Abstract
Identifiera reproduktionstoxicitet av de tusentals kemikalier som finns i vår miljö har varit en av de mest kittlande utmaningarna inom miljö och hälsa. Detta beror delvis på bristen på modellsystem som kan (1) exakt rekapitulera nycklar funktioner i reproduktiva processer och (2) gör det på ett medel- till hög genomströmning fashion, utan behov av ett stort antal ryggradsdjur.
Vi beskriver här en analys i nematoden C. elegans som gör snabb identifiering av nedärvda gifter genom att övervaka induktion av aneuploida embryon. Genom att använda sig av en GFP reporter linje, är fel i kromosomsegregation följd av könsceller störningar lätt visualiseras och kvantifieras genom automatiserad fluorescensmikroskopi. Således kan utföras screening av en viss uppsättning föreningar för sin giftighet i ett 96- till 384-brunnar format på några dagar. Sekundär analys av positiva hdess kan utföras för att fastställa om de kromosomavvikelser härstammar från meiotisk avbrott eller från tidiga embryonala kromosomsegregation fel. Sammantaget innebär denna analys en snabb första passage strategi för snabb bedömning av könsceller dysfunktion efter kemisk exponering.
Introduction
Det finns cirka 87.000 kemikalier registrerade för handel i USA, men bara ett fåtal av dessa har testats för potentiella hälsoeffekter en. Av dem som har testats, har endast en del bedömts för reproduktiva hälsoeffekter beror delvis på svårigheten att fastställa ändring av de tidiga reproduktiva händelser i däggdjur, särskilt under kvinnliga könsceller utveckling och differentiering. Faktum de första meiotiska evenemang äger rum under de tidiga stadierna av embryonal utveckling hos kvinnliga däggdjur och är därför svåra att komma åt och samla in siffror som är lämpliga för screening.
Den nedärvda ger den avgörande länken mellan generationerna, och dess lämplig funktion är beroende av den exakta utförandet av intrikata program för cell- och kromosomala division kallas meios. Dysreglering av meiotiska processen kan resultera i minskad fertilitet och produktionen avkönsceller och embryon med ett onormalt antal kromosomer, ett tillstånd som kallas aneuploidi. Kromosomsegregation fel i meios är mycket relevanta för människors hälsa. Kromosomavvikelser är vanliga, med en frekvens på 1 i 150 levande födda, trisomi 21, 18 och 13 samt X och Y-kromosom fel vara de vanligaste typerna 2,3. Dessutom medfödda missbildningar, inklusive de av kromosomala ursprung, är den ledande orsaken till spädbarnsdöd i USA 4 Tanken att miljöpåverkan kan påverka kromosomsegregation och beteende är inte ny 5, men är fortfarande dåligt kända. Det är därför mycket viktigt att undersöka vilka av de kemikalier som införts i vår miljö stör human fertilitet, tidig utveckling och övergripande reproduktiv hälsa.
Mot bakgrund av dessa begränsningar av däggdjursmodeller, har vi utvecklat en hög genomströmning skärm analys för att testa reproduktionstoxicitet i rundmasken <em> C. elegans. Vi har mobiliserat flera viktiga funktioner som erbjuds av denna vanligt förekommande genetiska modellsystem såsom dess ringa storlek, låg kostnad, kort reproduktionscykel, hög andel av könsceller och enkel manipulation 6. Maskar kan odlas i 96-brunnsplattor eller i höga volymer flytande kulturer och på grund av deras transparens kan direkt avbildas på plattor för detektering av fluorescerande reportrar. Den analys som beskrivs nedan utnyttjar dessa egenskaper och utnyttjar en mask stam innehållande den fluorescerande reporter Pxol-1 :: GFP att upptäcka nedärvda störningar och induktion av embryonala aneuploidi.
