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Biology

प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के बहुमुखी लाभ में Published: February 5, 2015 doi: 10.3791/52431
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

Introduction

overexpression प्रौद्योगिकियों की शुरुआत कम प्रतिलिपि संख्या एंजाइमों के जैव रासायनिक अध्ययन और औषधीय सक्रिय प्रोटीन (जैसे, इंसुलिन) के औद्योगिक उत्पादन या तो बढ़ाया है। इन प्रौद्योगिकियों के आगमन के बाद से, महत्वपूर्ण प्रगति पुनः संयोजक प्रोटीन की उपज और गुणवत्ता बढ़ाने के लिए हासिल किया गया है। इसके अलावा, प्रोकार्योटिक 1,2 और यूकेरियोटिक 3 overexpression सिस्टम प्रोटीन जैव प्रौद्योगिकी, यानी, Escherichia कोलाई के "काम घोड़ा" के लिए उपयोगी विकल्प की पेशकश की, पिछले कुछ वर्षों में विकसित किया गया। ई करने के लिए वैकल्पिक प्लेटफार्मों की विशेष रूप से, उपलब्धता कोलाई पुनः संयोजक पेप्टाइड्स या बाद translational संशोधनों असर प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए नेतृत्व किया। हालांकि, यह है कि उल्लेख किया जाना चाहिए ई कोलाई अभी भी पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए पसंद की जीव का प्रतिनिधित्व करता है। यह सबसे अधिक प्रासंगिक हो सकता है, जो बीच में कई कारकों की वजह से हैमाना जाता है: मैं) overexpression सिस्टम (अभिव्यक्ति वैक्टर और दबाव की काफी संख्या की उपलब्धता) ई के लिए कोलाई 1,2; ई की द्वितीय) लघु पीढ़ी बार, और उच्च बायोमास पैदावार, अमीर और सिंथेटिक मीडिया के एक किस्म में कोलाई; iii) के जैव रासायनिक और इस सूक्ष्मजीव की आनुवंशिक स्तर पर या तो सतही हेरफेर; चतुर्थ) जहरीले प्रोटीन 4 का उत्पादन करने में सक्षम उपभेदों के अलगाव; V) जनसंख्या स्तर 5,6 पर सजातीय प्रेरण की विशेषता उपभेदों का निर्माण। इसके अलावा, यह हाल ही में ई में उत्पादन के लिए उपयुक्त है कि अभिव्यक्ति सिस्टम दिखाया गया था पोस्ट-translationally संशोधित प्रोटीन की कोलाई तैयार कर लिया है और 2 का निर्माण किया जा सकता है।

वर्तमान में, प्रोटीन overexpression मुख्य रूप से जिसका hypersynthesis एक उपयुक्त प्लाज्मिड में क्लोन एक जीन के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है मोनोमेरिक या होमो-oligomeric प्रोटीन प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, ध्यान हाल ही में किया गया थाई का निर्माण करने के लिए भुगतान कोलाई प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्रणाली, असमलैंगिक oligomeric परिसरों 2 की, विवो में, उत्पादन को चुनौती दे। दिलचस्प है, प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के प्रारंभिक प्रयोगों cyanobacterial ribulose-1,5-बाइफोस्फेट कार्बोज़ाइलेस / oxygenase 7,8 के बड़े और छोटे सब यूनिटों की अंतर-प्रजाति, विधानसभा और एचआईवी -1 से छोटा और पूर्ण लंबाई रूपों की एसोसिएशन को संबोधित किया ट्रांसक्रिपटेस 9 रिवर्स। इन अग्रणी पढ़ाई प्रोटीन सह अभिव्यक्ति विट्रो पुनर्गठन में पारंपरिक करने के लिए एक शक्तिशाली विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है कि प्रदर्शन किया। ई में इसके अलावा, प्रोटीन सह अभिव्यक्ति कोलाई अप्राकृतिक अमीनो एसिड दो युक्त प्रोटीन प्राप्त करने के लिए, बाद translational संशोधनों 2 असर अलग प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए, और overexpressed झिल्ली प्रोटीन 2 की उपज बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, एक उपकरण के रूप में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति की क्षमता का ई करने के लिए प्रदान करने के लिए कोलाई प्रतिस्पर्धाप्रोटीन स्राव में nce के सक्रिय जांच 2 के अधीन है।

