Abstract
A membrana corioalant�ca pinto (CAM) começa a se desenvolver no dia 7 após a fertilização e amadurece a dia 12. O CAM é naturalmente imunodeficientes e altamente vascularizado, tornando-se um sistema ideal para a implantação do tumor. Além disso, a CAM contém proteínas da matriz extracelular, tais como fibronectina, laminina, colagénio, integrina alfa (V) beta3, e MMP-2, tornando-se um modelo atractivo para estudar a invasão tumoral e metástases. Os cientistas têm tomado longo vantagem da fisiologia da CAM usando-o como um modelo de angiogénese. Mais recentemente, o ensaio CAM foi modificado para funcionar como um sistema modelo in vivo de xenotransplante para vários tipos de câncer que preenche a lacuna entre o trabalho de base in vitro e modelos mais complexos de cancro animal. O ensaio CAM permite o estudo do crescimento do tumor, as terapias anti-tumorais, e vias moleculares pró-tumorais num sistema que é biologicamente importante tanto em termos de custos e tempo eficaz. Aqui, descrevemos o desenvolvimento da CAM xenograft modelo de carcinoma hepatocelular (HCC), com taxas de sobrevivência de embriões de até 93% e tumor confiável tomar levando a um crescimento de tridimensionais, tumores vascularizados.
Introduction
O carcinoma hepatocelular (HCC) é a 3ª maior causa de mortalidade por câncer no mundo 1. Atualmente, apenas 30% dos pacientes com CHC são elegíveis para os tratamentos cirúrgicos potencialmente curativas 2, e quimioterapia sistêmica não é eficaz 3. Portanto, existe uma necessidade premente para clínica não satisfeita terapias HCC novos, e o desenvolvimento de sistemas modelo adequados para o teste eficiente de novos agentes. O corioalant�ca membrana (CAM) ensaio pintainho fornece um método reprodutível, de custo-eficaz, rápido e de médio rendimento de testar potenciais fármacos anti-tumorais in vivo.
O ensaio CAM tem sido amplamente utilizado para estudar angiogénese 4. Também foi desenvolvido com sucesso num modelo de xenoenxerto de tumor de cancros, incluindo o glioblastoma 5, 6 cancro pancreático, melanoma 7-9, 10-11 e osteossarcoma. Ambos in ovo 12 e ex ovo13 técnicas têm sido utilizadas na literatura, com detalhes que variam de protocolo para protocolo. Um grande desafio para o modelo CAM xenotransplante é a incidência relativamente elevada de morte embrionária após a manipulação do ovo, com taxas de mortalidade de embriões de pintainho publicados que variam 25-50 por cento 11-14.
Neste artigo, descrevemos o desenvolvimento de um modelo in ovo de xenotransplante de HCC que produz de forma confiável crescimento de tridimensionais, tumores vascularizados que histologicamente se assemelham HCC indiferenciado. Temos adaptado um protocolo inicialmente descrito por Ossowski et ai. 14 e ter atingido pintainho embrionário taxas de sobrevivência de até 93% com o enxerto do tumor extremamente alta.
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Protocol
1. A incubação do ovo
- Obter 8 dias de idade ovos isentos de agentes patogénicos específicos embrionados.
- Coloque os ovos na rotação bandeja de ovos, estampadas extremidades voltadas para cima, e coloque a bandeja girando dentro de uma incubadora de ovos. Incubar os ovos durante 48 horas a 36 ° C e 50% de humidade.
2. Deixar cair o CAM e abrindo os ovos
- Recolher os ovos da incubadora. Coloque os ovos na prateleira dos ovos, carimbado lado de cima, e trazer à capela de fluxo laminar.
- Desligue as luzes da sala e do capô.
- Segurar o fim visado de ovo levemente para o candler ovo para expor a vasculatura de CAM, bem como o saco de ar.
NOTA: O candler ovo é uma fonte de luz usado para visualizar o desenvolvimento do embrião e do saco de ar associado e vasculatura. - Coloque uma marca de lápis entre dois grandes vasos sanguíneos.
- Ligar as luzes e usar um pino estéril para fazer um orifício na ponta do ovo por cima do saco de ar (final estampado) e um furo na pemarca NCIL. Não empurre o pino do impulso durante todo o tempo; um furo de cerca de 3 mm de profundidade será normalmente suficiente.