Användningen av denna reporter stam är baserad på allmänt sällsynta förekomsten av hanar i ett huvudsakligen hermafroditisk mask befolkningen. Dessa män (<0,2%) naturligt härrör från fel i segregeringen av X-kromosomen 7. Men som könsceller störningar ofta leder till fel i segregering av autosomeroch heterochromosomes, korrelerar det både med en förhöjd incidens av manlig fenotyp (X missegregation) samt embryonal dödlighet (Autosom missegregation). För att enkelt detektera induktion av hanar medan kringgår frågan om embryonal dödlighet, är en manlig specifik promotor (XOL-1) som används för att driva uttryck av GFP i tidiga embryon fortfarande finns inom masken livmoder. Som sådan är uppkomsten av GFP-uttryck embryon används som en proxy för förekomst av aneuploida embryon. Denna metod har tidigare använts för att identifiera gener som är inblandade i arvslinjeunderhåll och meios 8,9. Anpassad till kemisk screening, är denna stam användes i ett medium till hög kapacitet skärm. Viktigt stammen rapporterar troget aneugenicity av kemikalier och är därför relevant för däggdjurs reproduktiva endpoints 10. Den analys som beskrivs här kommer att vara särskilt användbart för toxikologer i läkemedels- och kemisk industri inställningar sökeratt snabbt bedöma hur giftiga kemikalier mot reproduktiva endpoints. Dessutom denna analys helt i linje med de statliga prioriteringar markerade i toxicitet i det 21: a århundradet rapport 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Feeding Bakterier
OBS: Det här avsnittet beskriver framställningen av utfodring bakterier (E. coli stam OP50).
- Isolera en enda koloni av E. coli stam OP50 från en lysogeni buljong (LB) agarplatta och aseptiskt ympa in 300 ml autoklaverat LB-buljong.
- Låt den inokulerade kulturen att växa över natten i en skakapparat vid 200 rpm och 37 ° C, till dess mättnad uppnås.
- Överför OP50 i 6 sterila, förvägt 50 ml koniska rör. Pelle bakterierna genom centrifugering under 5 min vid 6000 rpm (5000 x g).
- Kasta bort supernatanten och tvätta bakterierna med 50 ml steril M9. Upprepa två gånger.
- Efter den andra sköljn avlägsna återstående M9, säkerställer att ingen M9 är kvar i röret.
- Bestäm vikten av pelleten genom vägning röret innehållande bakteriepellet och subtrahera vikten av den 50 ml koniska rör.
- Suspendera pelleten in M9 vid en koncentration av 100 mg / ml.
- Förvara OP50 lösningen vid 4 ° C tills det används för snäckkulturen.
2. Beredning av Nematode odlingsmedium (NGM) Petri Plattor
OBS: Det här avsnittet beskriver framställningen av NGM Petri plattor, som är plattorna där C. elegans maskar rutinmässigt bibehålls i laboratoriet.
- Autoklavera NGM agarmedium.
- Använda sterila förfaranden, dosera 17 ml NGM agar lösningen i 6 cm petriskålar med en peristaltisk pump.
OBS: En konstant mängd agar i plattorna minskar behovet av att inrikta mikroskopet vid byte från en tallrik till en annan. - Låt plattorna vid rumstemperatur under 2-3 dagar före användning för att låta ägarn stelna och låta överskottet fukt avdunsta.
- Seed NGM plåtarna med en steril teknik. Applicera 1-2 droppar OP50 vätskekultur och sprids med hjälp av en glasstav. Se till att inteatt sprida bakterier gräsmattan hela vägen till kanterna på plattorna.
- Låt OP50 gräsmatta att växa under 1-2 dagar i rumstemperatur innan du använder plattorna att växa maskar.
3. Beredning av en synkron Worm Befolkning
OBS: Livscykeln för C. elegans består av fosterstadiet, fyra larvstadier (L1-L4) och vuxenlivet. Detta avsnitt beskriver framställning av en population av maskar ålders synkron. Alla material som kommer i kontakt med C.elegans efter blekmedel behandling måste vara sterila.
- Dag 1 - Beredning av Gravid Worm Befolkning
- Använd NGM plattor där majoriteten av masken befolkningen består av svalt L1 larver.
