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Bioengineering

ICPMS नमूना शुरूआत के लिए एक microfluidic चिप

Published: March 5, 2015 doi: 10.3791/52525
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich

Summary

हम उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ICPMS) के लिए एक असतत छोटी बूंद नमूना परिचय प्रणाली मौजूद है। यह 90 से 7000 हर्ट्ज के लिए आवृत्तियों पर 40-60 माइक्रोन के आकार की सीमा में अत्यधिक monodisperse बूंदों उत्पन्न करता है कि एक सस्ते और डिस्पोजेबल microfluidic चिप पर आधारित है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ICPMS) के लिए नमूना परिचय प्रणाली के रूप में एक डिस्पोजेबल कम लागत microfluidic चिप के निर्माण और उपयोग पर चर्चा। चिप perfluorohexane (PFH) में monodisperse जलीय नमूना बूंदों पैदा करता है। आकार और जलीय बूंदों की आवृत्ति क्रमश: 40 से 60 माइक्रोन की रेंज में और 90 से 7000 हर्ट्ज के लिए अलग किया जा सकता है। बूंदों PFH के एक दूसरे के प्रवाह के साथ चिप से निकली और इंजेक्शन के दौरान बरकरार रहेगा रहे हैं। एक कस्टम निर्मित desolvation प्रणाली PFH निकालता है और ICPMS में बूंदों transports। इधर, एक संकीर्ण तीव्रता वितरण के साथ बहुत स्थिर संकेतों बूंदों के monodispersity दिखा, मापा जा सकता है। हम परिचय प्रणाली मात्रात्मक एकल गोजातीय लाल रक्त कोशिकाओं में लोहे का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। भविष्य में, परिचय डिवाइस की क्षमताओं को आसानी से अतिरिक्त microfluidic मॉड्यूल के एकीकरण के द्वारा बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ICPMS) द्वारा तरल नमूनों की मौलिक विश्लेषण सामान्यतः परिचय प्रणाली एक के रूप में स्प्रे कक्षों के साथ संयोजन में नेब्युलाइज़र्स का उपयोग किया जाता है। इस नमूने परिचय प्रणाली में नमूना एक polydisperse एयरोसोल उत्पन्न करने के लिए एक छिटकानेवाला से छिड़काव किया जाता है। एक बहाव के स्प्रे चैम्बर बड़ी बूंदों बाहर फिल्टर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस विधि उच्च नमूना खपत (> 0.3 मिलीलीटर मिनट -1) 2 और एक अधूरी नमूना परिवहन के साथ जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, यह केवल माइक्रोलीटर नमूना संस्करणों, जैविक फोरेंसिक, विषाक्तता और नैदानिक ​​अध्ययन 3 के रूप में उपलब्ध हैं, जहां अनुप्रयोगों के लिए अव्यावहारिक हो जाता है। नमूना की खपत को कम करने के लिए, छोटे नोक आयामों के साथ नेब्युलाइज़र्स 3 विकसित किए गए। हालांकि, कम नोक आकार पचाया जैविक तरल पदार्थ या केंद्रित नमक समाधान के नमूने तीन विश्लेषण किया जाना है जब clogging का खतरा बढ़ जाता है।

एट अल। 4 द्वारा प्रस्तावित किया गया था। लेखकों एक piezo-विद्युत चालित micropump द्वारा तैयार किए गए जो monodisperse असतत microdroplets, के रूप में ICPMS में एक तरल इंजेक्शन। यह बहुत प्रणाली विस्तृत आवेदन नहीं मिला है, भले ही यह ICPMS में असतत छोटी बूंद परिचय की अवधारणा के आगे विकास की पहल की। आज, पीजो-विद्युत 30, 50, 70 और 100 माइक्रोन के आकार में और 100-2,000 हर्ट्ज की आवृत्तियों पर बूंदों उत्पन्न कर सकते हैं, जो प्रणाली, वितरण संचालित है, खरीदा जा सकता है। बूंदों 100% दक्षता 5 के पास से ICPMS में ले जाया जा सकता है। ये microdroplet dispensers के मात्रात्मक एकल नैनोकणों 5,6 मापने के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत जैविक कोशिकाओं 7 निस्र्पक के लिए लागू किया गया है। थर्मल inkjet प्रौद्योगिकी 8 पर आधारित एक ऐसी ही प्रणाली जैविक नमूने 9 के विश्लेषण के लिए परीक्षण किया गया था। Avai यद्यपिlable एक छोटी बूंद परिचय सिस्टम छोटे नमूना संस्करणों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बहुत कुशल हैं और नैनोकणों और कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए वादा कर रहे हैं, वे कई सीमाएं हैं। (कस्टम सेटिंग्स 10 उपयोग किया जाता है, जब तक) एक निश्चित नोक आकार के लिए, छोटी बूंद आकार केवल थोड़ा अलग किया जा सकता है। तरल (पीएच, नमक सामग्री) के भौतिक गुणों का परिवर्तन छोटी बूंद विशेषताओं (आकार, इंजेक्शन गति) को बदल सकते हैं। इसके अलावा, इन उपकरणों के बजाय, महंगा clogging से ग्रस्त हैं और साफ करने के लिए मुश्किल हैं।

बूंदों उत्पन्न करने के लिए एक अन्य विधि छोटी बूंद microfluidics 11 के क्षेत्र में जाना जाता है। हाल के वर्षों में छोटी बूंद microfluidics (जैव) रासायनिक प्रतिक्रियाओं 12-15 के लिए और एकल कोशिका के अध्ययन 16,17 के लिए ब्याज का फायदा हुआ है। साथ ही, इस तकनीक electrospray आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री 18,19 में नमूने को शुरू करने के लिए और मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / ionizatio में नमूने तैयार करने के लिए लागू किया गया थाएन मास स्पेक्ट्रोमेट्री 20,21।

