水凝胶构造和纤维蛋白基胶方法来提供治疗的小鼠心肌梗死模型。

Introduction

心肌梗死（MI）被定义为血液的中断造成的主要冠状动脉的闭塞心脏的区域。从一个MI造成的损害是由于活心脏组织的重塑成非功能性疤痕组织，从而降低心脏的，或者更具体地说，左心室，击败适当的能力。这导致在血液的体积可以递送到身体与每次心跳，被称为每搏输出量，以及血液泵出心脏的与每次心跳的百分比，被称为射血分数⁶下降。这些以及其它缩水功能，增加了对心脏的其余部分的应变，以保持足够的功能。通常情况下，它会导致第二心脏发作，这种现象出现在个体⁷的约10％这增加了应变能变得如此严重。

虽然医疗实践已经发展到治疗心肌梗死的直接后果，没有任何的技术已经发展到停止，慢，或逆转组织重塑的负面影响。干然而细胞疗法已成为一个可能的途径为这样的处理，尽管它们有希望潜力，干细胞还没有被证明是成功的临床设置。一个理论为他们的缺点是无法保证的有益细胞保持在梗死足够长，以产生有利的结果⁵的部位。它已经显示，细胞的不超过24％被简单地注入到梗死部位存活和保持在损伤部位后1天交货^2。一种可能的前景为解决这一问题的细胞保留的是开发出封装任一细胞或治疗剂，其可以被输送到受损部位的生物相容水凝胶系统。所选择的这个协议的水凝胶是聚（乙二醇）二甲基丙烯酸酯，由于其先前在电池封装公关使用ocedures然而，能够包封的任何水凝胶可以用于^8。贴片直接向损伤部位的递送保证细胞与组织接触过在延长的时间周期，增加的时间长度，细胞可以提供有利的因素对底层心肌。

瓶颈的修补方法是秉承补丁到心脏表面的难度。许多团体通过各种技术，最普遍的是一个简单的缝合打结构建到心脏表面^9,10已经克服了这一点。这已被证明是成功的数目，其中所述构建体是由硬的材料制成的情况下，但试图在水凝胶系统时，由于高的水浓度和接插构建体的细腻性失败。为了克服这个问题，我们已利用模仿血块形成的化学纤维蛋白胶外部粘合剂系统。纤维蛋白胶已用于许多医疗手术，INC泸硬脑膜眼泪，支气管瘘，和角膜移植，突出产品的生物相容性用作伤口的密封剂^11-13。此外，血纤维蛋白已经被用于各种心脏目的，包括手术治疗左心室破裂和冠状动脉旁路手术，然而，其作为粘附胶用于心脏修补不常用^14-17。的凝血酶和纤维蛋白原的结果在生物相容性胶的简单制剂，可以直接放置在一个外部心脏贴片的外侧，提供了一个可行的粘附系统，以确保补丁到心脏的相互作用。

Protocol

程序符合IACUC协议号13302完全兼容，并已通过动物资源的划分。

1.仪器准备

1. 高压灭菌之前用来在外科手术，以保证无菌的所有非一次性的仪器。
2. 消毒与用途之间玻璃珠灭菌多次使用在会话仪器。

2.水凝胶制剂

1. 解冻板干细胞至少24小时之前创建的水凝胶结构的。
2. 制备贴剂前一天已在全部细节在以前的出版物^8,18所述的外科手术用立体光刻设备（或类似的仪器）。
3. 为了创建该水凝胶，首先生成一个计算机辅助设计（CAD）模型将所需的修补和出口设计stereolit​​hographic格式（STL）。
4. 创建由dissolvin预凝胶溶液克聚（乙二醇）二甲基丙烯酸酯（PEGDMA）在无菌的1×PBS，得到20％w / v的溶液。同时，溶解的光引发剂1- [4-（2-羟基 - 乙氧基） - 苯基] -2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮在DMSO中。添加光引发剂到PEGDMA溶液在最终瓦特/ V的0.5％。直接交联之前，加入100 ml细胞所需的密度。注：细胞密度在2.0×10 ⁵ -2.0×10 ⁶个细胞/ ml，推荐。
5. 吸取在该SLA平台中心的预凝胶溶液成菜并运行该SLA软件与以前上传的STL格式设计。
6. 除去从装置的补丁和孵化的水凝胶的O / N的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），补充有5％胎牛血清（FBS），100U / ml青霉素，和100毫克/毫升链霉素，以允许细胞以调节到贴片内的环境。