- Samla L1 larver med en steriliserad mask välja och överföra dem till färska 6 cm NGM plattor ympats med OP50. Inkubera i ca 65 timmar vid 20 ° C tills majoriteten av maskar är gravida vuxna. Tillundvika platt överbeläggning och låta maskarna att växa utan att tömma bakterierna, inte överföra mer än en eller två kluster av L1 larver till varje nytt NGM tallrik.
- Dag 4 - Upprättande av en synkroniserad L1 Larver Befolkning
- Samla gravida maskar från NGM plattor genom att tvätta dem med 1-2 ml M9 och överföra dem till ett koniskt 15 ml tub.
- Låt de gravida maskar sedimenterar till botten av 15 ml koniska rör för ca 5-10 min. Avlägsna supernatanten utan att störa masken pelleten.
- Överför masken pelleten till 2-4 mikrocentrifugrör och tillsätt 1 ml blekmedel / NaOH-lösning. Inkubera under 2-3 min vid rumstemperatur. Övervaka framskridandet av reaktionen i stereomikroskop för att bekräfta alla maskar är döda. Blek inte längre än 5 minuter när embryona kan dö.
- Samla maskar genom centrifugering under 1 min vid 3000 rpm (900 xg). Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml sterilt M9 tillneutralisera reaktionen.
- Tvätta maskarna två gånger genom centrifugering under 1 min vid 3000 rpm (900 xg).
- Avlägsna supernatanten och lägga M9 till upp till 100-200 pl.
- Med användning av en glas pasteurpipett lägga en droppe av masken / M9 blanda för att rensa NGM plattor och inkubera dem under minst 24 h vid 20 ° C för att tillåta embryona att kläckas.
OBS: Utan mat larverna tillväxt kommer att stoppas i L1 skede.
- Dag 5 - Inrättande av en synkroniserad L4 Befolkning
- Samla L1 larver från de tydliga NGM plattor genom tvättning av plattorna med 1-2 ml M9 och överföra dem till ett koniskt 15 ml-rör.
- Låt de döda vuxna maskar sedimentet till botten av den 15 ml koniskt rör för cirka 5 minuter.
- Samla supernatanten, där L1 maskar är, i ett nytt koniskt 15 ml-rör, och utfällning av maskar genom centrifugering under 2 min vid 2600 rpm (1000 x g).
- Avlägsna supernatanten leAving ca 500 | il.
- Bestäm koncentrationen av maskar i M9-lösning genom att räkna antalet av maskar i 10 | il droppar med hjälp av ett stereomikroskop. Räkna minst 5 droppar.
- Justera koncentrationen av maskarna till 20-25 maskar / il och tillsätt 50 pl av masken / M9 blandning till NGM plattor sådda med OP50.
- Inkubera i 65 timmar vid 15 ° C (för inkubation genom veckan slut) för att göra det möjligt för L1 Synchronized befolkningen att växa tills de når L4 scenen.
4. Exponering av Worms till kemikalier i 96-hålsplattor
OBS: Det här avsnittet beskriver användningen av Pxol1 :: gfp transkriptions reporter innehållande C. elegans stam till skärmen för induktion av aneuploidi.
- Samla L4 larver från de tydliga NGM plattor genom tvättning av plattorna med 1-2 ml M9 och överföra dem till ett koniskt 15 ml-rör.
- Låt L4 maskar sediment på botten av den15 ml koniska rör för cirka 5-10 min. Avlägsna supernatanten utan att störa masken pelleten.
- Lägg 3-5 ml M9 och bestämma koncentrationen av maskar i M9-lösning genom att räkna antalet av maskar i 10 | il droppar med hjälp av ett stereomikroskop. Räkna minst 5 droppar för varje prov.
- Resuspendera maskarna vid en koncentration av 1000 maskar / ml i M9.
- Späd OP50 bakterier från avsnitt 1 10-faldigt med M9. Se till resuspenderade bakterierna når rumstemperatur eftersom lägre temperatur påverkar mask utveckling.
- Med hjälp av en multikanalpipett, först lägga 100 pl av masken / M9 mix (från steg 4.4) och sedan lägga 400 ìl av de utspädda OP50 bakterier (från steg 4,5) till varje brunn i en 2 ml djupt rund botten 96-brunnar. I slutet, kommer varje brunn har 100 maskar i 500 l.