ई में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति की दो मुख्य रणनीतियों कोलाई चलाया जा सकता है: विभिन्न जीनों की मेजबानी के लिए एक एकल प्लाज्मिड का उपयोग overexpressed होने के लिए मैं); द्वितीय) एकल कक्षों में कई plasmids के उपयोग के लक्ष्य प्रोटीन सह-व्यक्त करने के लिए। मिलकर प्रमोटर / ऑपरेटर तत्वों से युक्त विशेष प्लास्मिड सह अभिव्यक्ति 10 के लिए निर्माण किया गया है, हालांकि पहले मामले में, प्लाज्मिड के चुनाव के लिए मापदंड, पारंपरिक एकल प्रोटीन overexpression के प्रयोगों के उन लोगों से अलग नहीं है। यह पहला दृष्टिकोण इसलिए काफी सरल है। हालांकि, यह अलग प्रोटीन सह-व्यक्त करने के लिए एक एकल प्लाज्मिड के उपयोग के दो प्रमुख कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है कि उल्लेख किया जाना चाहिए: मैं) के सह-व्यक्त प्रोटीन की संख्या सीमित की मेजबानी जीनों की संख्या के साथ वेक्टर बढ़ जाती है, के आणविक जन; द्वितीय) एकाधिक जीन एक ही प्रमोटर के नियंत्रण के तहत क्लोन कर रहे हैं, जब polarity के decreas कर सकते हैंप्रमोटर से बाहर का जीनों की अभिव्यक्ति ई। एकल ई में दोहरी या कई plasmids के उपयोग कोलाई कोशिकाओं इसलिए plasmids के पात्र संयोजन करने के लिए बाधाओं लगाने, चुनाव के वैक्टर की अनुकूलता को पूरा करने के लिए है। हालांकि, इस दूसरे सह अभिव्यक्ति रणनीति वैक्टर की आणविक जन युक्त का लाभ सुविधाएँ, और polarity सीमित करता है। हमने हाल ही में सह अभिव्यक्ति प्लास्मिड 11 के बीच जीनों के चक्कर सुविधा के लिए बनाया एक प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्रणाली का निर्माण किया। विशेष रूप से, हम pGOOD वैक्टर श्रृंखला का निर्माण, प्रासंगिक, जो सुविधाओं के होते हैं: मैं) प्रतिकृति के एक p15A मूल, वाणिज्यिक वैक्टर (जैसे, pBAD श्रृंखला 12) ColE1 मूल को रोकने के साथ pGOOD प्लास्मिड की अनुकूलता प्रदान करने के लिए; ii) टेट्रासाइक्लिन-प्रतिरोध कैसेट; III) लाख की उपस्थिति नियामक तत्व है, यानी, प्रवर्तक-संचालक (ओ 1) जोड़े और Laci व्युत्पन्न क्यू जीन। एक उपयुक्त pBAD-pGOOD जोड़ी का उपयोग कर, हम ई की उत्प्रेरक कोर overexpress करने में सक्षम थे तीन अलग-अलग यूनिटों से बना कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ III, यानी, α (5'-3 'पोलीमर्स), ε (3'-5' exonuclease) और (स्थिर ε) 13 θ। विशेष रूप से, हम αεθ परिसर के सह अभिव्यक्ति ई अलावा करने के लिए सख्ती पर निर्भर था कि प्रदर्शन IPTG और arabinose दोनों की कोलाई संस्कृति के माध्यम से, pGOOD और pBAD, क्रमशः (चित्रा 1 ए) से ट्रिगर overexpression।

वर्तमान रिपोर्ट में, हम प्रोटीन सह अभिव्यक्ति कुशलता से एक प्रोटीन जटिल सबयूनिट के गरीब विलेयता से जुड़ा हुआ कठिनाइयों को हल कर सकते वर्णन कैसे। इसके अलावा, हम कैसे विवो प्रोटीन पूरक परीक्षा में प्रदर्शन किया जा सकता है दिखाने के लिए, और हम अंत में ई में धुन उत्परिवर्तन आवृत्ति के लिए प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के उपयोग पर रिपोर्ट ज़ीनमेँ। इस उद्देश्य के लिए, हम प्रत्येक मामले के अध्ययन के लिए प्रासंगिक उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए उपयुक्त pGOOD-pBAD जोड़ों का इस्तेमाल किया।

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Protocol

ई 1. अलगाव कोलाई सह-transformants

  1. उचित ई की विद्युत सक्षम कोशिकाओं को तैयार कोलाई तनाव तब्दील किया जाना है। लेग माध्यम से 1 मिलीलीटर (Tryptone, खमीर निकालने, 10 पर NaCl, 5, और 10 ग्राम / क्रमशः एल,) पसंद का तनाव का एक ही कॉलोनी, और स्थानांतरण करने के लिए 180 आरपीएम के झटकों की शर्तों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पूर्व संस्कृति एक पतला: 500 ताजा लेग मध्यम मिलीलीटर 25 में और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं।
  2. लॉग-चरण (0.6 ओवर ड्राफ्ट) पर 20 मिनट के लिए 5000 XG) में कोशिकाओं निलंबन अपकेंद्रित्र, और मूल संस्कृति मात्रा की छमाही में 10%, वी / वी बर्फ ठंड बाँझ ग्लिसरॉल-पानी में गोली resuspend। हर बार मेजबान मात्रा संयोग, इस कदम से 4 बार दोहराएँ। अंत में, ग्लिसरॉल / पानी में गोली resuspend और 50 μl aliquots में कोशिकाओं निलंबन विभाजित करते हैं। 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस के ऊपर पर aliquots स्टोर।
  3. 0.5 मिमी EDTA के साथ पूरक बाँझ पानी में वांछित प्लाज्मिड भंग। आईसी पर पिघलनाई विद्युत सक्षम कोशिकाओं के एक विभाज्य और सदिश का एक उचित मात्रा (2.5-5 एनजी) के साथ मिश्रण। Electroporation के लिए उपयुक्त एक 0.1 सेमी क्युवेट में मिश्रण बांटना, और 1.8 केवी लागू होते हैं।
  4. इसके तत्काल बाद समाज माध्यम से 1 मिलीलीटर में electroporated कोशिकाओं हस्तांतरण (लेग मध्यम डब्ल्यू 0.2% / वी ग्लूकोज, 10 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी KCl के साथ पूरक), झटकों के तहत 1 घंटे के लिए सेते हैं, और अंत युक्त पेट्री डिश के लिए 100 μl aliquots के हस्तांतरण उचित एंटीबायोटिक के साथ लेग अगर। 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  5. पेट्री डिश पर एकल कालोनियों streaking द्वारा transformants शुद्ध।
  6. प्राथमिक transformants की विद्युत सक्षम कोशिकाओं को तैयार है और दोहराने आगे plasmids के साथ परिणत करने के लिए 1.1-1.5 कदम।
  7. सह-transformants की ग्लिसरॉल शेयरों तैयार करें। उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक लेग में एक भी कॉलोनी स्थानांतरण, झटकों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और प्रवेश-चरण (0.6 ओवर ड्राफ्ट) अपकेंद्रित्र 20 मिनट के लिए 5000 XG पर कोशिकाओं निलंबन पर। आरमध्यम 15% वी / वी ग्लिसरॉल युक्त लेग-एंटीबायोटिक दवाओं में गोली esuspend। Aliquots में बांटना और कम से स्टोर - 80 डिग्री सेल्सियस।

