Ein Protokoll zur kovalenten Kopplung einer Vielzahl von Einzelmolekülen an eine AFM-Spitze wird vorgestellt. Es werden Verfahren und Beispiele zur Bestimmung der Adhäsionskraft und freien Energie dieser Moleküle auf festen Trägern und Bio-Grenzflächen vorgestellt.
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Methodenartikel
Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Rasterkraftspektroskopie ist ein ideales Werkzeug, um Moleküle an Oberflächen und Grenzflächen zu untersuchen. Eine experimentelle Protokoll zum Koppeln eine Vielzahl von Einzelmoleküle kovalent an einer AFM-Spitze dargestellt. Gleichzeitig die AFM-Spitze passiviert, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und dem Substrat, die eine Voraussetzung für die einzelnen Moleküle an die AFM-Spitze angebracht studieren verhindern. Analysen, um die Haftkraft, die Haftung der Länge, und die freie Energie dieser Moleküle auf festen Oberflächen und Bio-Schnittstellen werden in Kürze vorgestellt und externe Verweise auf weiterführende Literatur werden zur Verfügung gestellt zu bestimmen. Beispiel Moleküle sind die Poly (aminosäure) Polytyrosin das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamin). Diese Moleküle werden von verschiedenen Oberflächen wie CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert Diamant desorbiert und unterstützten Lipiddoppelschichten unter verschiedenen Lösungsbedingungen. Schließlich wird dasVorteile der Kraft-spektroskopische Einzelmolekülexperimenten diskutiert Mittel zu entscheiden, ob wirklich ein einzelnes Molekül hat im Experiment untersucht.
Einleitung
In den letzten 30 Jahren ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) sich als ein wertvolles Abbildungstechnik zur biologischen 1,2 und synthetische 3 Materialien und Oberflächen zu untersuchen, da sie Informationen über die Molekular räumliche Auflösung in allen drei Dimensionen und in verschiedenen Lösungsmittel betrieben werden kann Umgebungen. Außerdem AFM-Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS) ermöglicht, Kräfte, die von der pN-Regime uN messen und hat beispiellose Einblicke beispielsweise in der Proteinfaltung 4,5, Polymerphysik 6 angegeben - 8 und Einzelmolekül-Oberflächen-Wechselwirkung 9 - 12 .Die Gr....
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Protokoll
HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für einen Überblick über den Prozessablauf, das die Herstellung, die Datenerfassung und Datenanalyseschritte.
1. Setup-Reagenz
HINWEIS: Alle Chemikalien müssen mit Vorsicht behandelt werden, und damit eine Laborkittel, Schutzhandschuhe und Augenschutz zu verwenden. Alle Arbeiten müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden. Insbesondere sollten spezielle Handschuhe bei Chloroform Gebrauch abgenutzt werden.
- Verwenden Sie Chemikalien mit geringem Wassergehalt, wie trockenem Chloroform schnell und trocken lagern, aber nicht länger als eine Woche. Speichern ....
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Ergebnisse
Im Folgenden wird beschrieben, die Ergebnisse für das obige Beispiel Moleküle, nämlich die Polymere Poly (Aminosäure), Polytyrosin, das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE, werden vorgestellt. Zunächst für jedes Beispiel, experimentieren spezifischen Details für die Datenerfassung und Datenaufbereitung zur Verfügung. Dann werden die Ausführungsergebnisse für Versuche, bei denen diese Moleküle wurden aus verschiedenen Oberflächen desorbiert (CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert Diamant und.......
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Diskussion
In den letzten Jahrzehnten haben die Einzelmolekül-Experimente beispiellose Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zur Verfügung gestellt und erwies sich als ein wertvolles Vorgehen im Bereich Life Science und darüber hinaus. Um eine gute und sinn Statistiken EMKS Experimenten idealer ein und dasselbe Molekül wird über den gesamten Verlauf des Experiments verwendet erzielen. Im Gegensatz zu den Experimenten mit Ensembles von Molekülen sind SMFS Experimente in der Lage, seltene Ereignisse und versteckt Molekülzust.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren danken der DFG (Hu 997/2-2) für die finanzielle Unterstützung. Die FS bekennt sich zur Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr wurde gefördert durch das Elitenetzwerk Bayern im Rahmen des Promotionsprogramms Material Science of Complex Interfaces. Das SKi bedankt sich beim SFB 863 für die finanzielle Unterstützung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Hellmanex III alkalisches Flüssigkonzentrat (Waschmittellösung) | Hellma | ||
| RCA (Reinstwasser, Wasserstoffperoxid (35%), Ammoniak (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond Reagenz / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilan | Vectorlabs | ||
| Trockenaceton (< 50 ppm H< sub>2O) | Sigma | ||
| Trockenchloroform (> 99,9%) | Sigma | ||
| Triethylamin | Sigma | ||
| Reinstwasser | Biochrom, Deutschland | ||
| Dinatriumtetraborat (> 99,5%) | Biochrom, Deutschland | ||
| Borsäure | Biochrom, Deutschland | ||
| Monofunktionelle α-Methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, " methyl-PEG-NHS" | Rapp, Deutschland | ||
| Heterobifunktional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, " NHS-PEG-NHS" | Rapp, Deutschland | ||
| Heterobifunktionell α-maleimidohexanosäure- ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS" | Rapp, Deutschland | ||
| Sondenmolekül (Polymer, Lipid, etc.) | |||
| Ausrüstung | |||
| Ausreichende Menge an Glaskristallisationsschalen mit Ausguss (10 ml), Petrischalen aus Glas (500 & Mikro; l) und Glasdeckel | VWR International GmbH, Deutschland | ||
| [header] | |||
| Laborofen Modell UF30 | Memmert, Deutschland | ||
| Temperiertes Ultraschallgerät | VWR International GmbH, Deutschland | ||
| Plasmaanlage "Femto", 100 W | Diener, Deutschland | ||
| Eine separate Glasspritze für jedes organische Lösungsmittel | VWR International GmbH, Deutschland | ||
| Vortex Mischer | VWR International GmbH, Deutschland | ||
| Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 ml oder 1,5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipetten: 10-100 &Mikro; L, 50-200 &Mikro; l und 100-1.000 &Mikro; l | Eppendorf | ||
| AFM mit temperaturgesteuerter Fluidzelle (z.B. MFP-3D mit BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN Canragever Cantilever, typischerweise hergestellt aus Siliziumnitrid (SiN) (Federkonstante kleiner 100 pN/nm, z.B. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara | ||
Referenzen
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
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Nachdrucke und Genehmigungen