- Lägg 0.5 pl antingen testkemikalien eller lämplig kontroll till önskade brunnarna, för att uppnå en föreslagen slutlig concentration av 100 pM, en koncentration som vanligen används i kemiska skärmar i C. elegans 12. Exponera etanol eller DMSO kontroller med lösningsmedel vid en slutlig koncentration av 0,1%.
OBS: Vi rekommenderar användning av nokodazol (100 M) som positiv kontroll. - Förslut plattan med användning av adhesiv film. Var noga med att försegla plattan väl att förhindra korskontaminering mellan brunnar.
- Linda plattan med aluminiumfolie.
- Överför plattan till en shaker (170-180 rpm) i lämplig temperatur för lämplig tid (24 eller 65 timmar). Temperaturen i rummet påverkar tillväxten av maskar; hålla temperaturen runt 20 ° C.
5. Bild Förvärv av Gravida Worms i en 384-brunnar
OBS: Det här avsnittet beskriver användningen av en hög halt mikroskop för att bilden den exponerade Pxol1 :: GFP maskar, att visualisera uttryck av GFP i embryon inom livmodern av vuxna hermafroditer. Förvarje 384-brunnar som ska screenas, använd maskar från 4 x 96-hålsplattor.
- Efter kemisk exponering i shaker, låt 96-brunnar vila under 10-15 minuter för att tillåta de vuxna maskarna att sedimentera till botten av plattan.
- Med hjälp av en multikanalpipett, ta bort 350 pl av M9, är mycket noga med att inte störa maskarna i botten av plattan.
- Tvätta maskar med 1 ml M9 och upprepa steg 5.1.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, avlägsna en ml av M9, som är vey noga med att inte störa maskarna i botten av plattan.
- Med hjälp av en multikanalpipett, resuspendera maskar i de återstående M9 och samla 100 pl av masken / M9 mix från de 96 brunnar och ladda in den i brunnarna i en svart vägg / klar botten 384-brunnar. Upprepa processen med hjälp av maskar från 4 x 96-hålsplattor, tills alla brunnar i 384-brunnar har laddats.
OBS: Det är viktigt för alla brunnar för att ha samma volym för att ökaeffektivitet och hastighet autofokus under bildförvärvsprocessen. Varje brunn bör innehålla mellan 80 till 100 maskar. - Lägg ett pl av levamisol (100 | iM) till varje brunn och låt maskarna inkubera i ca 30 minuter.
OBS: levamisol fungerar som en acetylkolinreceptoragonist och immobilizes maskar. - Överför plattan till en widefield hög halt mikroskop kan ge automatiserad bildbehandling.
- För bild förvärv, använda en hög bildinnehållet och analys programvara, enligt tillverkarens anvisningar. Välj 4X målet att förvärva 1 bild per brunn.
- Innan du startar bild förvärvet, justera GFP imaging parametrar till 45 msek av exponering och bildupplösning till 2160 x 2160.
- Samla data som antalet GFP positiva maskar dividerat med det totala antalet maskar i brunnen, den senare åtgärden är relativt konsekvent mellan brunnar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exponering av Pxol-1 :: GFP reporter stam mot kemiska medel såsom mikrotubuli gift Nocodazole (Figur 1) leder till induktion av en hög andel GFP-uttryck embryon i livmodern av exponerade vuxna hermafroditer jämfört med DMSO-kontroll. De GFP-positiva embryon är betydligt ljusare än den svaga bakgrundsfluorescens observerats i andra embryon liksom auto-fluorescens observeras i tarmen hos djuren. Exponerade maskar direkt avbildas på 384-brunnsplattor och antalet maskar som innehåller åtminstone en GFP-positiva embryo räknas för varje brunn och normaliserad med det totala antalet maskar i den brunnen. En positiv träff från den kemiska skärmen innebär en förening inducerade en andel av GFP-positiva embryon i en mask population vid en frekvens 1,7x högre än DMSO 10. Efter tröskel optimering, det höga innehållet bildanalys (se Material fil) gör den automatiserade calclering av antalet positiva föremål (t.ex., embryon) dividerat med det totala antalet maskar i brunnen och är den metod som väljs för storskalig anpassning av analysen.
| Börja med svalt mask befolkningen att generera en gravid vuxna befolkningen |
| ↓ (Kultur 3 dagar) |
| Bleka gravid vuxna befolkningen |
| ↓ |
| Överför blekt maskar att rensa NGM plattor |
| ↓ (Kultur 1 dag) |
| Samla synkroniserade L1 befolkning och överföra till NGM plattor med OP50 |
| ↓ (Inkubera 65 timmar vid 15 ºC) |
| Samla synkroniserade L4 befolkningen |
| ↓ </ Td> |
| Fördela 100 L4 maskar till varje brunn av de 96 brunnar i 0,5 ml M9 / OP50 |
| ↓ |
| Lägg kemikalier (100 | iM) till varje brunn |
| ↓ (Inkubera 24 eller 65 timmar) |
| Överför 100 | il av den synkroniserade gravid vuxna befolkningen (80 maskar) från de 96-brunnsplattor till en 384-brunnars platta. |
| ↓ |
| Tillsätt 1 pl levamisol till varje brunn (1 ^ M slutlig koncentration) |
| ↓ (Inkubera 30-45 min) |
| Fånga och analysera bilder av varje brunn med hög halt mikroskop |
Tabell 1. Försöks arbetsflöde. Dag 1, användning svalt mask befolkningen att generera en gravid vuxna befolkningen. Dag 4, bleach dräktig vuxna befolkningen att generera en synkroniserad L1 befolkning. Dag 5, överföra L1 befolkningen från tydliga NGM plattor till OP50 seedade NGM plattor för att skapa en synkroniserad L4 befolkning. Dag 8, överföra synkroniserade L4 befolkningen till 96-brunnar och utsätta dem för olika kemikalier. Dag 9 och Dag 11, överför de exponerade gravida vuxna att en 384-brunnar som ska avbildas med en hög halt mikroskop.
| M9 Buffer - 1 L | |
| 1. Kombinera följande ingredienser i stor bägare eller graderad cylinder med användning av magnetisk omrörarstav | |
| 3 g KH 2 PO 4 | |
| 6 g Na 2 HPO 4 | |
| 5 g NaCl | |
| 1 ml 1 M MgSO 4 | |
| H2O till 1 L. | |
| 2. Fördela i lämpliga stora flaskor (300 ml i 500 ml stora flaskor) | |
| 3. Sterilisera genom autoklavering under 30-60 min | |
| NGM media för tallrikar - 4 L | |
| 1. Lägg till följande i en Erlenmeyerkolv, fyll sedan till 4 L: | |
| 12 g NaCl | |
| 10 g baktopepton | |
| 80 g agar | |
| 2. Lägg till och blanda väl: | |
| 4 ml av kolesterol (5 mg / ml) | |
| 4 ml CaCl2 (1 M förrådslösning) | |
| 4 ml MgSO 4 (1 M förrådslösning) | |
| 3. Autoklav under 30-60 min | |
| 4. Låt svalna något och tillsätt 100 ml KH 2 PO | |
| LB-medium - ett L | |
| 1. Lägg till följande i 800 ml H2O | |
| 10 g baktotrypton. | |
| 5 g jästextrakt. | |
| 10 g NaCl. | |
| 2. Justera pH till 7,5 med NaOH. | |
| 3. Justera volymen till 1 L med dH 2 O | |
| 4. Sterilisera i autoklav för 30 - 60 minuter | |
| Bleach lösning för att synkronisera populationer - 50 ml | |
| 7,5 ml 10 N NaOH | |
| 6 ml blekmedel (vanlig) | |
| 36,5 ml dH 2 O |
Tabell 2. Lösningar.
Figur 1:. Exempel på bilder som kommer från exponering av Pxol-1 :: GFP reporter stam att styra DMSO och positiv kontroll nokodazol I detta exempel maskar exponerades under 24 timmar för att nokodazol eller DMSO Pxol-1 :: GFP maskar var. exponeras för (A) 0,1% DMSO (negativ kontroll) eller (B) 100 | iM nokodazol (positiv kontroll) och avbildas i 384-brunnsplattor. Röd pil: GFP positiva embryon klart synliga inom en nokodazol behandlad mask livmoder. Skalstreck = 1 mm. (C) och (D) är förstorade partier av (A) och (B) respektive. Skalstreck = 0,33 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här utgör den första storskaliga strategi för identifiering av nedärvda gifter. Det kräver användning av en GFP transgen Pxol-1 :: GFP innehåller stam som troget rapporterar induktion av aneuploidi i tidiga embryon som används som en proxy för könsceller dysfunktion. Metoden involverar noggrann synkronisering av ett C. elegans mask befolkning och maskar "exponering för kemikalier i 96-brunnsformat följt av avbildning av GFP positiva maskar genom automatiserad hög halt mikroskopi.
Flera steg i detta protokoll är avgörande för konsistensen av resultaten. Först bör snäckpopulationer vara mycket synkron till såsom maximera antalet iscensatt ordentligt L4 som kommer att användas för exponeringen. Av denna anledning, den metod som beskrivs här innehåller två synkroniseringssteg, först genom blekning av masken befolkningen och sedan av L1 svält. Den andra viktiga parameter av denna metod är längden på exponeringen. Maskarna rutinmässigt utsätts för antingen 24 timmar eller 65 timmar. Som meios är en kontinuerlig process i C. elegans, dessa två exponeringsfönster tillåter fångst av antingen förändrade sena meiotiska händelser (24 tim) eller både tidiga och sena meiotiska händelser (65 tim). Det är viktigt att notera dock att ju längre exponering verkar bättre förutse däggdjur reproduktionstoxicitet 10.
En särskilt attraktiv aspekt av förfarandet är dess flexibilitet. Medan protokollet är utformat för high throughput screening, kan utföras en nedskalad version av analysen för screening av ett mindre antal prover med användning av 24-brunnsplattor eller 1,5 ml rör. Sänkning omfattningen av skärmen gör testet av ett högre antal maskar per prov som kan öka känsligheten för analysen. I nuvarande form, är screening föreningar i kvadruplikat rekommenderas att ge högre statistisk förtroende för aneuploidy hastigheter mättes. En potentiell hinder i detta storskalig metod kommer från behovet av automatiserad detektion av GFP-positiva embryon. Även om denna uppgift enkelt kan utföras med ögat, den noggranna upprättandet av lämpliga parametrar på bildanalysmjukvara, helst med en avbildningsspecialist, är avgörande för automatisering av förfarandet. Vidare, utöver detekteringen av GFP-positiva embryon, bör utföras sekundär validering av de träffar för att bestämma om kromosomala fel är av meiotisk eller embryonalt ursprung. Vi har tidigare visat att sådana sekundära analyser utförs enkelt i C. elegans och inkluderar DAPI-färgning av nedärvda kärnor samt akridinorange färgning av maskar för mätning av apoptos 10. Från dessa två enkla analyser, kan onormal progression genom meios, onormal kärnmorfologi och fragmentering samt könscellsförlust allt bedömas.
Taget tillsammans, har vi described här de steg som krävs för snabb bedömning av könsceller toxicitet med hjälp av modellsystemet C. elegans. Viktigt är användningen av aneuploidi i masken som en markör för könsceller toxicitet en relevant analys eftersom det är prediktiva för däggdjur reproduktionstoxicitets endpoints inklusive minskad kullstorlek och äggstocks defekter 10. Detta är av särskild betydelse som toxiska effekter på kvinnliga könsceller är särskilt svåra att utreda. Således ger denna snabba analys ett alternativ till stora djurförsök som ett första toxicitet skärm pass och belyser effekten av miljö kemisk exponering på olika aspekter av den komplexa meiotiska programmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D.
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S.
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , The National Academies Press. (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