हाल ही में, हम ICPMS 22 में नमूना शुरूआत के लिए एक microfluidic आधारित प्रणाली शुरू की। हमारे परिचय प्रणाली के प्रमुख घटक तरल सहायता प्रदान की छोटी बूंद इंजेक्शन (भार रखना) चिप है। इस चिप पूरी तरह से पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) के होते हैं। पहला चैनल जंक्शन में एक जलीय नमूना समाधान (चित्रा 1) के monodisperse बूंदों उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है ध्यान केंद्रित प्रवाह। इस प्रयोजन के लिए और अमिश्रणीय वाहक चरण perfluorohexane (PFH) अत्यधिक अस्थिर (58-60 डिग्री सेल्सियस 23 के उबलते बिंदु) (चित्रा 1) का इस्तेमाल किया जाता है। ये PFH गुण एक स्थिर छोटी बूंद पीढ़ी और वाहक चरण के तेजी से हटाने के लिए सक्षम है। इस पीढ़ी विधि कम नमूना तरल प्रभाव के गुणों में परिवर्तन, अन्य छोटी बूंद जनरेटर की तुलना में। छोटी बूंद आकार जलीय चरण और PFH का प्रवाह दर को बदलकर एक विस्तृत श्रृंखला पर समायोज्य है। एक बहाव secondar मेंY जंक्शन, अधिक PFH कम से कम 1 मीटर सेकंड के लिए प्रवाह की गति को बढ़ाने के लिए जोड़ा गया है -1। इस गति पर तरल छोटी बूंद विनाश (चित्रा 1 इनसेट) के बिना स्थिर और सीधे विमान में चिप (चित्रा 1) से अलग हो सकते हैं। इस दोहरे-जंक्शन डिजाइन छोटी बूंद पीढ़ी के स्वतंत्र जेट स्थिरता को नियंत्रित करने की अनुमति देता है। बूंदों एक अनुकूलित परिवहन प्रणाली के साथ ICPMS करने के लिए ले जाया जाता है। इस प्रणाली के एक गिरने ट्यूब और PFH दूर करने के लिए एक झिल्ली desolvator शामिल हैं। जलीय बूंदों के सूखे अवशेष बाद में ICPMS के प्लाज्मा और एक जन डिटेक्टर उपायों आयनों में आयनित कर रहे हैं। चिप के सामने का हिस्सा प्रति बैरल के आकार छोटी बूंद परिवहन प्रणाली के साथ एक तंग कनेक्शन सुनिश्चित करने के लिए है। नोजल के साथ संपर्क से परहेज है क्योंकि PFH में बूंदों के रूप में जलीय नमूने का इंजेक्शन, फायदेमंद है। यह काफी सेल निलंबन या सह के साथ काम कर रहा है जब एक समस्या हो सकती है, जो नोक clogging के जोखिम, कम करती हैncentrated नमक समाधान। नरम लिथोग्राफी PDMS के द्वारा गढ़े भार रखना चिप्स,,, (चिप प्रति माल की लागत लगभग $ 2) सस्ते डिस्पोजेबल और संशोधित करने के लिए आसान कर रहे हैं। मैनुअल काम का केवल एक छोटी राशि की आवश्यकता है कि निर्माण के साथ संयोजन में एक प्रयोग के लिए एक नई चिप के साथ किया जा सकता है। इसलिए, एक श्रमसाध्य सफाई की जरूरत नहीं है और पार संदूषण कम से कम है।

इधर, भार रखना नरम लिथोग्राफी द्वारा चिप और ICPMS के लिए अपने आवेदन के निर्माण में वर्णित हैं। एक जलीय समाधान और एक सेल निलंबन के साथ माप के उदाहरण प्रस्तुत कर रहे हैं।

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Protocol

1. एस यू-8 मास्टर निर्माण (चित्रा 2)

नोट: धूल के कणों की वजह से दोषों को रोकने के लिए एक साफ कमरे में एसयू 8 मास्टर molds के निर्माण को पूरा करें। दो वेफर्स निर्माण, microfluidic सुविधाओं और बिना एक के साथ एक वेफर के लिए आवश्यक हैं।

