、その低い有病率、変数プレゼンテーション、不明確な診断基準と動物モデルの不足のために理解し続けています。また、何の治療が効果的に防止またはAIONやパイオンから失明を逆転することが証明されていません。したがって、パイ中間子の再現性と信頼性の高い動物モデルは、in vivoでの疾患プロセスを研究し、神経保護および軸索再生のための新しい治療法をテストするために非常に価値があります。

光化学vasogその結果微小血管系への虚血性損傷を誘発しましたENIC浮腫および血栓症を効果的に地域の組織虚血^{8-12を作成します} 。血管循環系に注入した後、感光性色素エリスロシンBは、標的血管のレーザー照射による活性化の際に反応性一重項酸素分子を生成します。一重項酸素は、直接血小板の接着/凝集を刺激し、血栓形成を閉塞性につながる、血管内皮をperoxidizes。虚血性損傷は、近隣地域に広がり、さらにによる血管原性浮腫に微小血管の圧縮によって悪化します。このプロトコルの全体的な目標は、光化学パイ中間子による被害をミラーリングするために球後視神経に虚血を誘導することです。

我々の知る限り、これは後部視神経¹における虚血性傷害の最初のモデルです。物理的な外傷を回避しながら、このモデルは虚血を生成するように、後部の虚血性視神経症の生理学的プロセスは、より良い模倣と検討されています。また、このモデルでは、視神経障害および他のCNS虚血性疾患の候補治療薬のスクリーニングのための新たなプラットフォームを提供しています。ここで、ラットパイオンモデルにおける大腿静脈カテーテル、視神経曝露、エリスロシンBの静脈内注射とレーザー照射のための詳細な手順を説明します。

Protocol

すべての動物の手順は、カリフォルニア州サンディエゴ、マイアミ機関動物のケアと使用委員会（IACUC）の大学によって承認され、眼科およびVisual研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われました。すべての試薬及び外科的処置に使用される器具は、無菌です。

1.手術のためにラットを麻酔し、準備します

1. 手順の前に、ラットを体重に応じて、ケタミン（60mgの/ kg）およびキシラジン（8mg / kg）の腹腔内注射で麻酔します。麻酔の適切な深さはつま先のピンチ刺激に対する否定応答によって決定されるべきです。
2. 麻酔をかけた後、窒息を防止し、手術中に角膜の乾燥を防ぐために、両眼に軟膏を潤滑適用するために前方に舌を引っ張ります。
3. バリカンを使用して、手術部位を剃り、面積10％ - イオジン洗剤溶液、70％エタノールで3回拭きます。
4. ドレープトン無菌のフィールド内の彼は動物。滅菌手袋と手術器具は、生存手術中に使用されています。動物間のホットビーズ滅菌器を使用して、機器の先端を再滅菌します。