3.动物制备及口服intubati上

1. 评估之前，过程中的每个鼠标，以保证动物健康状况良好，因为从他们的美容习惯和相互作用决定与他们的笼子队友。注意：女8-10周龄的C57BL / 6J小鼠用于这个过程，但是，任何小鼠年龄或类型都可以使用。
2. 将动物进入麻醉室，并暴露于5％异氟烷以1升/分钟O ₂的支持。监测麻醉通过脚趾捏反射的水平。
3. 一旦动物被正确麻醉，称重，并把他们放在插管立场。
4. 引向动物的胸腔的光源，并使用镊子缩回喉面和露出声带。小心地将声带之间的20G的静脉留置针，并顺利插入气管。通过胸腔的机械运动检测正确插入一旦导管被连接到小动物呼吸机。
5. 调整通风设置为th动物根据制造商的指导方针ë重量。
6. 一旦插管，放置在加热垫上仰卧位的动物，以防止体温过低。确保该加热垫不超过40℃。如果必要的话，将动物和加热垫之间的屏障，以尽量减少烧伤的可能性。
7. 通过使用一个脱毛霜除去毛发从手术部位。由优碘和75％乙醇的3交替磨砂消毒的部位，以确保适当的消毒。放置一个悬垂性，以暴露刚好手术部位，并放置兽医软膏对眼睛，以防止在操作过程中干。

4.手术过程

1. 开胸是在动物的左侧进行的，因此，使一个皮肤切口约1cm到胸骨的左侧，在运行胸骨的长度。
2. 使用镊子的肌肉层与底层胸腔分开在两个步骤。观察Deline的阿婷线表示该动物的胸大肌肌肉。解除这种肌肉微微，它从底层腹外斜肌分离，向内缩回。然后，释放从在相同的方式的底层胸腔腹外斜肌肌肉，和缩回横向，提供第二，第三和第四肋的视野开阔图。
3. 执行第三和第四肋之间的开胸。轻轻抬起第四肋并使用cauterizer打开第三和第四肋骨之间的胸腔内。拉钩将进一步打开腔暴露心脏。
4. 使用镊子破裂心脏的心包薄。
5. 结扎左冠状动脉用8-0尼龙单丝缝合。放置缝线从心脏的顶点约4mm，左心房的底部前端的正下方。由心肌的热烫和苏图之后增加左心房的大小决定适当缝合放置再被追平。

5.补丁安置和胶

1. 保持贴剂在37℃和5％CO ₂的条件下直至使用。
2. 轻轻抬起用平铲端补丁，轻轻把它放在心脏的表面上，在梗塞的部位。
   注意：为防止滑落左心室，这个补丁可以代替轻轻接触保持使用无论是压舌板或钳子尖举行。
3. 1比纤维蛋白原凝血酶：通过混合4准备胶水。通过重复的移液混合溶液，直至其开始变稠，通常在1分钟内制备开始后。
4. 一旦溶液粘度到达期望的水平，迅速转移约10毫升至贴片表面。注：纤维蛋白胶的凝固时间迅速，对胶水的有效转移提供机会的一个小窗口。