- Apaga as luzes. Squeeze bulbo segurança, pressionando a extremidade aberta firmemente contra o buraco acima do saco de ar. Aplicar sucção para puxar o ar para dentro do buraco na marca de lápis, fazendo com que o CAM a cair para longe do reservatório na marca de lápis.
- Verifique se o saco de ar passou do final carimbado do ovo para o buraco marcado-lápis usando o candler. Se não tem, use o pino do impulso para fazer dois buracos um pouco mais profunda e, em seguida, voltar a aplicar sucção usando a lâmpada de segurança.
- Acenda as luzes. Segurando o ovo em uma mão, ligar a ferramenta rotativa Dremel com um 15/16 polegadas roda de corte em anexo e fazer dois cortes transversais apenas profundo o suficiente para cortar a casca, mas não é profundo o suficiente para cortar todo o caminho para o deprimido CAM. Fazer os cortes de cerca de 2 cm de comprimento e 1 cm de distância um do outro. Fazer os cortes de largura suficiente de modo que um anel de silicone de 1 cm de diâmetro pode passar atravésmas mais fino do que a largura de fita adesiva padrão.
- Em seguida, faça um corte longitudinal entre e nas extremidades dos dois cortes transversais tocando levemente a roda de corte para o shell.
- Deslize uma pinça estéril sob a peça shell e paralelo ao shell. Pegue o pedaço shell com a pinça e retire toda a peça limpa.
- Coloque fita adesiva sobre a janela recém-inaugurado, certificando-se de dobrar uma ponta sobre si mesmo para facilitar a remoção.
- Coloque os ovos de volta na incubadora na bandeja do ovo (NOT nas prateleiras de ovos rotativas) até o momento da inoculação.
3. Inoculação
- Mantenha porão mistura de proteína de membrana, como matrigel, em gelo (para evitar a polimerização) e coloque na capa.
- Use EDTA 2 mM, para separar as células (4 - 5 ml por frasco T75) e frascos de cultura de tecido em lugar incubadora durante 5 min.
- Volte a suspender as células isoladas nos meios de comunicação e contar com um hemocitômetro e azul de tripano. Use entre 500.000 to 2.000.000 de células para enxertia sobre o CAM, dependendo da linha celular. Otimizar o número adequado de experimentos preliminares.
- Medida do volume necessário para o número de células apropriado e centrifugar a 500 xg durante 5 min.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender em seguida sedimento celular em 40 μ l de PBS ++ e 20 μ l de mistura de membrana basal.
NOTA: Neste ponto, as células podem ser tratadas com fármacos ou outros agentes de teste quanto necessário para as experiências por ressuspensão em suspensão a mistura membrana celular / porão. Alternativamente, os agentes podem ser pipetado para a suspensão de células de membrana mistura / cave após o enxerto. - Recuperar rack de ovo com os ovos da incubadora e lugar na capela de fluxo laminar.
- Retire a fita da janela, recuperar um anel de silicone 1 mm do tampa de um frasco criogênico usando uma pinça esterilizados, e soltar o anel pela janela.
- Pipetar a solução de células 60 μ l de PBS ++ e membrana basal MIXTURe directamente para o centro do anel de silicone que descansa sobre a CAM.
- Re-tape a janela e mover prateleira dos ovos de volta à incubadora. Neste ponto, tenha cuidado ao mover os ovos como o anel e a suspensão de células pode facilmente se tornar deslocados.
- Permitir que os tumores crescer durante 5 a 7 dias.
4. Colhendo Tumores
- Coloque sob-pad na capa. Preparar 35 x 10 mm pratos e recipientes de paraformaldeído, conforme necessário para a histologia. Colocar 1 mL de PBS ++ em cada placa de 35 mm x 10.
- Coloque saco de risco biológico na capa. Pegue uma tesoura de dissecção estéril e introduza a ponta para dentro do ovo no buraco perto do final carimbado.
- Corte em torno de todo o ovo longitudinalmente.
NOTA: o CAM eo tumor com o anel deve ficar para a metade superior do reservatório com a janela. - Com uma tesoura de dissecção e uma pinça, dissecar o tumor longe do CAM e coloque tumor na placa de 35 mm x 10. Medir e pesar tumores. Tumores fixas em paraformaldehyde parafina e, em seguida, incorporar-los para uso em histologia e imunohistoquímica experimentos.