  1. Microfluidic चिप के लिए गुरु के नए नए साँचे तैयार करें। पहले सिलिकॉन वेफर के लिए एक आसंजन परत लागू होते हैं।
    1. 200 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक सिलिकॉन वेफर निर्जलीकरण। आर टी करने के लिए नीचे वेफर कूल और निम्न प्रोटोकॉल के साथ एस यू-8 के साथ एक स्पिन coater और स्पिन कोट इसे करने के लिए 2002 में इस पर लोड।
    2. बांटना के बारे में 3 मिलीग्राम वेफर पर विरोध।
    3. पूरे वेफर से अधिक का विरोध प्रसार करने के लिए 10 सेकंड के लिए 500 rpm पर वेफर स्पिन।
    4. लगभग 2 माइक्रोन के विरोध ऊंचाई को प्राप्त करने के लिए 30 सेकंड के लिए 2000 rpm पर वेफर स्पिन।
  2. एक एसीटोन लथपथ झाड़ू के साथ वेफर के किनारे से अतिरिक्त विरोध निकालने के लिए, को रोकने के लिएअगले चरण में गर्म थाली को वेफर के चिपके हुए। एक गर्म थाली पर 95 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड के लिए वेफर बनाओ।
  3. पराबैंगनी प्रकाश (80 एमजे / 365 एनएम पर 2 सेमी) के साथ पूरे वेफर बेनकाब। पोस्ट-सेंकना 120 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए वेफर।
  4. नीचे वेफर कूल और तुरंत फिर र -8 2050 के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कोट वेफर स्पिन:
    1. 20 सेकंड के लिए 100 rpm पर वेफर स्पिन (लगभग 3 मिलीलीटर र -8 इस कदम के दौरान विरोध बांटना)।
    2. पूरे वेफर से अधिक का विरोध प्रसार करने के लिए 10 सेकंड के लिए 500 rpm पर वेफर स्पिन।
    3. लगभग 40 माइक्रोन के विरोध मोटाई में जिसके परिणामस्वरूप 30 सेकंड के लिए 3250 rpm पर वेफर स्पिन।
  5. फिर, अतिरिक्त 65 डिग्री सेल्सियस पर एक एसीटोन लथपथ झाड़ू और नरम सेंकना 180 सेकंड के लिए एक गर्म थाली पर वेफर के साथ वेफर के किनारे से और 95 डिग्री सेल्सियस पर 360 सेकंड के लिए विरोध को हटा दें।
  6. एसटीआई द्वारा photomask तैयार करेंएक सोडा, नींबू कांच के लिए यह cking। मुखौटा डिजाइन के लिए चित्रा 3 देखें। तैयार मुखौटा के माध्यम से (365 एनएम पर मापा 160 MJ / 2 सेमी), पराबैंगनी प्रकाश के साथ विरोध का पर्दाफाश करने के लिए एक मुखौटा aligner का प्रयोग करें। 65 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड के लिए एक गर्म थाली पर फिर से उजागर वेफर सेंकना और 95 डिग्री सेल्सियस पर 360 सेकंड के लिए।
  7. आरटी के लिए वेफर नीचे ठंडा करने के बाद, विरोध विकसित करने के लिए 5 मिनट के लिए डेवलपर के साथ भरा एक गिलास पेट्री डिश में यह विसर्जित कर दिया। धीरे unexposed र -8 दूर करने के लिए पेट्री डिश आंदोलन। Isopropanol के साथ वेफर कुल्ला और एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ यह सूखी उड़ा।
  8. एक खुर्दबीन के नीचे वेफर की जाँच करें। मामले में पिछड़ा हुआ है, सुविधाओं पर रहता विरोध कदम 1.7 में वर्णित के रूप में, कुछ मिनट के लिए फिर से वेफर का विकास।
  9. 200 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए वेफर्स पाक द्वारा किसी भी अवशिष्ट विलायक निकालें। एक कदम Profiler के साथ सुविधाओं की ऊंचाई की जाँच करें। मापा ऊंचाई वांछित ऊंचाई से अलग मामले में इस आद्य के साथ शुरूफिर कर्नल और कदम 1.1.4 में स्पिन गति के लिए अनुकूलित।
  10. वेफर के लिए PDMS की चिपके को रोकने के लिए एक छोटे से चीनी मिट्टी के बरतन डिश में 1 एच 1, एच, 2 एच, 2 एच -perfluorodecyltrichlorosilane के 50 μl के साथ मिलकर desiccator में रखकर यह silanize। 100 एम्बार को desiccator में दबाव कम है और 12 घंटे के लिए वेफर सेते हैं।
    1. रिक्त PDMS के लिए भागों कदम 1.10 की विधि का उपयोग कर एक और सिलिकॉन वेफर silanize। एक एकल desiccator में एक ही समय में समय silanize दोनों वेफर्स बचाने के लिए।

2. भार रखना चिप निर्माण

नोट: भार रखना चिप चिपकने वाला संबंध में 24 से एक साथ बंधुआ रहे हैं कि दो PDMS के टुकड़े से बाहर कर दिया जाता है। पहले भाग से microfluidic सुविधाओं में शामिल है। अन्य भाग फ्लैट और चैनलों को सील करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक साथ बंधुआ, वे छोटी बूंद परिवहन प्रणाली के साथ चिप इंटरफेस करने के लिए आवश्यक गोल आकार के रूप में। इधर, का निर्माणदो भागों और उनके संबंधों में वर्णित है। सभी प्रक्रिया कदम चित्रा 4 में दिखाया जाता है।