6.缝合

1. 用三到四个独立的间断缝合关闭肋层。
2. 肋间层的全封闭之前，插入PE-10套管插入切口撤离胸腔闭合后完成并重新建立正确的胸腔内的压力。
3. 关闭胸肌用三到四个独立的间断缝合。
4. 密封皮肤层用连续缝合。
5. 以下全封闭，附加1.0毫升注射器到所述套管的端部，并用它来撤离胸腔。
6. 应用组织粘合剂的切口部位加强缝合部位。

7.手术后治疗

1. 给小鼠注射丁丙诺啡（0.05-1.0毫克/千克）和卡洛芬（2.2毫克/千克）经皮下之前立即恢复冠状动脉结扎和至少20分钟以下的。管理这两种药物在手术后6-8小时，然后给每日两次，三天来控制疼痛和痛苦。
2. 连续监测动物直至意识和每隔一小时的前4个小时以下手术。进行第二次检查手术（2-4小时后）的夜间管理止痛的第二剂量。
3. 第二天继手术后每天监测动物，直到动物出现稳定。

心功能及组织学分析8

1. 对小鼠后4周的过程来确定继心肌梗塞损伤的程度进行echocardiographs。
2. 麻醉小鼠4-5％的异氟醚麻醉室吸入诱导麻醉范围内，然后2％经面罩异氟醚维持麻醉。
3. 清除成像区域用脱毛霜，并用一个小动物超声获得跳动的心脏的二维M型超声心动图扫描和记录功能参数ASSOciated它。
4. 安乐死的小鼠在二氧化碳室中，然后收集来自动物和地方的心在24小时的10％的福尔马林溶液中。 24小时后，将心转移到70％的乙醇，并保持在4℃直至组织处理。
5. 过程中的心，将它们嵌入石蜡块。
6. 切5毫米部分通过心脏的心室区域，开始在顶点，并在庭结束。
7. 染色切片与两个Masson三色和苏木精和使用标准协议伊红染色切片。

Representative Results

在外科手术过程中，左冠状动脉的结扎可以由标热烫闭塞动脉的下游来鉴定。作为结婚前一个测试，缝合线可以简单地拧紧，以检查它是否在适当的位置。此外，由于在动脉导致在左心房的适当敲打的能力几乎瞬间降低闭塞，左心房将放大响应于血液系统中的回流。

M型超声心动图测量，作为早在2天后梗死表现出停止左室壁运动的，表明肌肉重建。从数据做出定性的计算显示射血分数下降和心搏出量在心肌梗死后。在实验中，当收集用于组织学目的的心的终止，左心室的明确扩张可以看出，随着左心室变薄壁，和胶原蛋白的沉积，它表示疤痕组织沉积代替正常心肌细胞（ 图1）的。

也可见于组织学分析是水凝胶的存在构造由于纤维蛋白凝胶的施用（ 图2）。对于我们的目的，所述粘合剂系统必须足够粘，以允许精确定位控制和随后的径流减少到周围器官，但足够延展性不干扰心脏功能。初步试验以计算粘度，胶凝时间，和各种纤维蛋白原/凝血酶的比率的刚度，以便确定适合我们需要的适当的组合。进行体内分析，以测试的纤维蛋白胶，以保持跳线设置的能力到组织粘合，同时仍然允许充分的心脏功能（数据未显示）。应当指出的是，纤维蛋白胶没有损害心肌，就证明了升在现场组织重塑或心室变薄的ACK（ 图2）。心肌细胞保持完好，尽管除了这两个心脏修补和与之配套的胶水。此外，生存力测试证实，该纤维蛋白胶为小区包封水凝胶补片的外表面上的施用没有影响贴片内的细胞存活（ 图3）。

图1：在心脏功能减退结扎左冠状动脉结果作为衡量超声心动图 M型的健康（a）和梗塞（B）的心心动。心肌梗死后表现出明显的缺乏墙运动，其中活组织已被替换疤痕组织。这与相关的左心室射血分数下降可测量（EF），心脏搏量（SV）及心输出量（CO）。的健康（c）和梗塞（四）心脏组织学分析显示了左心室和梗死心肌左心室壁变薄，组织重塑和疤痕组织沉积的两个标志的扩张。组织学图像捕获左侧（较大的腔室）和右（更小的腔室）的脑室剖面切片。