2.外科的アプローチ

1. パイオン誘導
   1. 大腿静脈カテーテル法
      1. 手術部位を準備し、清掃してください。バリカンを使用して、右太ももの内側を剃る、10％ - イオジン洗剤溶液、70％エタノールでエリアを3回ずつを拭きます。
      2. チューブを準備します。 70％エタノールで滅菌ポリエチレンチューブの長さ40センチメートル（PE 10）を切断します。 （20 mg / kg体重の用量をもたらす、1μL/ mg）を生理食塩水でチューブをフラッシュし、2％のエリスロシンB色素の予め測定された溶液を含む1 mlの注射器に接続します。 600μL/分の速度に設定し、フットスイッチ制御注入ポンプにシリンジをマウントします。
      3. 15番ブレードを使用して、ある小さな水平切開を作ります右腿の付け根。カットし、内側の膜を広げ、滅菌綿棒でエリアを清掃してください。
      4. 大腿静脈の枝が表示されるまで、鉗子で筋肉を区切ります。シースは、動脈、静脈や神経を囲んでいます。 Vannas春のはさみと三角形のくさびのベースの近く（2-4 mmは通常十分である）つまみ、鉗子（ファインチップデュモン鉗子）と上方このシースを引っ張って、小さな切開をカット。必要に応じてカットを展開します。
      5. 静脈の方向に鈍いマイクロ手術用フック平行な静脈と動脈を分離します。繊細な膜と静脈枝を傷つけないように注意してください。そして、そっと静脈を持ち上げ、下にある結合組織から分離。
      6. ニードルレスナイロン縫合糸を入手して、大腿静脈の横に置きます。マイクロ手術用フックを使用して、静脈を上げ、先端領域の下の先の細いピンセットを渡します。縫合糸の一方の端をつかみ、下にそれを引っ張ります静脈。しっかり遠位静脈を結紮。近位静脈の下で同様の方法で、第2の縫合糸をパスし、緩い結び目を作ります。
      7. Vannasスプリングはさみで遠位結紮に近い静脈の小さなカットを行います。先の細いピンセットで、必要に応じて穴を展開します。一部の血液は、カットを通って漏れることがあります。冷たい、滅菌BSSおよび滅菌綿棒で手術領域を清掃してください。
      8. カットの縁に静脈壁を持ち、針ホルダを用いて調製し、生理食塩水で洗い流しチューブを容器にカテーテルを挿入。静脈とチューブの周りの近位結び目を締めます。次に、遠位縫合糸にそれを結びつけることによって、チューブを固定します。
      9. 1ミリリットルが適切である<、生理食塩水を注入するために、フットスイッチを押すことにより、カテーテル法の品質を確認してください。チューブが遮られていないと漏れを持っていないことを確認します。一時的カテーテル法と組織を保護するために縫合糸で切開を閉じます。
   2. 視神経の暴露
      1. PreparE 10％ - イオジン洗剤溶液、70％エタノールで左目の上に各3回の事前坊主頭の領域を拭いて手術部位。
      2. 第15ブレードで目の後ろの皮膚2〜3ミリメートルに沿って切開してください。ピンチと鋸歯状の鉗子で結合組織を持ち上げて、Vannasスプリングハサミで小さな切開を行います。この小さな切開は、一般的に長さが約5mmであるが、訓練中の外科医のための大きい露出を提供するために長くすることができます。血管を破壊しないように注意しながら、ぶっきらぼうに眼窩骨の優れたリムに沿って結合組織を通って解剖を続行します。綿棒で手術領域を清掃してください。
      3. 優れた直筋が表示されるまで結膜を通って下方解剖。ピンチと筋肉を通して解剖。筋肉が軌道内に深くから解放されます。今、周囲の組織を視覚化を容易にするために目の後退及び仰角を助けるために利用することができます。
      4. 再横方向と下方向に皮膚や結合組織のフラップを管、縫合や止血剤のある場所に保持します。これは、視神経を囲む脂肪含有シースを明らかにするために前進し、外側に目を回転します。
      5. 慎重に鋭いピンセットを挿入し、シースの周囲の結合組織を分離するために視神経に平行に展開します。鉗子の鋭い先端で視神経を触れないでください。
      6. 視神経と周囲の鞘の5ミリメートルの長さが表示されるようになるはずです。シース表面の微小血管のネットワークは、視神経を取り囲みます。これらは、レーザー照射時に対象とされます。
   3. エリスロシンBおよびレーザー照射の静脈内注射
      1. 緑色レーザ光から身を遮蔽するためにレーザ照射装置を操作しながら、常にオレンジ色の保護眼鏡を着用してください。 、レーザーをオンにし、シャッターを開いて、ピークと平均ポウを調整必要に応じてレーザーのRS。シャッターを閉じます。
      2. レーザ照射装置にラットを置きます。適切なビーム配置を確実にするために、弱い照準ビームは、空間的に閉じたシャッタ羽根に穿設さ100μmの直径の穴を介してレーザをフィルタリングすることによって生成されます。先端の細いピンセットで視神経を再公開すると、3ミリメートルと視神経頭の後ろの4ミリメートルの間で眼窩内視神経に照準ビームを配置します。
      3. 輸液ポンプの活性化を介して2％のエリスロシンBの溶液を注入します。外科医が視神経の表面を湿らせるため、BSSの小滴を追加しながら、数秒間循環することがあります。
      4. 照準ビームの位置を確認し、照射を開始するために、フットスイッチをクリックします。顕微鏡の光路に追加されたオレンジ色の安全フィルタは、すぐに1秒の遅延後にシャッターの開口部に続くトリガされます。
      5. 9用の視神経を照射135mWのピーク電力および15％のデューティサイクルで250 Hzで回転するビームチョッパーによって生成18mWの平均電力と0秒（これは、熱の影響を最小限に抑えます）。安全フィルタを通して明るいオレンジ色として可視黄色蛍光は、視神経の上面から出射されるビームは対称的に、神経を照射することを保証するのに十分であることになります。
      6. 照射後、オレンジ色の安全フィルタが自動的に開きます。微小出血がある場合には観察することができます。
      7. 余分な眼筋の牽引力を軽減し、中立位置に目を戻します。結節縫合で切開を閉じます。その後、カテーテルを撤回し、漏出を防ぐためにしっかりと大腿静脈を縛ります。結節縫合で閉じます。両方の切開に抗生物質軟膏を適用します。網膜中心静脈と動脈の血管の完全性を検証するために眼底を確認してください。
2. 逆行性標識法。網膜神経節細胞（RGC）の注：RGCの生存を評価するために、フルオロゴールド（FG）との逆行性標識はパイ中間子の一週間前に完了する必要があります。この方法は、Joveのプロトコル 819 ¹³に詳細に記載されています。
   1. 簡単に言えば：ケタミン（60 mgの/ kg）およびキシラジン（8mg / kg）で動物を麻酔し、頭を剃ります。
   2. 外科的切開部位をスクラブし、頭蓋骨を露出するように、ヘッド全体に正中切開を行います。
   3. 頭蓋骨（φ2×2 mm）の両方の矢状方向および横縫合から0.5ミリメートルを通じて両国間の穴を開けます。
   4. 慎重に真空ポンプを用いて上丘（SC）の背側表面にある脳のコンテンツを吸引。その後、SCの表面に4％のFGに浸したゲルフォームの小片を配置します。
   5. 縫合糸で切開を閉じて、標準的な術後のケアを用いて動物の世話。
3. 術後ケアと安楽死
   1. 動物が回復するまでは手術後、再循環温水​​パッドの上に別々の清潔なケージに動物を配置します。
   2. 術後鎮痛薬（ブプレノルフィン塩酸は、0.01ミリグラム/ kg）を、不快感を最小限にするために3日間連続して1日2回投与されるべきです。
   3. ラットを個別に保持し、彼らは胸骨横臥を維持し、十分な意識を取り戻すことができるようになるまで観察されるはずです。
   4. 回復と健康の徴候は手術後、または抜糸と最新のいずれか早い方の手術部位の十分な治癒までに少なくとも5日間毎日監視されています。
   5. 調査の関心に応じて、手術後に科学的に適切な時点で、4％PFAで灌流によって動物を安楽死させます。