5. (Opcional): Tumor de dissociação de células
- Use tesouras de dissecação para picar o tumor na placa de 35 mm x 10. Pour tumor fragmentado em um tubo de centrífuga de 15 ml e remover o máximo de PBS ++ quanto possível através de pipetagem.
- Adicionar 2 ml de colagenase (1 mg / ml em PBS ++), ao longo do tubo ligar várias vezes, e incubar a 37 ° tubo C durante pelo menos 30 minutos (até várias horas).
- Adicionar 5 ml de mídia para cada tubo e ressuspender completamente pipetando cima e para baixo 20 - 40x. Pipetagem minuciosa é fundamental para a dissociação de células completa.
- Permitir a sedimentação, e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante, deixando para trás pelete de células dissociadas.
NOTA: neste momento, os sedimentos celulares podem ser usadas para várias experiências (citometria de fluxo, a lise para uso na transferência de Western, o isolamento de ARN, etc.). A contagem total de células tumorais também pode ser obtido usando um hemocitómetro e coloração com azul de tripano. Note-se que, células ovais menores são células de galinha do CAM e não devem ser contadas como células tumorais. Deve haver um número mínimo de contaminação de células não tumorais (CAM) Se o tumor é dissecada cuidadosamente a partir da CAM.
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Representative Results
Imagens representativas dos passos chave no protocolo são mostrados aqui. A Figura 1A demonstra o uso do candler para visualizar o embrião em desenvolvimento, o saco de ar, e a vasculatura da CAM. A Figura 1B-1C mostram o processo de deixar cair a CAM, fazendo os dois orifícios e, em seguida, a aplicação de pressão negativa usando a lâmpada de segurança, e a Figura 1D mostra uma removida com sucesso CAM com uma bolha de ar grande sob o buraco marcado lápis. A Figura 1E e Figura 1F demonstrar a utilização da ferramenta rotativa Dremel para fazer o necessário cortes no exterior acima da bolha de ar ea janela é aberta na concha com a CAM vascularizado exposta dentro.
Tridimensionais, tumores vascularizados foram cultivadas com sucesso utilizando as linhas celulares de carcinoma hepatocelular humano HUH7 (Figura 2A-2B) e PLC / PRF / 5 (Figura 2C-2D). Tumores cultivadas a partir de HUH7 e PLC / PRF / 5 células oistologically assemelham HCC indiferenciado (Figura 2E-2F) e também se assemelham HUH7 e PLC / PRF / 5 tumores cultivados em modelos de rato de xenotransplante 15,16. Além disso, a utilização do peso do tumor foi validada como uma medição do tamanho do tumor, demonstrando que o peso do tumor foi altamente correlacionada com a contagem total de células de tumor obtida após a dissociação completa de tumores utilizando colagenase (Figura 3).
Usando este protocolo, foram alcançadas taxas de sobrevivência de embriões de até 93% (Tabela 1). A Tabela 1 mostra dados agregados de três experiências separadas de HCC no modelo de xenoenxerto de CAM. De um total de 33 ovos que foram enxertados com sucesso, com 500.000 células tumorais (HUH7 ou PLC / PRF5), apenas 3 ovos resultaram em morte embrião de galinha, uma taxa de sobrevida global de 90,9%. Além disso, os tumores foram cultivadas com fiabilidade muito depois de 5 dias, a partir de 100% (30/30) dos ovos com embriões sobreviventes tiveram sucesso a formação de tumores.
Figura 1. Deixar cair o CAM e Abrindo uma janela no Shell. (A) Identificação dos embriões (seta azul) e Vasculature (Black Arrow), utilizando o Candler, (B) fazendo um buraco na Shell, (C) aplicação de sucção para o Hole, o que ocorre naturalmente Air Sac, (D) Visualização a bolha de ar Mostrando Dropping bem sucedida do CAM longe da Shell, (E - F). Abrindo uma janela no Shell usando o Dremel Rotary Ferramenta Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O CAM suporte o crescimento de tridimensional, vascularizado Os tumores que histologicamente assemelha-se ao HCC indiferenciado. (A - B) O crescimento do tumor após 5 dias no modelo CAM, células HUH7 (500.000 células semeadas) (barra de escala = 1 cm), (C - D) O crescimento do tumor após 5 dias no modelo CAM, PLC / PRF / 5 células (500.000 células semeadas) (barras de escala = 1 cm), (E-F) Histologia dos HUH7 e PLC / PRF / 5 tumores, respectivamente (barras de escala = 100 μ m) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 3. Lote Peso do Tumor de contagem de células vs. O peso do tumor está altamente correlacionada com a contagem total de células de tumor após collagenase dissociação.
| Número total de ovos | Por cento dos ovos com a sobrevivência embrião de galinha | Taxa de tumor tomar em ovos com embriões sobreviventes | |
| HUH7 | 27 | 92,6% (25/27) | 100% (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83,3% (5/6) | 100% (5/5) |
| No geral | 33 | 90,9% (30/33) | 100% (30/30) |
Tabela 1. embrionárias Taxas de sobrevivência e taxas de Tumor Pegue no modelo CAM usando duas linhas de células de carcinoma hepatocelular humano.
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Discussion
Vários passos principais neste protocolo mais provavelmente representam a sobrevivência embrionária melhorada bem como uma maior fiabilidade do crescimento do tumor. Soltando o CAM para longe do reservatório através da aplicação de sucção para o saco de ar é menos invasiva do que os outros métodos existentes (utilizando uma agulha para remover a albumina do ovo, dissecção cega, etc.). Usando um alfinete estéril para criar os dois pequenos furos necessários para este método é a parte mais desafiadora do protocolo. Usando muita força pode resultar em danos ao CAM e sua vasculatura através de sobre-penetração com o alfinete ou podem até mesmo resultar em rachaduras ou destruir o ovo. Hands-on prática usando um alfinete para fazer pequenos furos na não-fertilizados, ovos comprei-mantimento podem minimizar os erros cometidos durante a primeira tentativa de deixar cair o CAM. Além disso, a utilização de etanol ou de outras soluções desinfectantes para limpar o reservatório diminui a viabilidade embrionária, e deve ser evitado. Finalmente, usando o anel de silicone estéril para &# 8220; curral "as células tumorais em um local específico após a semeadura auxilia no crescimento do tumor e contribui para a alta taxa de tumor tomar visto em nosso protocolo.
Alguns otimização de etapas críticas do protocolo provavelmente será necessário quando se trabalha com linhas de células diferentes e / ou drogas. O número de células sugerido para a semeadura é entre 0,5 e 2 milhões, mas algumas linhas de células podem necessitar de densidades de sementeira mais elevadas ou mais baixas para formar um agradável, tumor tridimensional. O enxerto muito poucas células pode resultar na formação de tumores pobres, enquanto enxerto muitas células pode resultar em crescimento excessivo do tumor em que o tumor ocupa o anel de silicone todo, torna-se mais lisa e menos tridimensional que é o ideal, e pode escapar dos limites do anel . Recomendamos a criação de uma experiência preliminar para determinar a densidade de semeadura de células ideal para qualquer linha celular particular. Além disso, alguns ajustes para um padrão em concentrações de fármaco in vitro podem ser requeremd. Nós calcular as concentrações de fármaco em relação ao volume total que é semeada para a came (60 ul), mas, por vezes, as concentrações de droga "mais elevadas" do que as usadas em experiências paralelas in vitro são necessários a fim de ver os efeitos sobre o crescimento do tumor, presumivelmente devido absorção ao longo da CAM e a dispersão do fármaco para o resto do ovo.
Depois de bem sucedida a optimização do protocolo para drogas e linhas de células específicas, o modelo de xenoenxerto de CAM podem ser utilizados para investigar uma grande variedade de propriedades e mecanismos celulares tumorais. O crescimento do tumor pode ser avaliada por meio de medições de peso e tamanho, bem como a contagem total de células tumorais. Os tumores podem ser fixo e submetidas a imuno-histoquímica para corar para marcadores tumorais ou proteínas específicas de interesse. A angiogénese pode ser avaliado por coloração para SNA1, que cora especificamente células endoteliais pintainho 17. As células tumorais podem ser lisadas para interrogatório de vias moleculares. Como um passo intermediário para colmatar puros de trabalho vitro com modelos mais complexos de câncer, como modelos animais ortotópicos, o modelo de xenotransplante CAM é uma forma rentável de obter rapidamente os dados em um cenário que é biologicamente mais relevantes do que as células cultivadas em cultura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
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