  1. इलाज के एजेंट PDMS की 4 जी के साथ prepolymer की 40 ग्राम मिश्रण से PDMS की 44 जी तैयार है (यह अप करने के लिए 6 चिप्स में परिणाम होगा)। यह मुफ्त बुलबुला (इस बारे में 20 मिनट का समय लगेगा) है जब तक एक desiccator में PDMS देगास।
  2. संरचित हिस्सों की प्रतिकृति मोल्डिंग।
    1. वेफर के शीर्ष पर कास्टिंग फार्म प्लेस और डिजाइन के आसपास मार्गदर्शक संरचनाओं का उपयोग कर यह जगह में तस्वीर (चित्रा 5 देखें)। फ्लैट PDMS Halve के लिए जगह में तड़क छोड़ें।
    2. कास्टिंग के रूप में लगभग 3 degased PDMS की जी 4 के लिए डालो और 150 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर छह मिनट के लिए जगह है। कास्टिंग रूप में ठीक PDMS शांत हो जाओ और ध्यान से एक रंग का उपयोग कास्टिंग फार्म वेफर उठा।
    3. Microfluidic चैनलों के किसी भी प्रदूषण को रोकने के क्रम में संपर्क वाई में पहले से था कि चिप की ओर कवरटेप के साथ वेफर वें। ध्यान से अतिरिक्त PDMS दूर करने के लिए PDMS भाग की बढ़त के साथ टेप में कटौती।
  3. फ्लैट PDMS आधा खाली silanized वेफर के साथ 2.2.3 करने के लिए उपर्युक्त चरणों 2.2.1 दोहराने बनाना।
  4. टेप के छिलके और एक बायोप्सी पंचर साथ संरचित हिस्सों में तरल पदार्थ कनेक्शन छेद मुक्का। भंडारण के दौरान टेप के साथ ढांचे की रक्षा।
  5. एजेंट 24 इलाज PDMS का उपयोग कर चिपकने वाला संबंध के द्वारा एक साथ PDMS भागों बांड।
    1. एक अनुपचारित सिलिकॉन वेफर ले लो और PDMS 6000 rpm पर 30 सेकंड के लिए इलाज के एजेंट के साथ कोट इसे स्पिन। स्पिन coater से बाहर वेफर ले लो।
    2. संरचित हिस्सों से टेप निकालें और वेफर पर नीचे की ओर का सामना करना पड़ संरचनाओं के साथ उन्हें जगह है। धीरे हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए PDMS के शीर्ष पर धक्का।
    3. रिक्त PDMS हिस्सों से टेप निकालें। वेफर से एक संरचित Halve लो और मैन्युअल रूप से फ्लैट PDMS Halve के शीर्ष पर यह पंक्ति में। धीरे निचोड़हवाई बुलबुले को दूर करने और आरटी पर 24 घंटे के लिए इकट्ठे चिप इलाज बताने के लिए एक साथ हिस्सा है। इस चैनल के पतन का कारण बन सकता है के रूप में बल के साथ भागों को एक साथ धक्का नहीं है।
  6. आउटलेट नोक को खोलने के लिए एक उपयोगिता चाकू के साथ नोक चैनल के orthogonal सूचक रेखा के साथ चिप की नोक काटें। एक सीधे तरल इंजेक्शन के लिए आवश्यक है, जो एक सीधे कट, यह सुनिश्चित करने के लिए एक संरेखण उपकरण का प्रयोग करें। Microfluidic चैनलों और धूल के कणों में दोष के लिए एक खुर्दबीन के नीचे चिप का निरीक्षण किया। भंडारण के दौरान चिप्स की रक्षा के लिए इनलेट छेद पर एक टेप लगा।
  7. एक सूखी नाइट्रोजन के स्रोत के लिए और भार रखना चिप के सभी inlets के लिए ट्यूबिंग के साथ एक Woulff बोतल कनेक्ट करें। जमा 50 Woulff बोतल के तल पर 1 एच 1, एच, 2 एच, 2 एच -perfluorodecyltrichlorosilane की μl और इसे बंद कर दें।
  8. 1 एच 1 एच ले जाने नाइट्रोजन धारा के साथ 20 मिनट के लिए सभी चैनलों निस्तब्धता द्वारा microfluidic चैनलों Silanize एच, लगभग 1 मिलीग्राम / सेकंड की एक प्रवाह दर पर 2 एच -perfluorodecyltrichlorosilane। चिप्स के प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं और आरटी पर कम से कम कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है।

मापन / छोटी बूंद परिवहन प्रणाली के लिए 3. तैयारी

नोट: यह स्थापना के लिए एक स्थिर समर्थन संरचना के निर्माण के लिए आवश्यक है, के बाद से एक ऑप्टिकल तालिका के शीर्ष पर पूरे छोटी बूंद परिवहन प्रणाली का निर्माण। पूरे छोटी बूंद परिवहन प्रणाली की योजना चित्रा 6 में दिखाया गया है।

  1. खड़ी स्टेनलेस स्टील ट्यूब जुड़ी एक 50 सेमी के साथ एक कस्टम चक्रवाती पाली (मिथाइल methacrylate) (PMMA) एडाप्टर स्थापित करें। एक जन प्रवाह नियंत्रक के साथ एक हीलियम स्रोत के लिए एडाप्टर संलग्न। छोटी बूंद दृश्य के लिए विपरीत साइटों पर एडाप्टर के लिए एक (उच्च गति) कैमरा और एक दीपक संलग्न।
  2. स्टील ट्यूब के बीच में एक कारतूस हीटर प्लेस और पाली (विनाइल क्लोराइड) (पीवीसी) ट्यूबिंग और एक Legris ट्यूब का उपयोगकनेक्टर झिल्ली desolvator के प्रवेश के साथ स्टील ट्यूब के अंत कनेक्ट करने के लिए।
  3. सीधे ICPMS इनलेट से जुड़ा है, जो एक लामिना का प्रवाह एडाप्टर, के लिए एक और पीवीसी टयूबिंग के साथ desolvator के आउटलेट से कनेक्ट करें। एक जन प्रवाह नियंत्रक के साथ एक आर्गन स्रोत के लिए लामिना का प्रवाह एडाप्टर कनेक्ट और बाद में एक स्थिर आपरेशन हालत को प्राप्त करने के आर्गन मिश्रण करना करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं।
  4. एडाप्टर के साथ ही एक आत्मा के स्तर के साथ खड़ी स्टील ट्यूब संरेखित करें। संरेखण सही नहीं है, तो यह बूंदों की महत्वपूर्ण नुकसान हो सकता है। गैसों प्रणाली को गर्म समय के दौरान बाहर लीक को रोकने के लिए अनुकूलक में एक प्लग डालें।
  5. । सभी उपर्युक्त गैस बहती है और तालिका 1 से सेटिंग का उपयोग उपकरणों के प्रारंभ प्रणाली 15 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति दें। कारतूस हीटर, तापमान को स्थिर अग्रिम में इस पर स्विच करने के लिए दो घंटे की जरूरत है।
  6. चक्रवाती हीलियम एडाप्टर की ऊंचाई पर एक रैक पर सिरिंज पंप रखें। के बीच की दूरी रखेंसिरिंज पंप और जितना संभव हो कम अनुकूलक।