ई की α और ε सब यूनिटों की 2. सह अभिव्यक्ति कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ III के

  1. एक बाँझ पाश के साथ उचित तनाव ग्लिसरॉल स्टॉक की एक छोटी राशि स्थानांतरण लेग मध्यम और एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त एक पेट्री डिश में (जैसे, top10 / pGOOD-ε243 और top10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, चित्रा 1 देखें)। कोशिकाओं छोटी बूंद कोशिकाओं निलंबन पेट्री डिश पर सूखी, और लकीर करते हैं। 37 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
  2. एक बाँझ दन्तखुदनी, लेग-एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से 1 मिलीलीटर के लिए एक एकल कॉलोनी का उपयोग करते हुए स्थानांतरण,। 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटा सेते हैं। ताजा माध्यम में 500 और 15 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते: पूर्व संस्कृति एक पतला।
  3. IPTG, arabinose, या arabinose और IPTG, 1 मिमी प्रत्येक जोड़ें। 2.5 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। कोशिकाओं को ले लीजिए, और -20 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों की दुकान।
  4. Lysis बफर (50 मिमी Tris-एचसीएल, 50 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 2.5 मिमी dithiothreitol, 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF), पीएच 8) में बर्फ और resuspend पर पिघलना छर्रों। धीरे से एक गिलास ठंडा कुम्हार के साथ कोशिकाओं निलंबन homogenize।
  5. 15 सेकंड ठंडा अंतराल (4 चक्र) के बाद 15 सेकंड के लिए 15 डब्ल्यू, पर sonicate।
  6. घुलनशील अंश ठीक करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 10,000 XG पर कुल प्रोटीन के अर्क अपकेंद्रित्र।
  7. एसडीएस पृष्ठ (12.5% ​​एक्रिलामाइड) प्रत्येक घुलनशील प्रोटीन निकालने की aliquots से विश्लेषण करें। इस उद्देश्य के लिए, एच 2 ओ के 60 μl और लदान बफर (250 मिमी Tris-एचसीएल पीएच के 20 μl युक्त Eppendorf ट्यूब करने के लिए प्रत्येक घुलनशील प्रोटीन निकालने के 20 μl हस्तांतरण 6.8, 10 मिमी β-mercaptoethanol, 10% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस, 50% (वी / वी) ग्लिसरॉल, 0.25% नीला (डब्ल्यू / वी) bromophenol) और 5 मिनट के लिए उबाल लें। लोड प्रत्येक नमूने के 18 μl और के बारे में 1.5 घंटे के लिए 140 वी पर वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करते हैं।

Deinococ की α सबयूनिट 3. सह अभिव्यक्तिग्राहकों radiodurans डीएनए पोलीमरेज़ III और ε ई की सबयूनिट कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ III के

  1. ई के एक पूर्व संस्कृति को तैयार कोलाई तनाव top10 / डॉ pBAD-α / लेग-एम्पीसिलीन-टेट्रासाइक्लिन माध्यम से 1 मिलीलीटर में pGOOD-ε243 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटा सेते हैं। ताजा माध्यम में 1000 और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं: एक पतला।
  2. एक पतला: ताजा माध्यम से 100 से 200 में मिली, तो arabinose और IPTG, 1 मिमी से प्रत्येक के साथ तीन घंटे के लिए प्रेरित, 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। कोशिकाओं फसल, और -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली दुकान।
  3. 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी PMSF में गोली resuspend। Homogenize और 2.4 और 2.5 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को बाधित।
  4. इसके तत्काल बाद कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 10,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र। गोली त्यागें। कागज फिल्टर की तीन परतों के साथ सुसज्जित एक BUCHNER कीप के साथ सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर। कोमल वैक्यूम लागू करें। अत्यधिक झाग से बचने के लिए, छानने का काम के दौरान बर्फ पर वैक्यूम Erlenmeyer फ्लास्क रहते हैं।
  5. ब्रैडफोर्ड 14 के अनुसार प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।

4. जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी

  1. 50 मिमी Tris-एचसीएल, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, पीएच स्तंभ पर 8. लोड घुलनशील प्रोटीन निकालने के साथ एक पानी तख्ताबंदीवाला 16x70 (200) जेल निस्पंदन स्तंभ संतुलित करना। इष्टतम संकल्प के लिए, एक 1 मिलीलीटर नमूना पाश का उपयोग करें। / मिनट 0.6 मिलीलीटर पर क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन करते हैं। भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ तापमान रखें।
  2. 0.9 मिलीलीटर अंशों लीजिए और एसडीएस पृष्ठ से उन्हें विश्लेषण। स्थानांतरण एच 2 ओ के 60 μl और लदान बफर (250 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 6.8, 10 मिमी β-mercaptoethanol, 10% (/ वी) एसडीएस डब्ल्यू, 50% से 20 μl युक्त Eppendorf ट्यूब करने के लिए प्रत्येक प्रासंगिक अंश के 20 μl ( वी / वी) ग्लिसरॉल, 0.25% (नीला डब्ल्यू / वी) bromophenol) और 5 मिनट के लिए उबाल लें। लोड प्रत्येक नमूने के 18 μl और के बारे में 1.5 घंटे के लिए 140 वी पर वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करते हैं।
  3. 3'-5 'exonuclease और प्रत्येक अंश के डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि 96 हम में निर्धारितडालूँगा microplates। सब्सट्रेट के रूप में 15 thymidine 5'-मोनोफास्फेट पी-nitrophenyl एस्टर (पी एनपी टीएमपी) का उपयोग exonuclease गतिविधि परख। PPX (pyrophosphatase, purine न्यूक्लीओसाइड phosphorylase, xanthine oxidase) एंजाइम मिलकर परख 16 और का उपयोग डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का अनुमान 2- (4-Iodophenyl) -3 (4-nitrophenyl) -5-फिनाइल-2H-tetrazolium क्लोराइड (int) इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में 16।