图2：纤维蛋白烟道确保修补粘附的心脏应用的贴片被放置在心脏的表面上，而胸腔的过程中露出（a）中 。一旦放置，纤维蛋白基胶中加入对心脏的顶部，并使其干燥。该补丁可以清楚地看到的心脏组织的收集1周后的方法（b），该组织学切片。从组织学图像的心脏表面的补丁是分离的收集和切片工艺的神器。结果为8周的附着力的一致。

图3：纤维蛋白基胶不伤害组织封装细胞活力，MTT，通过分析每周测1次的纤维蛋白基胶使用中详细以前的出版物⁸所描述的协议给药后。贴剂内细胞的生存力没有影响通过加入胶水来构建体的表面上。

Discussion

用这种方法与鼠心肌梗死模型中，我们已经开发出一种系统，其最小化到与其它鼠心肌梗死技术相关的非心肌区域的损害。这些领域包括引起气管损伤，肌肉层的切割，并且肋的破损，以暴露胸腔。我们认为，这些变化改善整体手术结果由于采取保持尽可能多的主要结构的，包括肋和肌肉层，完整的外科手术过程中的照料。

应当指出的是，有一些限制该技术，其中最大的其费时性质，导致只有8-10充分的外科手术中的一天。为了克服这个，第二通气机可以使用，允许要在两种动物同时执行的过程。另外，主要的血管，如肋间血管和内饰胸廓内动脉，应在执行时，开胸手术可避免。如果邻近这些血管中的一个，一个cauterizer应该用来防止渗出由于破裂的动脉。

纤维蛋白胶是已知的在实验室和临床环境由于其能力，以在凝块形成快速帮助，以及它的潜力提供和主机的MSCs ^14-17,19。对于我们而言，纤维蛋白胶担任生物相容性办法秉承水性凝胶构建到心脏的表面。使用的纤维蛋白基胶已经证明是成功的，在保持水凝胶构建体在损伤部位长达8周，并有可能有更长的时间组织接触。使用该粘附系统允许控制为娇嫩构建体放置，而不需要该损害心肌以及构建本身附加缝线。我们已经发现，该胶液本身是无毒的封装细胞一第二不下层组织产生不利影响。水凝胶和纤维蛋白基胶系统可以适用于各种其它组织工程的目的是希望的细胞或治疗接触的时间延长的时间。此外，通过使用该SLA制造方法的，设计和结构可贴片内掺入到创建更复杂的系统，用于细胞递送^18。

一个挫折的使用的纤维蛋白基胶的事实是，一个以上的研究者必须存在期间贴剂放置和胶加成手术室。它是第一个研究员的工作，以确保补丁仍然存在，不会迷失在胸腔，而第二个研究人员的混合解决方案，它适用于补丁达到适当的粘度之后。为了优化胶水交付时间，因此建议在第二研究者还测试和时间之前贴片放置的胶的凝胶化，由于胶的适当胶凝是补丁粘附至关重要。

有很多的协议中的关键步骤和容易出错的区域，与第一个是心肌梗死的诱导。当务之急是要检查标志，如左心室壁的热烫和左心房的扩大，以确保左冠状动脉闭塞。这可以在加入的线圈通过简单地交叉并收紧缝合字符串的末尾进行。如果确定该左冠状动脉不会被缝合封闭的，该字符串可以取出并重新施加。第二个关键措施是继续监视插管在整个过程中，以确保它保持在气管内，并且不被拉出中期手术。最后，在整个手术中，所有应努力避免与肺接触，任何接触有导致塌陷肺的潜力。如果在手术过程中，肺塌陷时，简单地阻断intubator的流出管长达3秒，以试图重新膨胀肺部困扰的区域。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor - 3.5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB