Introduction
De invoering van overexpressie technologieën gestimuleerd ofwel de biochemische studies van laag kopie-aantal enzymen en de industriële productie van farmacologisch werkzame eiwitten (bijvoorbeeld insuline). Sinds de komst van deze technologieën, aanzienlijke vooruitgang geboekt om de opbrengst en kwaliteit van recombinante eiwitten verhogen. Daarnaast werden prokaryotische 1,2 en eukaryotische 3 overexpressie systemen ontwikkeld door de jaren heen, het aanbieden van bruikbare alternatieven voor het "werkpaard" van eiwitten biotechnologie, dat wil zeggen, Escherichia coli. Vooral de beschikbaarheid van alternatieve platforms E. coli leidde tot de productie van recombinante peptiden of proteïnen dragen post-translationele modificaties. Er moet echter worden opgemerkt dat E. coli is nog het organisme gekozen voor recombinante eiwitproductie. Dit komt door verschillende factoren, waaronder de meest relevant kan zijnbeschouwd: i) de beschikbaarheid van een groot aantal overexpressie systemen (expressievectoren en stammen) voor E. coli 1,2; ii) de korte generatietijden en hoge opbrengsten biomassa, E. coli in een verscheidenheid van rijke en synthetische media; iii) de gemakkelijke manipulatie hetzij op biochemisch en op genetisch niveau van dit micro-organisme; iv) het isoleren van stammen in staat de productie van toxische eiwitten 4; v) de bouw van de stammen met homogene inductie bij de bevolking niveau 5,6. Bovendien is recent aangetoond dat expressie die geschikt zijn voor de productie in E. coli van post-translationeel gemodificeerde eiwitten kunnen worden bedacht en gebouwd 2.
Momenteel wordt eiwitoverexpressie vooral gebruikt om monomere of homo-oligomere eiwitten waarvan hypersynthesis kan worden uitgevoerd met een enkel gen gekloneerd in een geschikte plasmide te verkrijgen. Echter, aandacht werd onlangsbesteed aan de bouw van E. coli eiwit co-expressiesystemen, tegen de productie, in vivo, van hetero-oligomere complexen 2. Interessant is dat vroege experimenten van eiwit co-expressie gericht de inter-species assemblage van grote en kleine subeenheden van cyanobacteriën ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase / oxygenase 7,8, en de vereniging van afgeknotte en full-length vormen van HIV-1 reverse transcriptase 9. Deze baanbrekende studies aangetoond dat eiwit co-expressie is een krachtig alternatief voor traditionele in vitro reconstitutie. Bovendien eiwit co-expressie in E. coli werd gebruikt om verschillende eiwitten dragen posttranslationele modificaties 2 produceren, eiwitten bevattende natuurlijke aminozuren 2 verkrijgen, en om de opbrengst van overexpressie membraaneiwitten 2 verhogen. Bovendien is het potentieel van proteïne co-expressie als een middel te verlenen aan E. coli concurrerennvu in eiwituitscheiding is onder actieve onderzoek 2.
Twee belangrijke strategieën van eiwit co-expressie in E. coli kan worden nagestreefd: i) het gebruik van een enkel plasmide op de verschillende genen gastheer voor overexpressie; ii) het gebruik van meerdere plasmiden in enkele cellen co-expressie van de doelwit eiwitten. In het eerste geval zijn de criteria voor de keuze van plasmide niet van die van conventionele enkelvoudige eiwitoverexpressie experimenten, hoewel name plasmiden die tandem promoter / operator elementen zijn geconstrueerd voor co-expressie 10. Deze eerste benadering is derhalve vrij eenvoudig. Er moet echter worden opgemerkt dat het gebruik van een enkel plasmide co-expressie verschillende eiwitten voor twee belangrijke problemen: i) de molecuulmassa van de vector toeneemt met het aantal gastheer genen, waardoor het aantal co-expressie gebrachte eiwitten; ii) wanneer meerdere genen worden gekloneerd onder de controle van een enkele promoter, polariteit decrease de expressie van de genen distaal van de promoter. Het gebruik van dubbele of meervoudige plasmiden in enkele E. coli-cellen heeft om de verenigbaarheid van de vectoren van keuze te bereiken, dus het opleggen van beperkingen aan de in aanmerking komende combinaties van plasmiden. Echter, deze tweede co-expressie strategie biedt het voordeel dat met de molecuulmassa van vectoren, en beperkt polariteit. We hebben onlangs gebouwde een eiwit co-expressie systeem ontworpen om het pendelen van genen tussen de co-expressie plasmiden 11 te vergemakkelijken. In het bijzonder hebben we de pGOOD vectoren serie geconstrueerd, de relevante eigenschappen daarvan zijn: i) een p15A oorsprong van replicatie, de verenigbaarheid van de pGOOD plasmiden met de commerciële vectoren die de ColE1 oorsprong (bijvoorbeeld de pBAD serie 12) te verschaffen; ii) een tetracycline-resistentie cassette; iii) de aanwezigheid van lac -afgeleide regulerende elementen, dat wil zeggen, de promotor-Operator (O 1) paar en het lad q-gen. Met behulp van een geschikte pBAD-pGOOD echtpaar, waren we in staat om de katalytische kern van E. overexpressie coli DNA polymerase III, samengesteld uit drie verschillende subeenheden, namelijk α (de 5'-3 'polymerase), ε (de 3'-5' exonuclease) en θ (stabiliserende ε) 13. In het bijzonder hebben we aangetoond dat de co-expressie van het αεθ complex strikt afhankelijk van de toevoeging aan de E. coli kweekmedium van zowel IPTG en arabinose, wat leidde tot overexpressie van pGOOD en pBAD respectievelijk (Figuur 1A).
In dit rapport, illustreren we hoe eiwit co-expressie efficiënt kunnen oplossen problemen in verband met de slechte oplosbaarheid van een eiwitcomplex subunit. Verder tonen we hoe in vivo eiwit complementatie tests kunnen worden uitgevoerd, en tenslotte beschrijven we het gebruik van eiwit co-expressie afstemmen mutatiefrequentie in E. coli. Om dit doel, gebruikten we pGOOD-pBAD koppels geschikt om relevante voorbeelden van elke casus illustreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van E. coli Co-transformanten
- Bereid elektro-competente cellen van de geschikte E. coli-stam te transformeren. Transfer naar 1 ml LB-medium (trypton, gistextract, NaCl bij 10, 5 en 10 g / l respectievelijk) één enkele kolonie van de stam van keuze, en incubeer bij 37 ° C onder schudden omstandigheden van 180 rpm. Verdun de pre-kweek 1: 500 in 25 ml vers LB-medium en incubeer de kweek bij 37 ° C.
- Bij log-fase (0.6 OD) Centrifugeer de celsuspensie bij 5000 xg gedurende 20 min) en resuspendeer de pellet in 10% v / v ijskoude steriele glycerol-water in de helft van het oorspronkelijke kweekvolume. Herhaal deze stap 4 keer, elke keer dat de resuspensie volume halveren. Tenslotte resuspendeer de pellet in glycerol / water en verdeel de cellen suspensie in 50 ul porties. Bewaar de monsters bij -80 ° C tot 6 maanden.
- Los het gewenste plasmide in steriel water, aangevuld met 0,5 mM EDTA. Dooi op ice een hoeveelheid van elektro-competente cellen en mengen met een geschikte hoeveelheid (2,5-5 ng) vector. Breng het mengsel in een 0,1 cm cuvette geschikt voor elektroporatie en toepassen 1.8 kV.
- Onmiddellijk over de geëlektroporeerde cellen in 1 ml SOC-medium (LB medium aangevuld met 0,2% w / v glucose, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCl), incubeer gedurende 1 uur onder schudden, en tenslotte overdracht 100 ul aliquots op platen met LB-agar met de juiste antibiotica. Incubeer O / N bij 37 ° C.
- Zuiveren de transformanten door uitstrijken enkele kolonies op petrischaaltjes.
- Bereid elektro-competente cellen van de primaire transformanten en herhaal stap 1,1 tot 1,5 te transformeren met verdere plasmiden.
- Bereid glycerol voorraden van de co-transformanten. Breng een enkele kolonie in LB aangevuld met de juiste antibiotica, incuberen bij 37 ° C onder schudden, en log-fase (0.6 OD) centrifugeer de celsuspensie bij 5000 xg gedurende 20 min. Resuspend de pellet in LB-medium met antibiotica 15% v / v glycerol. Verdeel in porties en bewaar bij - 80 ° C.
2. Co-expressie van α en ε subeenheden van E. coli DNA Polymerase III
- Breng met een steriele lus een kleine hoeveelheid van de juiste stam glycerol voorraad (bv TOP10 / pGOOD-ε243 en TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, zie figuur 1) in een petrischaal met LB-medium en antibiotica. Laat de cellen schorsing droog op de petrischaal, en streep de cellen druppeltje. Incubeer bij 37 ° CO / N.
- Transfer, met een steriele tandenstoker, een enkele kolonie 1 ml LB-medium antibiotica. Incubeer 8 uur bij 37 ° C. Verdun de pre-kweek 1: 500 in vers medium en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 15 uur.
- Voeg IPTG, arabinose of arabinose en IPTG, 1 mM elk. Incubeer bij 30 ° C gedurende 2,5 uur. Verzamel de cellen en bewaar de pellets bij -20 ° C.
- Ontdooien pellets op ijs en resuspendeer in lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM dithiothreitol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), pH 8). Zachtjes homogeniseren van de cellen ophanging met een koud glas pottenbakker.
- Ultrasone trillingen bij 15 W voor 15 sec, gevolgd door 15 sec koeling interval (4 cycli).
- Centrifugeer de totale eiwitextracten bij 10.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C aan de oplosbare fractie herstellen.
- Analyseer door SDS-PAGE (12,5% acrylamide) hoeveelheden van elk oplosbaar eiwit extract. Hiertoe overdracht 20 ul van elk oplosbaar eiwit extract Eppendorf buizen die 60 pi H2O en 20 gl laadbuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) glycerol, 0,25% (w / v) broomfenol blauw) en koken gedurende 5 min. Plaats 18 gl van elk monster en voer de elektroforese bij 140 V gedurende 1,5 uur.
3. Co-expressie van α subunit van Deinococcus radiodurans DNA Polymerase III en ε subeenheid van E. coli DNA Polymerase III
- Bereid een voorkweek van E. coli stam TOP10 / pBAD-α Dr / pGOOD-ε243 in 1 ml LB-ampicilline-tetracycline medium en incuberen 8 uur bij 37 ° C. Verdun 1: 1.000 in vers medium en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
- Verdun 1: 100 in 200 ml vers medium, incuberen bij 37 ° C gedurende 3 uur, daarna induceren 3 uur met arabinose en IPTG, 1 mM elk. Oogst de cellen en bewaar de pellet bij -20 ° C.
- Resuspendeer de pellet in 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogeniseren en verstoren de cellen zoals beschreven in 2.4 en 2.5.
- Onmiddellijk Centrifugeer de cellen lysaat bij 10.000 xg gedurende 20 min. Gooi de pellet. Filtreer de bovenstaande vloeistof met een Büchner trechter uitgerust met 3 lagen papier filter. Pas lichte vacuüm. Om overmatige schuimvorming te voorkomen, moet het vacuüm Erlenmeyer op ijs tijdens filtratie.
- Bepaal eiwitconcentratie volgens Bradford 14.
4. gelfiltratiechromatografie
- Equilibreer een watermantel 16x70 (200) gelfiltratie kolom met 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Plaats op de kolom het oplosbare eiwit extract. Voor optimale resolutie, gebruik dan een 1 ml sample loop. Voer de chromatografie met 0,6 ml / min. Houd kolom temperatuur op 4 ° C in.
- Verzamel 0,9 ml fracties en analyseren door SDS-PAGE. Breng 20 pl van de genoemde fractie Eppendorf buizen die 60 pi H2O en 20 gl laadbuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) glycerol, 0,25% (w / v) broomfenol blauw) en koken gedurende 5 min. Plaats 18 gl van elk monster en voer de elektroforese bij 140 V gedurende 1,5 uur.
- Bepaal de 3'-5 'exonuclease en DNA polymerase activiteit van elke fractie met 96 well microplaten. Assay de exonuclease activiteit met thymidine 5'-monofosfaat p-nitrofenyl ester (p NP-TMP) als substraat 15. Schatting DNA polymerase activiteit met de PPX (pyrofosfatase, purine nucleoside fosforylase, xanthine oxidase) enzym-gekoppelde assay 16 en 2- (4-joodfenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5-fenyl-2H-tetrazoliumchloride (s) als elektronenacceptor 16.