जनसंख्या ई के जंगली प्रकार ε सबयूनिट सह व्यक्त की 5. उत्परिवर्तन विश्लेषण कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ III और mutagenic εD12A संस्करण

  1. ई की एक भी कॉलोनी स्थानांतरण pBAD-ε और लेग-एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से 1 मिलीलीटर pGOOD1-εD12A 11 वैक्टर युक्त कोलाई top10। 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  2. (Arabinose, IPTG, या arabinose और IPTG, 1 मिमी प्रत्येक) उपयुक्त inducers जोड़ने, ताजा मध्यम (10 एमएल) युक्त 250 3 में बोतल और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते: पूर्व संस्कृति एक पतलाआठ घंटे के लिए। समानांतर गैर प्रेरित संस्कृतियों में तैयार करें।
  3. 1 मिलीलीटर की aliquots लीजिए, तो एक पतला: ताजा मध्यम (10 एमएल) युक्त नई बोतल में 500 उचित inducers के साथ पूरक है या नहीं। 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  4. दोहराएँ 1 मिलीलीटर की 5.2 और 5.3 और इकट्ठा aliquots के कदम।
  5. पीढ़ियों की संख्या हर संस्कृति में हुई निर्धारण करते हैं। लेग प्लेटें, inoculum और संस्कृति का उचित धारावाहिक dilutions के 100 μl पर स्थानांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं। लेग प्लेटों पर कालोनियों गणना, और विकास (सी लॉग इन करें) के अंत में inoculum में मौजूद है (मैं लॉग इन करें) और संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या के प्रवेश की गणना। पीढ़ियों की संख्या निर्धारित करने के लिए, सूत्र का उपयोग करें: (सी लॉग इन - मैं लॉग इन करें) /0.301।
  6. 20 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र और 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.6, 50 मिमी NaCl के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं permeabilize करने के लिए, 20 सेकंड के लिए क्लोरोफॉर्म और भंवर के 2-3 बूँदें जोड़ें।
  7. Β- का निर्धारण करते हैंसब्सट्रेट के रूप में पी -nitrophenyl-β-डी-glucopyranoside (PNPGluc) का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से microplate में प्रत्येक विभाज्य की glucosidase गतिविधि,। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए permeabilized कोशिकाओं के 100 μl और सब्सट्रेट के 100 μl (16 मिलीग्राम / एच 2 ओ में मिलीलीटर शेयर समाधान) जोड़ें। कुओं में हवा के बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखना। एक microplate पाठक और उपयुक्त फिल्टर का उपयोग कर, 420 एनएम पर absorbance पढ़ें।

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Representative Results

ई की ε सबयूनिट कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ III के 243 अमीनो एसिड होते हैं और अवशेषों 187-243 17 नष्ट हो जाती हैं, जब तक कि गरीब विलेयता 17,18 सुविधाएँ। हालांकि, हम पहले से पूर्ण लंबाई α, ε, और θ सब यूनिटों के सह-अभिव्यक्ति घुलनशील डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय उत्प्रेरक कोर (चित्रा 1) कि पैदावार में 11 से पता चला है। मैं) α और ε सब यूनिटों की overexpression स्वतंत्र रूप arabinose और IPTG, क्रमशः (चित्रा 1 ए) के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है;: विशेष रूप से, pBAD-pGOOD सह अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम उस का प्रदर्शन द्वितीय) पूर्ण लंबाई ε सबयूनिट ई से अलग घुलनशील प्रोटीन के अर्क में पता लगाया जा सकता है कोलाई कोशिकाओं ε, α overexpressing, और θ और जेल निस्पंदन (चित्रा 1 बी) के अधीन है। इस मामले में, exonuclease गतिविधि तीन प्रमुख चोटियों (चित्रा 1 बी, भरा हलकों) में वितरित किया गया है, और चोटी frac पर केन्द्रितtion के 23 αεθ उत्प्रेरक कोर (आंकड़े 1C और -1 डी) को शामिल करने के लिए दिखाया गया था। ε की स्थिरता बहुत α और θ के लिए बाध्य करने पर बढ़ जाती है। हम पहले से ई में पूर्ण लंबाई ε overexpressed जब कोलाई, मुक्त ε की एक कम राशि में घुलनशील प्रोटीन में पश्चिमी सोख्ता द्वारा खोजा गया था 19 (2A चित्रा) निकालता है। Ε-186 जो बीच में ऐसा लगता है कि दिलचस्प है ध्यान दें, एक ही परिस्थितियों में, हम हमेशा ε से मुक्त सी-आतंकवाद छोटा रूपों (ε-234, ε-228,-ε 213, या ε-186) की उच्च मात्रा का पता चला प्रदर्शन कर बेहतर 19 (2A चित्रा)। हम यह भी ε सी टर्मिनल डोमेन के प्रोटियोलिसिस α के लिए बाध्यकारी और θ सब यूनिटों 19 से रोका जाता है कि दिखा था। प्रभाव, यदि कोई हो, ε की विलेयता पर सह अभिव्यक्ति का आसानी से परीक्षण किया जा सकता है। चित्रा 2B में सूचना दी, घुलनशील प्रोटीन के अर्क overexpressing कोशिकाओं से अलगα, ε, α और ε या कुल प्रोटीन के अर्क के साथ तुलना में आसानी से एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया है, और किया जा सकता है। इस मामले में, electrophoretic विश्लेषण अकेले overexpressed जब, ε सबयूनिट सुविधाओं गरीब विलेयता (1 गलियों की तुलना और 2) α के सह-अभिव्यक्ति बहुत घुलनशील प्रोटीन के अर्क में ε की एकाग्रता को बढ़ाता है, जबकि (गलियों 3 और 4 की तुलना, इंगित करता है कि )।

सह अभिव्यक्ति भी अंतर-प्रजाति complementation परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तदनुसार, हम यह ग्राम + और ​​ग्राम के replicative मशीनरी से संबंधित सब यूनिटों के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए ब्याज की हो सकती है सोचा -। जीवाणु Deinococcus radiodurans एक बड़ी α सबयूनिट (1335 अमीनो एसिड, 150 केडीए) की विशेषता एक ग्राम + जीवाणु, और 197 अमीनो एसिड से युक्त एक ख्यात ε सबयूनिट। दिलचस्प है, डी radiodurans ε सबयूनिट अपने ई में सी टर्मिनल डोमेन वर्तमान से रहित है कोलाई ई के बीच फिर भी, पहचान और समरूपता कोलाई और डी radiodurans ε सब यूनिटों में क्रमश: 29% और 59% के बराबर हैं (क्षेत्र 1-178 पर, डी radiodurans निर्देशांक)। डी की क्षमता परख के लिए ई बंधन में radiodurans पोलीमर्स तृतीय α सबयूनिट (डॉ α) कोलाई ε सबयूनिट, हम pBAD वेक्टर में डॉ α के लिए कोडिंग एक कृत्रिम जीन क्लोन है और हम ई सह-बदल दिया है pBAD-α डॉ और pGOOD-ε साथ कोलाई। संस्कृति के माध्यम से एक साथ IPTG के अलावा और arabinose डॉ और ε (चित्रा 3A) α के सह-अभिव्यक्ति हो सके। इन दो प्रोटीनों की एसोसिएशन जेल निस्पंदन द्वारा परीक्षण किया गया था। प्रकोष्ठों sonication द्वारा बाधित lysis बफर में निलंबित कर दिया तृतीय α डॉ और ε सब यूनिटों centrifugation (5000 XG, 20 मिनट) द्वारा एकत्र किए गए डीएनए पोलीमरेज़, सह व्यक्त, और घुलनशील प्रोटीन तत्काल थेly के एक Superdex 200 स्तंभ (3B चित्रा) पर लादा। चित्रा -3 सी से पता चलता है के रूप में एकत्र अंशों 3'-5 'exonuclease करने और डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि assays के अधीन थे, जब गतिविधि चोटियों काफी कम पाया गया डॉ α ई बंधन में सक्षम नहीं है, सुझाव है कि पदों के लिए स्थानांतरित कर दिया कोलाई ε सबयूनिट। अंशों 32, 36, और 52 की aliquots एसडीएस पृष्ठ से ध्यान केंद्रित किया है और विश्लेषण किया गया है जब इस बात की पुष्टि की गई थी। अंश 36 α डॉ शामिल करने के लिए और ई से रहित होना पाया गया कोलाई ε सबयूनिट अंश 52 ई निहित है, जबकि कोलाई ε लेकिन डॉ चित्रा (3 डी) α से रहित था।

प्रतिकृति निष्ठा मुख्य रूप से डीएनए विस्तार के दौरान गलत आधार pairings के खिलाफ भेदभाव को डीएनए पीसीआर की क्षमता पर निर्भर करता है। फिर भी, बेमेल deoxynucleotides 10 -4 आवृत्ति 20 में शामिल किया है, और कार्रवाई की जा सकती है3'-5 'exonucleases के नव संश्लेषित डीएनए किनारा ठीक करना जरूरी है। इसके अलावा, यह इस डीएनए संपादन कार्रवाई परिमाण 20 के तीन आदेशों द्वारा प्रतिकृति निष्ठा बढ़ जाती है कि अनुमान लगाया गया था। तदनुसार, mutator उपभेदों सशर्त ई के एक mutagenic संस्करण व्यक्त करके, जैसे, डीएनए प्रूफरीडिंग आई द्वारा निर्माण किया जा सकता कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय ε सबयूनिट। इस α लेकिन इसकी प्रूफरीडिंग गतिविधि से रहित, बाध्यकारी और उचित अभिव्यक्ति सिस्टम द्वारा उत्परिवर्तजन ε के उत्पादन को नियंत्रित करने में ε सक्षम का एक संस्करण का निर्माण कर प्राप्त किया जा सकता है। इस रणनीति का प्रयोग, यह दिखाया गया है कि ई ε 11,21 के mutagenic वेरिएंट उत्प्रेरण शर्तों के तहत कोलाई उत्परिवर्तन आवृत्ति बढ़ जाती है। हालांकि, उत्परिवर्तन आवृत्ति का कोई ठीक ट्यूनिंग इस माध्यम से पूरा किया गया था। प्रोटीन सह अभिव्यक्ति mutator उपभेदों का एक बेहतर नियंत्रण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, हम ई-तब्दील सह साथ कोलाईpBAD-ε और pGOOD1-εD12A, जंगली प्रकार और क्रमशः arabinose और IPTG, साथ ε की mutagenic D12A संस्करण की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए। जंगली प्रकार के ई में - (BGL) एक प्ररूपी परीक्षण के रूप में, हम गुप्त है जो β-glucosidase गतिविधि की उपस्थिति निर्धारित कोलाई 22,23। कार्बन स्रोतों (BGL +) के रूप में β-glucosides उपयोग करने में सक्षम सहज म्यूटेंट समृद्ध या क्रमश: 23 तरल या ठोस मीडिया में 24 का उपयोग कर अलग किया जा सकता है। कोशिकाओं D12A mutagenic संस्करण व्यक्त करने के लिए प्रेरित कर रहे थे, β-glucosidase गतिविधि सीए में अधिग्रहण कर लिया था 20 पीढ़ियों (चित्रा -4 ए)। यह एक ऐसी प्रवृत्ति ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण pGOOD1 पर लगाए गए क्योंकि सबसे अधिक संभावना गैर प्रेरित कोशिकाओं (चित्रा -4 ए), में मनाया गया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए 11 बल्कि टपका हुआ है। फिर भी, जंगली प्रकार ε सबयूनिट प्रेरित किया गया था, जब अकेले या D12A संस्करण के साथ संयोजन के रूप में, β-glucosidaseगतिविधि ई द्वारा अधिग्रहीत किया गया मध्यम स्तर (चित्रा -4 ए) में कोलाई। BGL + म्यूटेंट के β-glucosidase गतिविधि के बीच 3 और 40 माइक्रोन / मिनट 23 लेकर सूचना मिली थी। स्तर ई में यहां निर्धारित εD12A की अभिव्यक्ति के अधीन कोलाई आबादी बहुत कम है, लेकिन यह हम ठोस मीडिया पर BGL + म्यूटेंट को अलग करने का प्रयास नहीं किया है कि विचार किया जाना चाहिए।

