Protocol
नोट: zebrafish का उपयोग प्रक्रियाओं UCSF के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
उपकरण के 1. तैयारी
- एक पिन धारक में minutia पिन डालें और पिन दबाना।
- ठीक टिप संदंश का प्रयोग, ध्यान से एक मामूली हुक बनाने के लिए पिन की नोक मोड़।
- हेरफेर और चोट के दौरान भ्रूण के स्थिरीकरण के लिए, सुई नाक सरौता का उपयोग कर एक इंसुलिन सिरिंज पर मुहिम शुरू की एक 28 गेज आधा इंच सुई के अंत मोड़।
चोट के लिए zebrafish भ्रूण की 2. तैयारी
- Zebrafish प्रजनन जोड़े की स्थापना की और पहले से 22 के रूप में दिखाया अंडा पानी (60ug / एमएल मछलीघर लवण) में अंडे इकट्ठा।
- भ्रूण लगभग melanization को रोकने के लिए 8 घण्टे बाद निषेचन (HPF) कर रहे हैं जब अंडा पानी के लिए 0.003% एन Phenylthiourea (पी टी यू) जोड़ें।
- ठीक टिप संदंश का उपयोग करने से पहले प्रयोग करने के लिए dechorionate दो दिन बाद निषेचन (DPF) भ्रूण।
- 0.02% बफर 3-aminobenzoic एसिड (Tricaine) से पहले जोड़तोड़ करने के लिए लगभग 10 मिनट के साथ भ्रूण anesthetize।
3. यांत्रिक पोत भ्रूण की चोट
- एक हस्तांतरण pipet का उपयोग एक विदारक stereomicroscope पर एक अवसाद स्लाइड करने से anesthetized भ्रूण स्थानांतरण।
- प्रमुख हाथ से भ्रूण हेरफेर करने के लिए सिरिंज सुई से कम फ्लैट पक्ष का प्रयोग, दूर सुई से सामना करना पड़ रहा उदर की सतह के साथ अपने पक्ष पर भ्रूण की स्थिति।
- टिप के साथ minutia पिन मूत्रजननांगी खोलने के लिए मछली पीछे के उदर की सतह के खिलाफ सीधे इशारा स्थिति। एक मामूली कोण पर minutia पिन स्थित करें ऐसे घुमावदार टिप दुम नस (चित्रा 1 <में सीधे periderm के माध्यम से बेध करने में सक्षम है कि/ Strong>)।
- भ्रूण में हेरफेर करने के लिए सिरिंज सुई का प्रयोग, थोड़ा नस में पिन हुक करने के लिए पिन में भ्रूण दोहन से minutia पिन के साथ दुम नस घुसाना।
- सिरिंज सुई का प्रयोग, पोत में एक छोटे से आंसू बनाने के लिए दूर minutia पिन से भ्रूण खींच।
ध्यान दें: एक सफल चोट नस से तत्काल खून बह रहा में परिणाम होगा।
Hemostasis 4. विश्लेषण
- जाहिरा तौर पर इस प्रक्रिया के लिए रक्त कोशिकाओं परिसंचारी साथ ही भ्रूण चुनें।
- के रूप में जल्द ही minutia पिन पोत से निकाला जाता है के रूप में टाइमर शुरू करने के लिए तैयार करते हैं।
- के रूप में जल्द ही खून की कमी घाव से देखे जा सकते हैं के रूप में टाइमर शुरू करो। घाव से खून की कमी रहता है, जब टाइमर बंद और समय रक्त स्राव के रूप में कुल समय रिकॉर्ड। जमावट हिचकते हैं, तो अब नहीं दिख परिसंचारी रक्त कोशिकाओं जब वहाँ के लिए समय रिकॉर्ड।
घाव भरने के 5. विश्लेषण
- स्थानांतरण पीओएसमाइक्रोस्कोपी के लिए गिलास नीचे इमेजिंग व्यंजन पर टी चोट जानवरों।
- अंडे पानी के बहुमत निकालें।
- डिग्री सेल्सियस के बीच 42 और 45 के लिए गर्म और 0.02% tricaine के साथ पूरक agarose अंडे पानी में भंग 0.3-1.2% कम पिघलने में भ्रूण को कवर।
- संदंश का उपयोग कर अपने पक्ष पर स्थिति भ्रूण।
- Agarose ठंडा करने के बाद, अंडे पानी में 0.02% tricaine के साथ पकवान भरें।
- Brightfield, epifluorescence, या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवियों मोल।
- संदंश का उपयोग agarose से भ्रूण निकालें और अंडे पानी के लिए वापस हस्तांतरण।
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Representative Results
मैकेनिकल पोत चोट भ्रूण (- सी 2A चित्रा) DPF दो पर प्रदर्शन किया गया था। एक तेजी से और विश्वसनीय जमावट जवाब में चोट परिणाम (चित्रा 2 डी) खून बह रहा है की समाप्ति के समय से मापा जाता है। जमावट जवाब में मतभेद से मापा जा सकता है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए, थक्कारोधी Hirudin (के लिए तुरंत पहले (5-10 nl पानी में भंग Hirudin μl प्रति एक इकाई के) घायल हो गए करने के लिए कुवियर की वाहिनी में इंजेक्शन द्वारा भ्रूण को दिलाई कुवियर की वाहिनी में इंजेक्शन के प्रदर्शन, पिछले जौव अनुच्छेद 23) 24 देखें। चोट करने के लिए पूर्व में हुई Hirudin के प्रशासन में काफी वाहन नियंत्रण (चित्रा 2 डी) बनाम टाइम्स खून बह रहा है वृद्धि हुई है।