4. माप

नोट: निम्न प्रोटोकॉल क्योंकि इस्तेमाल किया जा सकता है कि समाधान और निलंबन की विविधता के सामान्य शब्दों में लिखा है। हालांकि, सेल निलंबन बूंदों के बहुमत केवल एक सेल ले जाने के लिए सुनिश्चित करें कि एकल कोशिका विश्लेषण किया जाता है जब <एक 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल, के एक एकाग्रता के लिए पतला होना चाहिए। सीरिंज की दुकान के नीचे की ओर इशारा करते हैं और वे नीचे की ओर इशारा करते हैं कि इस तरह से ट्यूबिंग स्थापित इतना है कि कोशिकाओं के साथ माप एक कोण पर सिरिंज पंप जगह के लिए।

  1. सीरिंज के लिए ट्यूबिंग संलग्न। लोड perfluorohexane के साथ दो 5 मिलीलीटर सीरिंज और एक नमूना समाधान या निलंबन के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज। सीरिंज और ट्यूबिंग में फंसे सभी बुलबुले निकालें।
  2. एक सिरिंज पंप में सीरिंज स्थापित करें और चिप के inlets के लिए उन्हें कनेक्ट। शुरू होने से सेटिंग से उपयोग करते हुए सिरिंज पंप प्रारंभतालिका 1 (या अधिक प्रवाह की दर)। प्रवाहों को स्थिर करने के लिए 3 से 5 मिनट दीजिए।
    1. एक ऊतक के साथ चिप की नोक से अतिरिक्त तरल निकालें। तरल पदार्थ अब एक सीधी विमान में चिप से बेदखल करना चाहिए। एक सीधे इंजेक्शन एक ऊतक के साथ पोंछते द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तो चिप की जगह है और इस कदम के साथ शुरू।
  3. एडाप्टर से प्लग निकालें और ध्यान एडाप्टर में चिप डालें। एफसी-40 यदि आवश्यक हो तो साथ चिप चिकनाना। एक चिप प्रयोगों के कम से कम दो घंटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. तालिका 1 से सिफारिश की माप रूपरेखा के भीतर होना करने के लिए प्रवाह दर को बदलें। PFH के निचले प्रवाह की दर PFH बचाता है, बल्कि समदाब रेखीय हस्तक्षेप की वजह से संकेत पृष्ठभूमि, कम कर देता है न केवल।
  5. (चुना प्रवाह दरों पर निर्भर करता है) को स्थिर करने के लिए सिस्टम 2-5 मिनट दीजिए। ब्याज की analytes की उच्चतम संकेत तीव्रता के लिए ICPMS अनुकूलन।
    1. क्रमिक सभी जी के प्रवाह को समायोजितब्याज की analytes की अधिकतम संकेत तीव्रता तक जन प्रवाह नियंत्रकों पर ases (1 टेबल में सिफारिश की सीमाओं देखें) हासिल की है। प्लाज्मा शक्ति और एक ही रास्ते में ICPMS पर (निर्माता की सिफारिश की पर्वतमाला के अनुसार) ध्यान केंद्रित लेंस voltages की धुन।
  6. 10 मिसे के एक बसना समय के लिए ICPMS सेट (इस्तेमाल बहुत ICPMS के लिए आवेदन किया है, लेकिन एक समय हल अधिग्रहण सुनिश्चित करने के लिए अन्य उपकरणों के साथ समायोजित किया जा सकता है)। निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए एक विशेष मी / z के संकेत रिकॉर्डिंग शुरू करो।
  7. माप के बाद, मूल्यांकन के लिए डेटा विश्लेषण कार्यक्रम के लिए कच्चे डेटा हस्तांतरण। बिन मायने रखता खिलाफ बिन केंद्र मूल्यों जिसके परिणामस्वरूप एक निर्मित समारोह, और साजिश के साथ 10 मिसे प्रति मायने में दिए गए डेटा,। एक गॉस समारोह के साथ साजिश रची आवृत्ति वितरण हिस्टोग्राम में प्रत्येक शिखर फिट बैठते हैं। मतलब और फिट की सिग्मा क्रमशः, मतलब संकेत तीव्रता और इसके मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं।
<पी वर्ग = "jove_title"> 5। कैलिब्रेशन संकल्पना