5. Mutatie analyse van populaties Co-expressie het wildtype ε subeenheid van E. coli DNA polymerase III en het mutagene εD12A Variant
- Transfer een enkele kolonie van E. coli TOP10 die het pBAD-ε en pGOOD1-εD12A 11 vectoren om 1 ml LB-medium antibiotica. Incubeer O / N bij 37 ° C.
- Verdun de pre-kweek 1: 250 tot 3 flessen met vers medium (10 ml), voeg de juiste inductoren (arabinose, IPTG, of arabinose en IPTG, 1 mM elk) en incubeer bij 37 ° C8 uur. Bereid parallel niet-geïnduceerde kweken.
- Verzamel fracties van 1 ml, vervolgens verdund 1: 500 in nieuwe flessen met vers medium (10 ml), aangevuld of niet met de juiste inductoren. Incubeer O / N bij 37 ° C.
- Herhaal de stappen 5.2 en 5.3 en verzamel aliquots van 1 ml.
- Bepaal het aantal generaties deed zich voor in elke cultuur. Breng op LB-platen werd 100 ui van geschikte seriële verdunningen van inoculum en cultuur. Incubeer O / N bij 37 ° C. De kolonies op de LB-platen, en bereken de log van het aantal cellen aanwezig in het inoculum (log I) en in de cultuur eind groei (log C). Om het aantal generaties te bepalen, gebruikt u de volgende formule: (log C - log I) /0.301.
- Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 20 min en resuspendeer de cellen in 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl. Om de cellen permeabel, voeg 2-3 druppels chloroform en vortex gedurende 20 seconden.
- Bepaal de β-glucosidase activiteit van elk monster in een 96-well microplaat, met p-nitrofenyl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) als substraat. Voeg aan elk putje 100 pl gepermeabiliseerde cellen en 100 pl substraat (16 mg / ml voorraadoplossing in H2O). Zorg luchtbellen in de putjes te voorkomen. Lees de absorptie bij 420 nm met behulp van een microplaat reader en het juiste filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ε subeenheid van E. coli DNA polymerase III bestaat uit 243 aminozuren en heeft een slechte oplosbaarheid 17,18, tenzij de residuen 187-243 geschrapt 17. Wij hebben echter eerder aangetoond 11 dat de co-expressie van volledige lengte α, ε en θ subeenheden levert oplosbaar DNA polymerase III katalytische kern (figuur 1). Vooral met de pBAD-pGOOD co-expressiesysteem, we aangetoond dat: i) kan de overexpressie van α en ε subeenheden afzonderlijk worden ingesteld met arabinose en IPTG, respectievelijk (figuur 1A); ii) volledige lengte ε subeenheid kan worden gedetecteerd in oplosbare eiwitextracten geïsoleerd uit E. coli overexpressie α, ε en θ en onderworpen aan gelfiltratie (Figuur 1B). In dit geval werd exonuclease activiteit verdeeld in 3 belangrijke pieken (Figuur 1B, gevulde cirkels), en de piek gecentreerd op fractie 23 bleek de αεθ katalytische kern (figuren 1C en 1D) bevatten. De stabiliteit van ε sterk verhoogd na binding aan α en θ. Toen we eerder overexpressie full-length ε in E. coli, een geringe hoeveelheid vrije ε werd gedetecteerd met Western blotting in oplosbare eiwitextracten 19 (Figuur 2A). Het is interessant om op te merken dat, onder dezelfde voorwaarden, hebben we geconstateerd, steeds grotere hoeveelheden vrije C-ter afgeknotte vormen van ε (ε-234, ε-228, ε-213, of ε-186), waaronder ε-186 presteerde beter 19 (Figuur 2A). We hebben ook aangetoond dat de proteolyse van ε C-terminale domein wordt voorkomen door de binding aan α en θ subeenheden 19. Het effect eventuele co-expressie op oplosbaarheid van ε gemakkelijk worden getest. Zoals in figuur 2B, oplosbaar eiwit extracten geïsoleerd uit overexpressieα, ε of α en ε kunnen worden geanalyseerd door SDS-PAGE, en gunstig vergeleken met de totale eiwitextracten. In dit geval, de elektroforetische analyse aan dat, wanneer alleen overexpressie ε subeenheid kenmerken slechte oplosbaarheid (vergelijk lanen 1 en 2), terwijl de co-expressie van α verbetert de concentratie ε in oplosbare eiwitextracten (vergelijk de lanen 3 en 4 ).
Co-expressie kan ook worden gebruikt voor inter-species complementatie tests. Daarom dachten we dat het misschien van belang zijn voor de interactie tussen subeenheden die behoren tot de replicatieve machines van Gram + en Gram evalueren -. Bacteriën Deinococcus radiodurans is een Gram + bacterie, met een grote α subunit (1335 aminozuren, 150 kDa) en een vermoedelijk ε subunit bevattende 197 aminozuren. Interessant D. radiodurans ε subeenheid is verstoken van het C-terminale domein aanwezig in de E. coli E. coli en D. radiodurans ε subeenheden gelijk aan 29% en 59%, respectievelijk (gezien de regio 1-178, D. radiodurans coördinaten). Tot de bevoegdheid van D. assay radiodurans polymerase III α subeenheid (α Dr) in binding E. coli ε subeenheid hebben we gekloneerd in de vector pBAD een synthetisch gen dat codeert voor α Dr en wij hebben samen getransformeerde E. coli pBAD-α Dr en pGOOD-ε. De gelijktijdige toevoeging van IPTG en arabinose aan het kweekmedium activeert de co-expressie van α Dr en ε (figuur 3A). De vereniging van deze 2 eiwitten werd getest door gel filtratie. Cellen co-expressie brengen van het DNA-polymerase III α Dr en ε subeenheden werden verzameld door centrifugeren (5000 x g, 20 min), gesuspendeerd in lysisbuffer, opengebroken door sonificatie en de oplosbare proteïnen werden onmiddellijkly geladen op een Superdex 200 kolom (figuur 3B). Zoals figuur 3C toont, wanneer het verzamelde fracties werden onderworpen aan 3'-5 'exonuclease en DNA polymerase activiteit assays, werden de activiteit pieken gedetecteerd aanzienlijk verschoven posities suggereert dat α Dr niet bevoegd bindende E. coli ε subeenheid. Dit werd bevestigd wanneer hoeveelheden van fracties 32, 36 en 52 werden geconcentreerd en geanalyseerd door SDS-PAGE. Fractie 36 bleek α Dr bevatten en verstoken van E. te coli ε subeenheid, terwijl fractie bevatte 52 E. coli ε maar miste α Dr (Figuur 3D).
Replicatie trouw vooral steunt op het vermogen van DNA-polymerase te discrimineren foutieve basenparingen tijdens DNA-extensie. Toch kunnen niet-passende deoxynucleotiden op 10 -4 frequentie 20 worden opgenomen, en de actievan 3'-5 'exonucleasen is essentieel om de nieuw gesynthetiseerde DNA-streng nagelezen. Bovendien werd geschat dat dit DNA bewerken actie verhoogt replicatie trouw door 3 ordes van grootte 20. Bijgevolg kan mutatorstammen worden geconstrueerd door afbreuk DNA proeflezen, bijvoorbeeld door voorwaardelijk uitdrukken van een mutagene variant van E. coli DNA polymerase III ε subeenheid. Dit kan worden verkregen construeren van een variant van ε bevoegd bindende α maar zonder de proofreading activiteit en op de vorming van mutagene ε door geschikte expressiesystemen. Met deze strategie werd aangetoond dat E. coli mutatie frequentie toeneemt onder voorwaarden inducerende mutagene varianten van ε 11,21. Er zijn echter geen fijnafstelling van de mutatie frequentie werd bereikt door deze middelen. Eiwit co-expressie kan worden gebruikt om een betere controle van mutatorstammen verkrijgen. Om dit doel, we gecotransformeerd E. colipBAD-ε en pGOOD1-εD12A, teneinde de expressie van het wildtype en de mutagene D12A variant van ε respectievelijk arabinose en IPTG induceren. Als fenotypische testen, hebben we de verschijning van β-glucosidase activiteit die cryptische (Bgl -) in wild-type E. coli 22,23. Spontane mutanten kunnen β-glucosiden als koolstofbron (Bgl +) gebruik kunnen worden verrijkt of geïsoleerd die vloeibare of 23 vaste media 24, respectievelijk. Wanneer cellen werden geïnduceerd om de D12A mutagene variant tot expressie werd β-glucosidase verworven ca. 20 generaties (figuur 4A). Opgemerkt wordt dat een soortgelijke trend werd waargenomen in niet-geïnduceerde cellen (Figuur 4A), waarschijnlijk omdat de transcriptionele controle uitgeoefend op pGOOD1 eerder lek 11. Wanneer echter het wildtype ε subeenheid werd geïnduceerd, alleen of in combinatie met de D12A variant, β-glucosidaseactiviteit werd overgenomen door E. coli op een gematigd niveau (figuur 4A). De β-glucosidase activiteit van BglII + mutanten gerapporteerd tussen 3 en 40 uM / min 23 bereik. Het niveau hier bepaald in E. coli bevolking onderworpen aan de uitdrukking van εD12A is veel lager, maar het moet worden bedacht dat we niet proberen om Bgl + mutanten isoleren op vaste media.