(: EGFP kdrl) और लाल रक्त कोशिका (gata1a: पोत नुकसान और जमावट के साक्ष्य एन्दोथेलिअल के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग कर तुरंत बाद चोट देखा जा सकता है dsred 25,26 मार्करों। छवियाँ क्रमिक रूप से epifluorescence का उपयोग करते हुए एक 12 घंटा अवधि के लिए हर 5 मिनट हासिल किया गया। प्रतिनिधि अभी भी छवियों घाव की मरम्मत (चित्रा 3) के विभिन्न चरणों के दौरान दिखाए जाते हैं। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन का उपयोग करना, यह घाव की मरम्मत के विशिष्ट मापदंडों को मापने के लिए संभव है। घाव की मरम्मत प्रयोगों भर में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पैटर्न का पालन किया है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए, रक्त का प्रवाह पुनर्स्थापना के लिए समय मछली के चार समूहों में मापा गया था। पोत चोट घायल पोत के माध्यम से रक्त के प्रवाह के reestablishment को 253 ± 16 मिनट की एक विश्वसनीय टकसाली प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप (एन = प्रयोग प्रति 4-5 मछली, औसत ± SEM) के।
चित्रा 1: 2 DPF भ्रूण के चित्र perf के लिए minutia पिन की नियुक्ति दिखा दुम नस (सीवी) के यांत्रिक चोट orming। संवहनी डिब्बे ग्रे में छायांकित किया जाता है।
चित्रा 2: रक्त स्राव टाइम्स नेत्रहीन यांत्रिक चोट के बाद मापा जा सकता पोस्टरों भ्रूण DPF दो पर zebrafish पोत चोट के वास्तविक समय वीडियो से।। छवियाँ चोट (ए) के समय में दिखाए जाते हैं, घाव (बी) से सक्रिय खून की कमी के दौरान, और खून की कमी (सी) की समाप्ति के बाद। संकेत दिया सभी बार सेकंड में कर रहे हैं। भ्रूण बाईं ओर का सामना करना पड़ शीर्ष और उदर सतह पर पूर्वकाल के साथ पार्श्व उन्मुख होते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन। थक्कारोधी Hirudin के प्रशासन में काफी वाहन नियंत्रण (डी) (पी <.0001, छात्र की टी परीक्षण) बनाम खून बह रहा गुना वृद्धि हुई करने के लिए नेतृत्व किया।पीजी "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
भ्रूण DPF 2 में (: EGFP kdrl) और लाल रक्त कोशिकाओं (dsred gata1a): चित्रा 3। पोत चोट संवहनी अन्तःचूचुक के लिए मार्कर का उपयोग करने के बाद timelapse के डीआईसी से ट्रांसजेनिक मार्कर का उपयोग यांत्रिक चोट और मरम्मत Visualizing पोस्टरों और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी। छवियाँ वाहिकाओं और फिर से स्थापित रक्त प्रवाह (टी = 210), और सामान्य पोत संरचना (टी = 615) के जाहिरा तौर पर पूर्ण बहाली के साथ स्थानीय लाल रक्त कोशिका संचय (टी = 25), आंशिक मरम्मत में एक अंतर दिखाया। समय मिनट में संकेत दिया है। भ्रूण बाईं ओर का सामना करना पड़ शीर्ष और उदर सतह पर पूर्वकाल के साथ पार्श्व उन्मुख होते हैं। * पृष्ठीय महाधमनी की स्थिति को इंगित करता है। चोट (नोक) दुम नस और दुम जाल का हिस्सा खलल डाल दिया। स्तर25 माइक्रोन पट्टी है।
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Discussion
Zebrafish 10 लोग घायल हो गए लेजर चोट 13-15, लेजर प्रेरित घनास्त्रता 16, और उपकला सहित घावों के विभिन्न प्रकारों के लिए एक मॉडल के रूप में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। हम निष्पादित करने के लिए सरल है और वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी के लिए अत्यधिक उत्तरदायी है कि एक में vivo मॉडल में एक नियंत्रित चोट पैदा करता है कि यांत्रिक लोग घायल हो गए की एक विधि की रिपोर्ट। एक तेजी से और औसत दर्जे का hemostatic प्रतिक्रिया और वीडियो और timelapse माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर नजर रखी जा सकती है कि एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घाव की मरम्मत कार्यक्रम में चोट का परिणाम है।