  1. तत्व या नमूने के रूप में एक ही प्रवाह दरों पर ब्याज के तत्वों से युक्त एक एकल या बहु-तत्व मानक समाधान के उपाय।
  2. एक खुर्दबीन पर एक पेट्री डिश में एक भार रखना चिप रखें। एक बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए एक गैर दौर चिप का उपयोग करें। चरण 2 में वर्णित है, लेकिन आंशिक रूप से गोल आकार एक के बजाय एक साधारण आयताकार कास्टिंग फार्म का उपयोग कर के रूप में इस चिप बनाना।
  3. छोटी बूंद पीढ़ी शुरू करने के लिए कदम 4.2.1 के लिए 4.1 का पालन करें। कदम 5.1 में इस्तेमाल प्रवाह दरों के लिए प्रवाह दर को निर्धारित करें।
  4. एक माइक्रोस्कोप (20x उद्देश्य) से जुड़ी एक उच्च गति कैमरा के साथ जलीय बूंदों के रिकॉर्ड छवियों। रिकॉर्डिंग से औसत छोटी बूंद व्यास प्राप्त करने के लिए बसु 25 से छोटी बूंद morphometry और velocimetry सॉफ्टवेयर की तरह एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
  5. छोटी बूंद मानते हुए एक गोलाकार वस्तु है, छोटी बूंद की मात्रा की गणना के लिए औसत छोटी बूंद व्यास का प्रयोग करें।
    1. इस मात्रा और के.एन. सेछोटी बूंद में एक analyte की खुद की एकाग्रता इसी परमाणुओं की संख्या की गणना। दक्षता का पता लगाने प्राप्त करने के लिए परमाणुओं की संख्या से छोटी बूंद प्रति मापा आयनों की संख्या फूट डालो। एक अज्ञात नमूने में परमाणुओं की संख्या की गणना करने के लिए इस दक्षता का पता लगाने का उपयोग करें।
      नोट: व्यक्तिगत चिप्स के बीच विविधताओं 22 छोटे हैं के बाद से, यह प्रवाह दरों में ही रहते हैं अगर हर चिप या समाधान के लिए छोटी बूंद के आकार के माप को दोहराने के लिए आवश्यक नहीं है। विशिष्ट प्रवाह दरों के अनुसार छोटी बूंद आकार और आवृत्तियों की एक सूची Verboket एट अल। 22 द्वारा प्रकाशित किया जाता है।

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Representative Results

प्रस्तुत प्रणाली समाधान या कोशिकाओं या नैनोकणों युक्त निलंबन की छोटी मात्रा को मापने के लिए नियोजित किया जा सकता है। एकल कक्षों का एक मानक समाधान और लक्षण की एक माप के उदाहरण यहाँ दिखाए जाते हैं। अधिक उदाहरण Verboket एट अल। 22 में पाया जा सकता है।

आम तौर पर एक समाधान की एक भी बूंद के संकेत बहुत ही कम घटना है। यह आमतौर पर एक कुछ सौ μsec 26 के लिए रहता है। यहां इस्तेमाल ICPMS के साथ। इस तरह की छोटी संकेतों अस्थायी हल नहीं किया जा सकता है (समय 10 मिसे ध्यान केन्द्रित करना) चित्रा 7A और चित्रा एक ना मानक समाधान के संकेतों और आवृत्ति वितरण हिस्टोग्राम दिखाने 7b। बूंदों एक अस्थायी घबराना> 10 मिसे के साथ प्लाज्मा पर पहुंचें। पता लगाने अनसिंक्रनाइज़्ड है। एक (201 ± 24), दो (381 ± 34) या तीन (560 ± 45) के संकेतों बूंदों एक बसना समय के भीतर पता चला रहे हैं। संकेत तीव्रता में कम भिन्नता उच्च DRO पता चलता हैplet monodispersity। पहली पीछा शिखर संभावना छोटी बूंद टुकड़े का परिणाम है; इस विखंडन के कारण जांच के तहत अब भी है।

(फ़े मानक समाधान का उपयोग) 5 में वर्णित अंशांकन दृष्टिकोण फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में निलंबित कर दिया एकल गोजातीय / बछड़ा लाल रक्त कोशिकाओं के फ़े सामग्री का निर्धारण (व्यास में 6-7 माइक्रोन) के लिए परीक्षण किया गया था। एक 10 x 7 कोशिकाओं मिलीलीटर -1 के निलंबन की बूंदों के बहुमत ले कि केवल एक सेल। चित्रा 8 आवृत्ति वितरण हिस्टोग्राम के रूप में कोशिकाओं से संकेतों से पता चलता है सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। औसतन हर सेल (देखें Verboket एट अल। 22) 5.3 ± 1.2 एक्स 10 8 फ़े परमाणुओं निहित।

