Dit artikel beschrijft de methode voor het toedienen van een korte periode van intermitterende hypoxie tot postnatale dag 1-8 muis of rat pups. Deze aanpak effectief ontlokt een robuust weefsel niveau "priming effect" op gekweekte neurale stamcellen die binnen 30 minuten van de blootstelling hypoxie worden geoogst.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Uitgebreide kweek van neurale stam-/voorlopercellen vergemakkelijkt in vitro analyses om hun biologie te begrijpen terwijl het de uitbreiding van celpopulaties naar voldoende aantallen voorafgaand aan transplantatie mogelijk maakt. Het identificeren van benaderingen om dit proces te verfijnen, om de productie van alle CNS-celtypen (i.e., neuronen) te verhogen, en mogelijk bij te dragen aan therapeutische celtherapieprotocollen is een hoge onderzoeksprioriteit. Dit rapport beschrijft een gemakkelijk toe te passen in vivo “pre-conditioning” stimulus die kan worden toegediend aan wakkere, niet-geanesthetiseerde dieren. Het is dus een niet-invasieve en niet-stressvolle procedure. Specifiek beschreven zijn de procedures voor het blootstellen van muis- of rattenpups (leeftijd postnatale dag 1-8) aan een korte (40-80 min) periode van intermitterende hypoxie (AIH). De procedures die in dit videoprotocol zijn opgenomen, omvatten de kalibratie van de whole-body plethysmografiekamer waarin pups worden geplaatst tijdens AIH en de technische details van AIH-blootstelling. De effectiviteit van deze benadering om weefselveranderingen in het wakkere dier teweeg te brengen, wordt aangetoond door de verbetering van daaropvolgende in vitro uitbreiding en neuronale differentiatie in cellen die zijn gehaald uit de subventriculaire zone (SVZ). Deze resultaten ondersteunen de notie dat weefselveranderingen in meerdere systemen kunnen worden waargenomen na AIH, en ondersteunen de voortzetting van optimalisatie en vestiging van AIH als een priming- of conditioneringsmodaliteit voor therapeutische celpopulaties.
Inleiding
Het doel van deze methode is reproduceerbaar en effectief op intermitterende aanvallen van systemische verlaagd ambient zuurstof neonatale knaagdieren. De reden voor het gebruik van intermitterende hypoxie (IH) tot stamcelbiologie manipuleren is afkomstig van in vitro celkweek experimenten waarbij O 2 -gehalte van de groei media is veranderd. Specifiek in vergelijking met "standaard" condities van 20% O 2, verlengde kweek van stam / voorlopercellen cel populaties cellen in 3% O 2 leidt tot verhoogde proliferatie, apoptose verlaagde en verhoogde neuronale opbrengst 1,2.
Deze groep heeft ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Alle dierlijke procedures in dit protocol worden uitgevoerd met toestemming van de Universiteit van Florida Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en zijn in overeenstemming met de "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren.
1. Basic Experimentele ingesteld voordat intermitterende hypoxie Administration
- Expose pups 12 de verschillende gasmengsels met een hele lichaam muis plethysmograaf kamers op vrijwel dezelfde manier als volwassen knaagdieren voor andere experimentele doeleinden 5,13,14. De kamers hebben een 4 inch diameter (volume = 450 ml), dat van voldoende grootte om 4/3 of 2....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De eerste experimenten, gebaseerd op historische gegevens, werden uitgevoerd met 1 min cycluslengten. Op basis van de volgende kalibreringen in stap 2 hierboven werd vastgesteld dat het O-niveau 2 in de kamer was 13% na 1 min na hypoxie spoelen en dat het duurde ongeveer gelijktijdig terugkeren naar de basislijn 21%. Echter, een 2 minuten cyclus was voldoende om zowel te bereiken 10% zuurstof en terugkeer naar 21% in de "basislijn" cyclus. Vervolgens werden 2 min cycluslengtes gebruikt. De duur prot.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit werk rapporteert de ontwikkeling van een protocol om neonatale knaagdieren bloot te stellen aan AIH. De hier beschreven parameters veranderen effectief de in situ biologie van neurale stamcellen, wat waarneembaar is over meerdere rondes van celpassage. Specifiek, AIH verhoogt het aantal niet-aderente neurosferen, de expansie van cellen binnen elke neurosfeer (gereflecteerd door de diameter van de sfeer), de expansie van adherente NPC-populaties en de aanwezigheid van neuroblasten in zowel niet-adere.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de financieringsbronnen die verantwoordelijk zijn voor dit werk: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Perslucht |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% zuurstof, rest stikstof |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
Referenties
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tens....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