Figuur 1. Co-expressie van E. coli DNA polymerase III katalytische kern. (A) SDS-PAGE totale eiwitten geëxtraheerd uit E. coli TOP10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 gekweekt in afwezigheid van inductoren, in aanwezigheid van slechts arabinose, van IPTG alleen of medium aangevuld met zowel arabinose en IPTG (lanen 1-4, respectievelijk). (B) Absorptie (lege cirkels) en exonuclease activiteit (gevulde cirkels) van fracties geïsoleerd onderwerpen aan gelfiltratie oplosbare proteïnen geëxtraheerd uit E. coli TOP10 overexpressie α, ε en θ subeenheden van E. coli DNA Pol-III. (C) SDS-PAGE van fracties 6, 12, 23, 31, en 41 (lanen 1-5, respectievelijk) rapporteerde in paneel B. (D) SDS-PAGE van een geconcentreerde portie van fractie 23, waarvan exonuclease activiteit en elektroforetische patroon worden in panelen B en C, respectievelijk. Overgenomen met toestemming van de biotechnologie Letters, 33, Conte et al. "PGOODs: nieuwe plasmiden voor de co-expressie van eiwitten in Escherichia coli.", 1815-1821 (2011) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Proteolyse van E. coli DNA polymerase III ε subeenheid. (A) Afbraak van monomeer zoals onthuld door Western blotting van eiwitten geëxtraheerd uit E. coli TOP10 overexpressie volledige lengte of afgeknotte vormen van ε; pijlpunten geven de positie van 25 en 19 kDa vooraf gekleurde moleculaire merkers. Herdrukt met toestemming van Elsevier uit Biochimica et Biophysica Acta Eiwitten en Proteomics, 1794, Bressanin et al. "Proteolyse van het proeflezen subunit regelt de assemblage van Escherichia coli DNA polymerase III katalytische kern", 1606-1615 (2009). (B) Co-expressie van α en ε subeenheden van E. coli DNA polymerase III katalytische kern. SDS-PAGE van totale (lanen 1 en 3) en oplosbare (lanen 2 en 4) eiwit extracts geïsoleerd uit overexpressie ε subeenheid (lanen 1 en 2), of α en ε subeenheden (lanen 3 en 4).