Representative Results

この技術によって誘導された結果として虚血性傷害は、虚血性軸索損傷後の網膜神経節細胞の緩やかなものの顕著な死をもたらします。これは、ヒトの疾患において観察されるものと同様の臨床的に関連性の結果です。 FG逆行性標識はパイオン後のRGC生存を定量するために使用されます。同じ方法を成功したモデルの作成 ​​を検証するだけでなく、異なる治療法の効果を評価するために使用される。 図1は、制御から網膜フラットマウントでFG陽性細胞（ 図1A）の代表的な共焦点画像を、偽処理（レーザーを示していますのみ/なしエリスロシンB、 図1B）、および2週間後パイオン処理された（ 図1C）動物。対照動物と比較して、より少ないFG陽性細胞は2週間パイオン誘導後の動物に存在します。コントロールおよび偽処理（レーザーのみ/なしエリスロシンB）動物でのRGCの数との間に有意差は観察されません。ティsがパイオン誘導性のRGC損失はなく、単独のレーザからの熱エネルギーを、エリスロシンB及びレーザー照射の組合せによって誘発されることを示しています。

後部の虚血性視神経症（パイ中間子）の後に、図1網膜神経節細胞（RGC）の生存。逆行性フルオロゴールドで標識された網膜神経節細胞は、網膜フラットマウント（AC）で画像化しました。二週間パイオン後、RGCの同様の数は、対照（A）と偽処理（B、レーザーのみ​​/なしエリスロシンB）の目で観察されます。しかしながら、フルオロゴールドで標識されたRGCの数は顕著にパイオン（C）の設定で減少します。スケールバー=100μmである。 大きい版？を見るにはこちらをクリックしてくださいこの図のN。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
532-nm Nd:YAG laser	Laserglow	LRS-532-KM-200-3
Beam chopper	custom-made	custom-made
Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer	Vincent Associates	SD-10
25-cm focal length spherical lens	CVI/Melles-Griot	01 LPX 293	plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating
Erythrosin B	MP Biomedicals	190449
Fluorogold	Fluorochrome,LLC
Gelfoam	Cardinal Health	CAH1203421
Polyethylene tubing (PE10)	BD Intramedic	427400
No. 10 Blade	Miltex	4-110
Fine Forceps	F.S.T.	91150-20	Dumont #5 rustless non-magnetic
Forceps with Teeth	F.S.T.	11153-10	Germany stainless
Forceps	F.S.T.	18025-10	Germany stainless
Vannas spring scissors	F.S.T.	2-220	JJECK Stainless
Polyglactin suture	Ethicon	J488G	7-0 suture
hemostat	F.S.T.	12075-12	Germany stainless