चित्र 1
छोटी बूंद पीढ़ी, त्वरण और इंजेक्शन की चित्रा 1. सूक्ष्मछवि। एक प्रवाह ध्यान केंद्रित junct मेंआयन, monodisperse जलीय बूंदों PFH की धारा में उत्पन्न कर रहे हैं। अतिरिक्त PFH एक दूसरे जंक्शन पर जोड़ा जाता है। बाद में, तरल धारा एक नोजल के माध्यम से भार रखना चिप से अलग हो जाता है। तीर प्रवाह की दिशा का संकेत मिलता है। स्केल बार 500 माइक्रोन है। इनसेट: भार रखना चिप से इंजेक्शन के बाद एक PFH खोल में एक जलीय छोटी बूंद की सूक्ष्मछवि। स्केल बार 100 माइक्रोन। 22 से अनुमति के साथ अनुकूलित। कॉपीराइट 2014 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। यह आंकड़ा पुनश्च डिट्रिच की प्रयोगशाला में प्रकाशन के बाद से किए गए शोध से डेटा के साथ संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
र -8 प्रसंस्करण चित्रा 2. योजनाबद्ध। सबसे पहले एक आसंजन परत लेपित है। एक सिलिकॉन वेफर स्पिन है, र 8 2002 के साथ लेपित नरम पकाया जाता है, बाढ़ पराबैंगनी प्रकाश और पोस्ट बेक्ड साथ अवगत कराया। इस परत के शीर्ष पर microfluidic संरचनाओं का उत्पादन किया जाता है। वेफर बेक्ड र -8 2050 और मुलायम के साथ लेपित स्पिन है। microfluidic संरचनाओं के डिजाइन एक photomask के माध्यम से पराबैंगनी प्रकाश के साथ यह उजागर द्वारा वेफर को सौंप दिया है। एक postexposure सेंकना करने के बाद, photoresist के विकसित की है और एक हादबैक किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
निम्न सुविधाओं से युक्त भार रखना चिप के लिए photomask चित्रा 3. डिजाइन: कास्टिंग फार्म के लिए एक) मार्गदर्शक संरचनाओं, ख) छोटी बूंद त्वरण के लिए PFH के लिए एक इनलेट, ग) छोटी बूंद पीढ़ी और डी) एक इनलेट के लिए PFH के लिए एक इनलेट जलीय नमूने के लिए।चिप की नोक बंद को काटने के लिए ई) सूचक लाइन। चैनल चौड़ाई च) 40 माइक्रोन, छ) = 20 माइक्रोन और ज) = 25 माइक्रोन =। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. भार रखना चिप निर्माण की प्रक्रिया चार्ट। सबसे पहले संरचित और फ्लैट PDMS भागों प्रतिकृति मोल्डिंग द्वारा गढ़े हैं। दो टुकड़े चिपकने वाला संबंध के द्वारा एक साथ बंधुआ रहे हैं। अंत में, चिप की नोक काट रहा है और microfluidic चैनलों silanized कर रहे हैं। 22 से अनुमति के साथ अनुकूलित। कॉपीराइट 2014 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। यह आंकड़ा प्रकाशन के बाद से संशोधित किया गया है। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्रा 5
चित्रा 5. भार रखना चिप के लिए कास्टिंग एल्यूमीनियम फार्म की तकनीकी ड्राइंग। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
सेटअप (पैमाने पर नहीं) के 6 चित्रा योजनाबद्ध ड्राइंग। प्रणाली भार रखना चिप, एक चक्रवाती एडाप्टर, एक गर्म स्टील ट्यूब, एक झिल्ली desolvator, और एक ICPMS के होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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इन संकेतों के 7 चित्रा (ए) के केजी -1 ना मानक समाधान के लिए एक एक मिलीग्राम की से बनाया बूंदों के संकेतों। (बी) आवृत्ति वितरण हिस्टोग्राम। 10 मिसे में एक (पीला) के समय का संकेत है, दो (लाल) या तीन (नीला) बूंदों ध्यान केन्द्रित दर्ज किए गए। मतलब है और संकेतों का मानक विचलन फिटिंग गाऊसी कार्यों द्वारा निर्धारित किया गया है। इस्तेमाल किया प्रवाह की दर 0.5, 50, और 60 μl मिनट थे - छोटी बूंद त्वरण के लिए छोटी बूंद पीढ़ी के लिए एक जलीय नमूने की, PFH, और PFH, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
56 फ़े + के 8 चित्रा आवृत्ति वितरण हिस्टोग्राम जीई का संकेतलाल रक्त कोशिकाओं द्वारा nerated। मतलब है और संकेतों का मानक विचलन एक गाऊसी समारोह फिटिंग द्वारा निर्धारित किया गया है। क्रमशः, छोटी बूंद त्वरण के लिए छोटी बूंद पीढ़ी के लिए सेल निलंबन, PFH की 1, और PFH - इस्तेमाल किया प्रवाह दरों में 2, 80, और 80 μl मिनट थे।

उन्होंने कहा कि गैस प्रवाह की दर 0.6-0.8 एल मिनट -1
कारतूस हीटर 30 डब्ल्यू
Desolvator झिल्ली तापमान 160 डिग्री सेल्सियस
Desolvator झाडू गैस प्रवाह की दर 3-4 एल मिनट -1
अर गैस प्रवाह की दर 0.1 एल मिनट -1
आईसीपी प्लाज्मा बिजली 1300 डब्ल्यू
नमूना प्रवाह की दर चालू होना 1 μl मिनट -1
माप 0.3-15 μl मिनट -1
PFH छोटी बूंद पीढ़ी के प्रवाह की दर चालू होना 60 μl मिनट -1
माप 35-80 μl मिनट -1
PFH छोटी बूंद त्वरण के प्रवाह की दर चालू होना 60 μl मिनट -1
माप 35-80 μl मिनट -1

तालिका 1. प्रारंभ करें सेटिंग्स ICPMS और सिरिंज पंप के लिए माप सेटिंग्स की सिफारिश की है।

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Discussion

चिप्स का निर्माण बहुत विश्वसनीय है हालांकि विशेष ध्यान देने की जरूरत है कि निर्माण के दौरान कुछ महत्वपूर्ण अंक हैं। सबसे पहले, विधानसभा के दौरान साफ-सफाई धूल से चिप के प्रदूषण को रोकने के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है। धूल चैनलों ब्लॉक और एक स्थिर छोटी बूंद पीढ़ी रोका जा सकता है। दूसरा, यह टिप नोक चैनल के orthogonal कट जाता है कि विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। कटौती के कोण जोरदार इंजेक्शन कोण को प्रभावित करती है। तरल एक कोण पर अलग हो जाता है, तो यह निकली बूंदों का एक नुकसान हो सकता है।