चित्र 1
चित्रा 1. ई के सह अभिव्यक्ति कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय उत्प्रेरक कोर। (ए) ई से निकाले कुल प्रोटीन की एसडीएस पृष्ठ कोलाई top10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 arabinose ही की उपस्थिति में, inducers के अभाव में बड़ा हो, मध्यम arabinose और IPTG (गलियों में क्रमश: 1-4), दोनों के साथ पूरक IPTG की ही है, या में। (बीजेल-छानने का काम करने के लिए ई से निकाले घुलनशील प्रोटीन subjecting द्वारा पृथक भागों का) Absorbance (खाली हलकों) और exonuclease गतिविधि (भरा हलकों) कोलाई top10 ε, α overexpressing, और ई के θ सब यूनिटों कोलाई डीएनए पोल-तृतीय। (क्रमशः गलियों 1-5,) अंशों 6, 12, 23, 31 (सी) एसडीएस पृष्ठ, और 41 जिसका exonuclease गतिविधि और electrophoretic अंश 23 का एक केंद्रित विभाज्य, (डी) एसडीएस पृष्ठ पैनल बी में सूचना दी पैटर्न क्रमशः पैनलों बी और सी में रिपोर्ट कर रहे हैं। । जैव प्रौद्योगिकी पत्र, 33, Conte एट अल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित: "pGOODs: Escherichia कोलाई में प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति के लिए नए प्लास्मिड"।, 1815-1821 (2011) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
ई चित्रा 2. प्रोटियोलिसिस कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय ε सबयूनिट ई। से निकाले प्रोटीन के पश्चिमी सोख्ता से पता चला मोनोमेरिक (ए) गिरावट कोलाई top10 पूर्ण लंबाई या ε का छोटा रूपों overexpressing; तीर 25 और 19 केडीए पूर्व दाग आणविक मार्कर की स्थिति का संकेत। । Biochimica एट Biophysica एक्टा प्रोटीन और प्रोटिओमिक्स, 1794, Bressanin एट अल से एल्सेविअर से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित: "प्रूफरीडिंग सबयूनिट के प्रोटियोलिसिस Escherichia कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय उत्प्रेरक कोर के विधानसभा नियंत्रित करता है", 1606-1615 (2009)। (बी) ई की α और ε सब यूनिटों के सह अभिव्यक्ति कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय उत्प्रेरक कोर। कुल के एसडीएस पृष्ठ (1 गलियों और 3) और घुलनशील (गलियों 2 और 4) प्रोटीन अतिरिक्तε सबयूनिट overexpressing कोशिकाओं से अलग सीटीएस (1 गलियों और 2), या α और ε सब यूनिटों (गलियों 3 और 4)।

चित्र तीन
डीएनए पोलीमरेज़ क्रमशः Deinococcus radiodurans और Escherichia कोलाई से तृतीय α और ε सब यूनिटों की चित्रा 3. सह अभिव्यक्ति। (लेन 1) प्रेरित किया, या α डॉ overexpress करने के लिए प्रेरित किया, ε, या डॉ और ε (गलियों में क्रमश: 2-4), α नहीं कोशिकाओं से अलग कुल प्रोटीन के अर्क के (ए) एसडीएस पृष्ठ। (बी) chromatogram (खाली हलकों, बाईं अक्ष) और भिन्न के प्रोटीन एकाग्रता (भरा हलकों, सही अक्ष) ई से निकाले घुलनशील प्रोटीन के साथ भरी हुई (Superdex 200) एक जेल निस्पंदन स्तंभ फार्म eluted कोलाई α डॉ एक overexpressingएन डी ε सब यूनिटों। (सी) प्रूफरीडिंग (खाली हलकों, बाईं अक्ष) और डीएनए पोलीमरेज़ (भरा हलकों, सही अक्ष) पैनल बी अंशों 32, 36, और 52 के केंद्रित aliquots की (डी) एसडीएस पृष्ठ की रिपोर्ट में अंशों की गतिविधियों। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
ई चित्रा 4. उत्परिवर्तन आवृत्ति कोलाई कोशिकाओं अधीन या सह-अभिव्यक्ति के लिए नहीं जंगली प्रकार और डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय ε सबयूनिट की mutagenic संस्करण D12A की। नई प्लाज्मिड pFINE के नक्शे को भी दिखाया गया है। ई (ए) β-glucosidase गतिविधि कोलाई top10 (कोई इंडस्ट्रीज़) प्रेरित या जंगली प्रकार ε सबयूनिट की overexpression (के अधीन नहींआरा), mutagenic संस्करण D12A (IPTG), या दोनों जंगली प्रकार और D12A ε सब यूनिटों (आरा + IPTG)। β-glucosidase गतिविधि पीढ़ियों के एक समारोह के रूप में सूचना दी है। नई अभिव्यक्ति वेक्टर pFINE (बी) मानचित्र। इस प्लाज्मिड के कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) उन के बीच जीन की सतही चक्कर दे, संगत pBAD और pGOOD वैक्टर में मौजूद उन लोगों के लिए समान है।

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Discussion

प्रोटीन जिसका तृतीयक संरचना रचना 25 की सीमित संख्या के लिए आरक्षित नहीं है क्षेत्रों की विशेषता, आंतरिक रूप से अव्यवस्थित हो सकता है। ये अव्यवस्थित प्रोटीन एकत्रीकरण से 25 आम तौर पर ग्रस्त हैं, और उनके अलगाव और लक्षण एक मुश्किल काम प्रतिनिधित्व हो सकता है। ई की ε सबयूनिट कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ III के दो अलग डोमेन के अर्थात् 26,27, सुविधाएँ: मैं) एन आतंकवाद डोमेन, θ सबयूनिट बंधन में 3'-5 'exonuclease गतिविधि असर, और सक्षम; द्वितीय) सी-आतंकवाद डोमेन, α (पोलीमरेज़) सबयूनिट के लिए बाध्य करने के लिए जिम्मेदार है। Ε के सी-आतंकवाद डोमेन अपनी एकत्रीकरण को बढ़ावा देने, इस प्रोटीन को गरीब विलेयता प्रदान करने के लिए जाना जाता है। यह वास्तव में ε-186, सी-आतंकवाद डोमेन से रहित प्रोटीन का एक छोटा रूप है, घुलनशील है, और उच्च पैदावार 17 से शुद्ध किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया। हालांकि, मात्रात्मक अध्ययन किया जा α साथ ε की बातचीत की है जब(जैसे, αε परिसर का कश्मीर डी निर्धारित करने के लिए), पूर्ण लंबाई ε की शुद्धि के लिए एक मुश्किल जैव रासायनिक कार्य, जिसका अर्थ है की आवश्यकता है। इस फ्रेम में, प्रोटीन सह अभिव्यक्ति α को ε के बंधन के गुणात्मक अनुमानों प्रदान करता है। हम αεθ परिसर के उच्च पैदावार ε सबयूनिट के गरीब विलेयता दरकिनार, सह अभिव्यक्ति (चित्रा 1) द्वारा vivo में प्राप्त किया जा सकता है कि पता चला है। उल्लेखनीय है, overexpressed αεθ परिसर का शुद्धिकरण 28,29 सूचना दी गई है। सह अभिव्यक्ति की रणनीति भी बातचीत भागीदारों में से एक में साइट विशेष म्यूटेशन की प्रविष्टि जटिल गठन को बाधित किया जाए या नहीं परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तदनुसार, प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का गुणात्मक परीक्षण करने के लिए एक सुविधाजनक और तेजी से उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। यह भी हमारे सह अभिव्यक्ति प्रणाली 2 अलग inducers, यानी, arabinose और IPTG पर निर्भर करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल वृद्धि मध्यम से (चित्रा 1 ए) के एक inducer को छोड़ते हुए, एक प्रोटीन जटिल के गठन का परीक्षण इसलिए, जब उचित नियंत्रण आसानी से किया जा सकता है।

हम α के सह-अभिव्यक्ति और ई की ε सब यूनिटों के लिए यहाँ एक अनुकूलित प्रक्रिया प्रस्तुत कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय। इस प्रोटोकॉल तैयार किया है और परीक्षण किया गया था, तो निम्न मापदंडों सह अभिव्यक्ति प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण के रूप में पहचान की गई: प्रेरण किया जाता है, जिस पर मैं) तापमान; द्वितीय) प्रेरण का समय लंबाई; inducer (एस) के तृतीय) एकाग्रता। विशेष रूप से, हम स्वतंत्र रूप से प्रेरण समय के 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरित कोशिकाओं से जटिल 11 αεθ घुलनशील प्राप्त करने में असमर्थ थे। इसलिए हम प्रेरण कदम के लिए अलग तापमान परीक्षण करने के लिए, और समय के एक समारोह के रूप में प्रोटीन की overexpression जाँच करने के लिए सलाह देते हैं। इसके अलावा, रचनाकार में सह अभिव्यक्ति की समानांतर मूल्यांकनerent ई लक्ष्य प्रोटीन के उदारवादी पैदावार सामना करना पड़ रहा है जब कोलाई उपभेदों मदद की जा सकती है।

हम यहां विभिन्न प्रजातियों में से प्रोटीन के बंधन का परीक्षण करने के लिए प्रदर्शन एक प्रतिनिधि प्रयोग को सूचित किया है, और हम उस प्रोटीन सह अभिव्यक्ति तेजी से एक संकर कार्यात्मक परिसर में दो heterologous प्रोटीन की एसोसिएशन का परीक्षण करने के लिए उपयोगी है पता चला है। जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी जटिल गठन (चित्रा 3) का मूल्यांकन करने के लिए यहां इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, बातचीत के भागीदारों में से एक के लिए एक उपयुक्त टैग की प्रविष्टि संबंध कब्जा तरीकों का उपयोग दे, इस मूल्यांकन की सुविधा सकता है। प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के साथ टैग के हस्तक्षेप से बचने के लिए बातचीत भागीदारों में से एक के लिए कोडिंग जीन pBAD में समानांतर में डाला जा सकता है / उसकी और pBAD क्रमश: एन और सी में एक hexahistidine आकृति प्रदान / Myc -His वैक्टर, लक्ष्य प्रोटीन की -terminus।

ई mutato कोलाईआर उपभेदों उनके जंगली प्रकार समकक्षों की तुलना में अधिक उत्परिवर्तन आवृत्तियों की सुविधा है। Mutator उपभेदों तेजी उपन्यास, वांछित, phenotypes की दिशा में एक लक्ष्य तनाव विकसित करने के लिए, उदाहरण के लिए जैव प्रौद्योगिकी, 30 में रुचि के हैं। हम यहाँ सह व्यक्त सबूत है कि जंगली प्रकार और ई की एक mutagenic ε सबयूनिट प्रदान की कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय, बैक्टीरियल मेजबान का उत्परिवर्तन आवृत्ति पर्याप्त सुविधा के साथ देखते जा सकता है। आगे इस तकनीक में सुधार करने के लिए, कसकर विनियमित अभिव्यक्ति वैक्टर ε सबयूनिट की जोरदार mutagenic D12A संस्करण की अभिव्यक्ति के रूप में संभव के रूप में ज्यादा दबाने के लिए आवश्यक हैं। विशेष रूप से, यह ई में उत्परिवर्तन आवृत्ति परीक्षण करने के लिए दिलचस्प होगा कोलाई यानी pBAD-εD12A और pGOOD1-ε, यहाँ प्रस्तुत करने के लिए कि विन्यास विकल्प के साथ बदल दिया। pBAD वैक्टर वास्तव में कसकर 12 विनियमित किया जाना जाता है, और इस सुविधा εD12A के बेसल एकाग्रता रखने में मदद कर सकता हैनिम्न स्तर पर।

प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के उदाहरण यहां बताया कि इस तकनीक के बहुमुखी प्रकृति गवाही। हालांकि, यह एक ई में संगत प्लास्मिड की बहुलता का उपयोग करते हुए कि नोट करना महत्वपूर्ण है कोलाई कोशिकाओं बहुत प्रोटीन सह अभिव्यक्ति द्वारा लिया जा सकता है जो चुनौतियों का विस्तार कर सकते हैं। हाल के वर्षों में तीव्र काम प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए प्रयोग की जाने वाली संगत plasmids के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार करने के लिए समर्पित किया गया था। विशेष रूप से, प्रतिकृति के ColE1, p15A, और pSC101 मूल असर संगत प्लास्मिड पर भरोसा एक त्रिगुट प्रणाली सह-व्यक्त या तो बैक्टीरियल और स्तनधारी प्रोटीन 31 करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हाल ही में, एक चतुर्धातुक सह अभिव्यक्ति प्रणाली की सूचना मिली थी। इस मामले में, 13 heterologous जीन ई में सह-व्यक्त किया गया कोलाई ColE1, p15A, CloDF13, और नकल के 32 में से RSF मूल युक्त, 4 संगत अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ सह-बदल दिया। यह सह अभिव्यक्ति प्रणाली सफलतापूर्वक में निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाई Pyrococcus furiosus 32 से कार्यात्मक सक्रिय घुलनशील हाइड्रोजन मैं कोलाई। हमारे बाइनरी सिस्टम में विस्तार करने के लिए, हम प्रतिकृति के pSC101 मूल, एक neomycin-प्रतिरोध कैसेट, और लाख नियामक तत्व (4B चित्रा) से युक्त, एक नई अभिव्यक्ति वेक्टर, pFINE का निर्माण किया। यह प्लाज्मिड इस प्रकार सह अभिव्यक्ति प्रणाली के तीन घटकों के बीच चक्कर जीन की सुविधा pBAD और pGOOD वैक्टर में एक ही polylinker उपस्थित होता है। PFINE एक कम प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड है, इसकी स्थिरता अमीर मध्यम में परीक्षण किया जब संतोषजनक हो पाया था। हम वर्तमान में हमारे त्रिगुट सह अभिव्यक्ति प्रणाली के और विस्तार में लगे हुए हैं। इस उद्देश्य के लिए, हम एक chloramphenicol प्रतिरोध कैसेट युक्त pBAD व्युत्पन्न का निर्माण किया है, और हम ColE1, p15A, और pSC101 के साथ संगत एक साथ प्रतिकृति की ColE1 मूल का आदान-प्रदान करने के रास्ते पर हैं। यह वास्तव में एक ई में कई plasmids के उपयोग कि हमारी राय है कोलाई कोशिकाओं प्रतिनिधिविभिन्न यूनिटों के एक भीड़ से बना प्रोटीन परिसरों की विवो में अभिव्यक्ति चुनौती देने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण resents।

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Acknowledgments

आंकड़े पुनर्मुद्रण स्प्रिंगर और एल्सेविअर द्वारा अनुमति बहुत स्वीकार किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
Chloroform Sigma-Aldrich 288306
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
INT Sigma-Aldrich I8377
IPTG Sigma-Aldrich I5502
KCl Sigma-Aldrich P9541
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670
NaCl Sigma-Aldrich 31434
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PNP-gluc Sigma-Aldrich N7006
pNP-TMP Sigma-Aldrich T0251
Tetracyclin Sigma-Aldrich 87128
Trizma base  Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Sigma-Aldrich 95039
Yeast extract Fluka 70161
Acrylamide solution 30% BioRad 161-0158 For gel electrophoresis
Ammonium persolphate BioRad 161-0700 For gel electrophoresis
Glycine BioRad 161-0718 For gel electrophoresis
SDS BioRad 161-0302 For gel electrophoresis
TEMED BioRad 161-0800 For gel electrophoresis
Tris BioRad 161-0719 For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm BioRad 1652089 For electroporation
Centrifuge 5415R Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation BioRad
Microplate Reader 550 Biorad
MiniProtean 3 cell BioRad
Power Supply BioRad
Sonicator 3000 Misonix

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 96, प्रोटीन सह अभिव्यक्ति संगत प्लास्मिड complementation परीक्षण डीएनए पोलीमरेज़ तृतीय mutator उपभेदों
प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के बहुमुखी लाभ में<em&gt; Escherichia कोलाई</em
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Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), e52431, doi:10.3791/52431 (2015).

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