उनके सरल और टकसाली संवहनी एक परिभाषित और microscopically सुलभ साइट पर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट परमिट जो शरीर रचना विज्ञान, और सबसे संवहनी और hematopoietic प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति चोट करने के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए zebrafish भ्रूण विशेष रूप से उपयोगी है। हालांकि, zebrafish भ्रूण इस प्रणाली के सबसे एपी, जिससे विकास 5,6 के पहले सप्ताह के दौरान कार्यात्मक लिम्फोसाइटों की जरूरत नहीं हैसूजन और मरम्मत में जन्मजात उन्मुक्ति के योगदान के अध्ययन के लिए propriate। वर्तमान में, ट्रांसजेनिक zebrafish की एक विस्तृत विविधता thrombocytes, फाइब्रिनोजेन, एरिथ्रोसाइट्स, leukocytes और संवहनी अन्तःचूचुक लेबल कि लाइनों सहित thrombus गठन, जमावट, सूजन और घाव की मरम्मत, में भाग लेते हैं कि कोशिकाओं और प्रोटीन के लिए मार्कर के साथ मौजूद 17,21,25- 31। ये और अन्य उपकरणों के लिए यह संभव महत्वपूर्ण विस्तार से रक्तस्तम्भन और मरम्मत में शामिल प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए करना चाहिए।
मैकेनिकल चोट zebrafish में रक्तस्तम्भन के अध्ययन के लिए लेजर चोट पूरक। लेजर प्रेरित चोट zebrafish भ्रूण और माउस मॉडल, लेजर चोट जमावट और thrombocyte / प्लेटलेट सक्रियण पूरी तरह से 16,32 नहीं जाना जाता है चलाता है जिसके द्वारा तंत्र में thrombus गठन को गति प्रदान करने के लिए साल के लिए इस्तेमाल किया गया है। मैकेनिकल चोट, शायद, संवहनी उल्लंघन से जमावट उत्प्रेरण के लिए एक physiologically प्रासंगिक तरीका प्रदान करता है औरऊतक-कारक पर निर्भर जमावट झरना की दीक्षा। Hirudin उपचार में काफी चोट के बाद खून बह रहा गुना वृद्धि हुई है कि खोज इस मॉडल थ्रोम्बिन पर निर्भर है कि पता चलता है। मैकेनिकल चोट अतिरिक्त पोत की मरम्मत का पालन करने के लिए एक अवसर प्रदान करने के लिए एक रक्त वाहिका की पर्याप्त व्यवधान प्रदान करके लेजर चोट पूरक। पिछले अध्ययनों से सफलतापूर्वक औषधीय और आनुवंशिक हेरफेर 19,33 की स्थिति में कई बार खून बह में मतभेद दिखाने के लिए स्केलपेल चीरा और सुई पंचर द्वारा यांत्रिक चोट का इस्तेमाल किया है। वर्तमान मॉडल में इस्तेमाल minutia पिन चोट की वजह से यह उत्पादन घाव के छोटे और परिभाषित आकार करने के लिए और बेहतर पोत recanalization और मरम्मत के अध्ययन का अवसर प्रदान करके एक अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट प्रदान करके अन्य चोट मॉडल के पूरक हो सकते हैं।
Zebrafish में लोग घायल हो गए उपकला सूजन और घाव की मरम्मत 10 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल साबित हो गया है। करने की क्षमताएक संवहनी चोट आतंच एक अनंतिम मैट्रिक्स, थ्रोम्बी और मलबा साफ कर रहे हैं प्रदान करता है जहां सेटिंग में और अधिक जटिल घावों की मरम्मत का आकलन करने के लिए एक अवसर प्रदान करता लागू करने, और जहाजों को पुनर्जीवित। इन प्रक्रियाओं के सामान्य ऊतकों की मरम्मत में और तीव्र और जीर्ण सूजन और संवहनी विकृति में भाग लेने के रूप में, इस विधि सेलुलर व्यवहार एक पूरी पशु मॉडल में वास्तविक समय में नजर रखी जा सकती है, जहां एक प्रणाली में मानव रोग के पहलुओं मॉडल करने के लिए मदद करनी चाहिए।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
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