सेटअप जब इमारत यह स्थिर है कि सुनिश्चित करते हैं। धातु ट्यूब और एडाप्टर के ऊर्ध्वाधर संरेखण महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा माप के दौरान विशेष ध्यान देने की जरूरत है कि कुछ अंक हैं। अनुकूलक में चिप की प्रविष्टि सावधानी से किया जाना है। यह प्रविष्टि के दौरान जेट बाधित और बंद हो जाता है कि हो सकता है। कोशिकाओं की स्थिति और आधारित व्यापार वातावरण के साथ माप के लिएसिरिंज पंप और टयूबिंग की ntation महत्वपूर्ण हैं। उनका उचित स्थान सिरिंज और टयूबिंग में कोशिकाओं के बसने से कम कर सकते हैं।

यहाँ प्रस्तुत भार रखना चिप मौजूदा वाणिज्यिक छोटी बूंद जनरेटर पर कई फायदे हैं। प्रणाली, और अधिक मजबूत है और आगे चैनल ज्यामिति के संशोधन के द्वारा बढ़ाया जा सकता है जो एक व्यापक बूंद आकार रेंज प्रदान करता है, और प्रयोज्य है। एक एकल उपयोग डिवाइस छोटे चैनलों रोकना कर सकते हैं और हमेशा के लिए आसानी से बाहर नहीं धोया जा सकता है, जो उदाहरण नैनोकणों या सेल निलंबन, के लिए के रूप में, लवण या ठोस अवशेषों की एक उच्च सामग्री के साथ नमूनों के विश्लेषण के लिए एक विशेष रुचि है। एमएस में भार रखना द्वारा उत्पन्न एकल microdroplets के परिवहन अभी भी हमारी प्रणाली में एक सीमित कदम है और आगे अनुकूलित किया जाना है। मौजूदा छोटी बूंद परिवहन विधानसभा, अन्यथा अतिरिक्त वर्णक्रमीय और गैर-स्पेक्ट्रल हस्तक्षेप बना सकते हैं और प्लाज्मा अस्थायित्व का कारण है, लेकिन एसटीआई होगा जो PFH वाष्प, हटाता है, हालांकिएमएस में छोटी बूंद आगमन और एक अधूरी छोटी बूंद परिवहन के एक उच्च अस्थायी घबराना में डालूँगा का परिणाम है। वाणिज्यिक उपलब्ध छोटी बूंद परिचय प्रणालियों की तुलना में इस स्थापना के लिए परिवहन प्रणाली को और अधिक उपकरणों की आवश्यकता है। वर्तमान चिप नमूना परिचय के लिए ही बनाया गया है। हालांकि, मामूली डिजाइन उन्नत परिचय के परिवर्तन और नमूना तैयार करने के साथ बादल जैसे, कमजोर पड़ने 27-29, अल्ट्रा तेजी से 30 मिश्रण, रासायनिक प्रतिक्रियाओं 31, जुदाई 32-34, या सेल 35,36 छँटाई, पर चिप लागू किया जा कदम। उन्नत परिचय उपकरणों के तहत हम उदाहरण के लिए एक एकल चिप के साथ क्रमिक रूप से नमूना और मानक बूंदों की शुरूआत या समानांतर समझते हैं। इस throughput बढ़ाने और मात्रात्मक विश्लेषण की सटीकता में सुधार होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer 100 mm Si-Mat (Kaufering, Germany)
SU-8 2002 Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)
SU-8 2050 Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)
Acetone Merk VWR (Darmstadt, Germany) 100014
MR-developer 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)
Isopropanol Merk VWR (Darmstadt, Germany) 109634
1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) AB111155
Sylgard 184 silicone elastomer kit (PDMS) Dow Corning (Michigan, U.S.A.) 39100000
Perfluorohexane 99% Sigma-Aldrich (Missouri, U.S.A.) 281042
FC-40 ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) AB103511
Phosphate-buffered saline  Life Technologies (Paisley, U.K.)  10010-015
Red blood cells in phosphate-buffered saline Rockland Immunochemicals Inc. (Pennsylvania, U.S.A.)  R400-0100
Single-element standard solutions Na, Fe Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.)
Multielement standard solution  Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) IV
Nitric acid Sub-boiled
Ultrahigh-purity water Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.)
Hot plate HP 160 III BM Sawatec (Sax, Switzerland) used for wafer preparation
Spin modules SM 180 BM Sawatec (Sax, Switzerland) used for wafer preparation
High resolution film photomask Microlitho (Essex, U.K.)
Step profiler Dektak XT advanced Bruker  (Massachusetts, U.S.A.)
Hot plate MR 3002 Heidolph (Schwabach, Germany) used for replica molding 
1.5 mm biopsy puncher Miltex (Pennsylvania, U.S.A.) 33-31AA/33-31A
Spin coater  WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell (Pennsylvania, U.S.A.) used for adhesive bonding
Syringe pump neMESYS Cetoni (Korbussen, Germany)
1 ml syringe  Codan (Lensahn, Germany)  62.1002
5 ml syringe  B. Braun (Melsungen, Germany)  4606051V
PTFE tubing  PKM SA (Lyss, Switzerland)  PTFE-AWG-TFT20.N
Quadrupole-based ICPMS ELAN6000 PerkinElmer (Massachusetts, U.S.A.) 
Membrane desolvator CETAC6000AT+ CETAC Technologies (Nebraska, U.S.A.)  only the desolvator unit is used
High speed camera Miro M110 Vision Research (New Jersey, U.S.A.)
Data analysis program Origin pro OriginLab Corp. (Massachusetts, U.S.A.) version 8.6
Microscope Olympus (Tokyo, Japan) IX71

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References

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