Figuur 3. Co-expressie van DNA polymerase III α en ε subeenheden Deinococcus radiodurans en Escherichia coli, respectievelijk. (A) SDS-PAGE van totale eiwitextracten geïsoleerd uit cellen niet induceerde (laan 1), of aangezet overexpressie α Dr, ε of α Dr en ε (lanen 2-4, respectievelijk). (B) Gaschromatogram (lege cirkels, linker as) en de eiwitconcentratie van fracties (gevulde cirkels, rechteras) geëlueerd vormen een gelfiltratiekolom (Superdex 200) geladen met oplosbare eiwitten gewonnen uit E. coli overexpressie α Dr eennd ε subeenheden. (C) Het corrigeren (lege cirkels, linkeras) en DNA polymerase (gevulde cirkels, rechteras) van de vrije fracties gerapporteerd in paneel B. (D) SDS-PAGE van geconcentreerde hoeveelheden van fracties 32, 36 en 52. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Mutatie frequentie van E. coli cellen blootgesteld of niet co-expressie van het wildtype en de mutagene variant D12A DNA polymerase III ε subeenheid. De kaart van de nieuwe plasmide pFINE wordt ook getoond. (A) β-glucosidase activiteit van E. coli TOP10 niet geïnduceerde (Geen Ind) of onderworpen aan overexpressie van wild-type ε subunit (Ara), het mutagene variant D12A (IPTG) of zowel wildtype en D12A ε subeenheden (Ara + IPTG). De β-glucosidase activiteit wordt gerapporteerd als functie generaties. (B) Kaart van de nieuwe expressievector pFINE. De meervoudige kloneringsplaats (MCS) van dit plasmide is identiek aan die aanwezig in de compatibele pBAD en pGOOD vectoren, waardoor gemakkelijke pendelen van genen onder hen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eiwitten kunnen intrinsiek ontvouwen, die gebieden waarvan de tertiaire structuur is niet beperkt tot een beperkt aantal conformaties 25. Deze ontvouwen eiwitten zijn meestal gevoelig voor aggregatie 25, en hun isolatie en karakterisering misschien een moeilijke taak te vertegenwoordigen. De ε subeenheid van E. coli DNA polymerase III is voorzien van twee verschillende domeinen 26,27, te weten: i) de N-ter-domein met het 3'-5 'exonucleaseactiviteit, en die bevoegd zijn op het binden van de θ subunit; ii) de C-ter domein verantwoordelijk is voor de binding aan de α (polymerase) subeenheid. De C-ter domein van ε is bekend dat slechte oplosbaarheid verlenen tegen dit eiwit, bevorderen de aggregatie. Er werd inderdaad aangetoond dat ε-186, een afgeknotte vorm van het eiwit zonder het C-ter domein, oplosbaar, en kan worden gezuiverd met hoge opbrengsten 17. Wanneer echter de interactie van ε met α is kwantitatief worden bestudeerd(Bijvoorbeeld het bepalen van de Kd van de αε complex), wordt de zuivering van volledige lengte ε nodig, wat een moeilijke biochemische taak. In dit kader, proteïne co-expressie verschaft kwalitatieve schattingen van de binding van ε aan α. We hebben aangetoond dat hoge opbrengsten van de αεθ in vivo kan worden verkregen door co-expressie (figuur 1), het omzeilen van de slechte oplosbaarheid van ε subeenheid. Opvallend is de zuivering van overexpressie αεθ complexe gerapporteerd 28,29. De co-expressie strategie kan ook worden gebruikt om te testen of de insertie van plaatsspecifieke mutaties in één van de interagerende partners belemmert complexvorming. Dienovereenkomstig eiwit co-expressie is een geschikte en snelle hulpmiddel kwalitatieve testen eiwit-eiwit interacties voeren. Ook moet worden opgemerkt dat onze co-expressiesysteem gebaseerd op 2 verschillende inductoren, dwz arabinose en IPTG. Daarom kunnen geschikte controles gemakkelijk worden uitgevoerd bij het testen van de vorming van een eiwitcomplex, bijvoorbeeld het weglaten van een inductor uit de bacteriële groeimedium (Figuur 1A).
We presenteerde hier een optimale procedure voor de co-expressie van de α en ε subeenheden van E. coli DNA polymerase III. Wanneer dit protocol is ontworpen en getest, werden de volgende parameters geïdentificeerd als cruciaal voor het succes van co-expressie-experimenten: i) de temperatuur waarbij de inductie wordt uitgevoerd; ii) de tijd-lengte van inductie; iii) de concentratie van de inductor (s). Vooral niet gelukt oplosbaar αεθ complex 11 kan van cellen geïnduceerd bij 37 ° C, onafhankelijk van de inductietijd. Wij stellen daarom te testen verschillende temperaturen voor de inductie stap en de overexpressie van eiwitten controleren als functie van de tijd. Bovendien, de parallelle evaluatie van co-expressie in diffErent E. coli-stammen kunnen helpen wanneer geconfronteerd met matige opbrengsten van het doel eiwitten.
We hebben hier gerapporteerd een representatief experiment uitgevoerd om te testen de binding van proteïnen van verschillende soorten, en we hebben aangetoond dat eiwit co-expressie nuttig om snel testen is bij 2 heterologe eiwitten in een hybride functioneel complex. Gelfiltratiechromatografie werd hier gebruikt om complexvorming (figuur 3) te evalueren. Echter, de toevoeging van een geschikte tag één van de interagerende partners deze evaluatie vergemakkelijken, laat het gebruik van affiniteitsinvangmiddel methoden. Om interferentie van de tag met eiwit-eiwit interacties voorkomen, kan het gen dat codeert voor één van de interagerende partners parallel worden ingevoegd in pBAD / His en pBAD / Myc-His vectoren respectievelijk toekennen van een hexahistidine motief bij de N- en C terminus van het doeleiwit.
E. coli Mutator stammen beschikken mutatie frequenties hoger dan hun wild-type tegenhangers. Mutatorstammen van belang zijn in de biotechnologie 30, bijvoorbeeld, om snel te evolueren een doel stam naar nieuwe, gewenste, fenotypes. Wij ontvangen hier aangetoond dat co-expressie van de wild-type en een mutagene ε subeenheid van E. coli DNA polymerase III, de mutatiefrequentie van de bacteriële gastheer kan worden afgestemd met voldoende gemak. Ter verbetering van deze technologie, strak gereguleerde expressievectoren noodzakelijk zoveel mogelijk de expressie van de sterk mutagene D12A variant van ε subeenheid onderdrukken. Met name zou het interessant zijn om de mutatiefrequentie in E. testen coli getransformeerd met het pBAD-εD12A en pGOOD1-ε, dwz de configuratie alternatief dat hier gepresenteerd. De pBAD vectoren zijn inderdaad bekend om strak gereguleerd 12, en deze functie zou kunnen helpen bij het houden van de basale concentratie van εD12Aop een laag niveau.
De voorbeelden van eiwitten co-expressie hier gerapporteerde getuigen de veelzijdigheid van deze techniek. Het is echter belangrijk op te merken dat het gebruik van een veelheid van compatibele plasmiden enkele E. coli-cellen kunnen heel veel nieuwe uitdagingen die door proteïne co-expressie kan worden. De laatste jaren werd intensief werk besteed aan het repertoire van compatibele plasmiden worden gebruikt voor eiwit co-expressie breiden. Vooral een ternair systeem vertrouwen op compatibele plasmiden die het ColE1, p15A en pSC101 oorsprong van replicatie werd gebruikt voor co-expressie of bacteriële en dierlijke eiwitten 31. Onlangs werd een quaternair co-expressiesysteem gerapporteerd. In dit geval werden 13 heterologe genen co-expressie gebracht in E. coli gecotransformeerd met 4 verenigbare expressievectoren, die de ColE1, p15A, CloDF13 en RSF oorsprongen van replicatie 32. Deze co-expressiesysteem werd met succes gebruikt voor producerenE. coli functioneel actieve oplosbare hydrogenase I van Pyrococcus furiosus 32. Om binair systeem vergroten, construeerden wij een nieuwe expressievector pFINE gemaakt met het pSC101 oorsprong van replicatie, een neomycine-resistentie cassette, en het lac regulerende elementen (figuur 4B). Dit plasmide bevat dezelfde polylinker aanwezig in pBAD en pGOOD vectoren, waardoor gen shuttling tussen de 3 componenten van het co-expressiesysteem te vergemakkelijken. Hoewel pFINE is een laag aantal kopieën plasmide, werd de stabiliteit ervan bevredigend bevonden bij testen met rijk medium. We zijn momenteel bezig met de verdere uitbouw van onze ternair co-expressie systeem. Hiertoe construeerden wij een pBAD derivaat dat een chloramfenicol-resistentie cassette, en we zijn op weg om de ColE1 replicatieoorsprong uitwisseling met een geschikt ColE1, p15A en pSC101. Het is inderdaad onze mening het gebruik van meerdere plasmiden in een enkele E. coli-cellen rephekel een krachtig instrument om de uitdrukking te dagen in vivo van eiwitcomplexen samengesteld uit een veelheid van verschillende subeenheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De toestemming van Springer en Elsevier cijfers herdruk is sterk erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
