Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera vävnadstekniska fartygs transplantat som är funktionella för ympning i möss genom att dubbel sådd delvis inducerade pluripotenta stamceller (PiPSC) - härrör glatta muskelceller och PiPSC - härledda endotelceller på en decellulariserad kärl klätterställning bioreaktor.
Introduction
Byggandet av vaskulära ledningar är en grundläggande strategi för kirurgisk reparation av skadade och skadade fartyg till följd av hjärt-kärlsjukdomar. Hittills transplantat material som används vid kirurgi inkluderar biokompatibla syntetiska polymerer (polytetrafluoretylen [Teflon], expanderad polytetrafluoretylen [ePTFE, Gore-Tex] eller polyetylentereftalat [Dacron]), allografter, autolog vävnad (hjärtsäcken eller saphenusvenen) och xenotransplantat en. Även konstgjorda transplantat (t.ex. Gore-Tex och Dacron) är vanligast, dessa material orsakar troligen många kort- och långsiktiga komplikationer som inkluderar stenos, kalcium nedfall, tromboembolism embolisering och infektioner. Även patienter med biologiska transplantat närvarande med minskad tromboemboliska händelser, de fortfarande stöter begränsningar som sekundärt misslyckande transplantat och förkortad livslängd på grund av förkalkning nedbrytning 2. Därför, trots betydande förbättringar i kirurgisk techniques under åren, forskare och kliniker fortfarande belastas med behovet av att identifiera den perfekta kanalen för kärlsjukdomar. På senare tid har forskningsfältet vaskulär vävnadsteknik genererat ett koncept där celler införlivas i biologiskt nedbrytbara ställningar, med målet att skapa en biomimetisk miljö som sammanfattar en funktionell kärl för lyckad ympning 1. I grund och framgången för de vaskulära konstruktioner beror på tre viktiga komponenter; celler som innehåller byggnadsställningen, dvs en endotelcell inre skikt och ett glatt muskelcellskikt, en byggnadsställning innehållande den lämpliga extracellulära matrisen för att tillhandahålla mekaniska egenskaper jämförbara med den nativa vaskulaturen, och molekyl / cellulär signalering som krävs för att initiera / reglerande reparation.
Långsiktig transplantat öppenhet och hållbar utveckling av de neo-vävnader är starkt beroende av en effektiv cellsådd av byggnadsställningar, thereby rendering beslutet av celltyp av kritisk betydelse. Flera rapporter demonstrera användningen av mogna endotelceller och glatta muskelceller från olika källor för att utveckla ledningar 3-6 med liten diameter. Även lovande, av bristen på tillräckliga autologa fartyg få mogna endotelceller och glatta muskelceller förblir en betydande belastning. På senare tid har stamceller från olika källor har utnyttjats för vaskulära vävnadstekniska tillämpningar. Faktum en mängd olika typer stamcells inklusive embryonala stamceller 7, inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, benmärg-härledda mononukleära celler 12, mesenkymala stamceller 13, endotelceller progenitorceller och vuxenkärlväggs härledd stamcellantigen-1 (Sca-1) + stam / progenitorceller 14,15 har alla visat sig vara kapabel att differentiering till antingen funktionell endotelceller eller glatta muskelceller som svar på definierade media ochodlingsbetingelser. Dessutom obegränsad självförnyelse kapacitet stamcellerna gör dem bättre kandidater till skillnad mogna endotelceller och glatta muskelceller som bara kan dela ett ändligt antal gånger innan de genomgick tillväxtstopp och åldrande.
Valet av byggnadsställningsmaterial för att generera framgångsrik vävnadsutvecklad kärl för ympning beror på flera faktorer, såsom biokompatibilitet, biomekaniska egenskaper, och graden av biologisk nedbrytning. I grund och botten material som används för att skapa byggnadsställningar för ympkvistar ska vara biologiskt nedbrytbara och kommer inte montera onödig mottagande immunsvar. Dessutom måste det omfatta en lämplig porositet och mikrostruktur för cellbindning och efterföljande överlevnad. Hittills de vanligaste materialen som används för byggnadsställningar i vaskulär vävnadsteknik omfattar polymerer av polyglykolsyra, polymjölksyra och poly ε-kaprolakton 16. På senare tid, decellulariserade biologiska material haräven tillämpats med viss framgång. Flera laboratorier har visat att sådd decellulariserad människa, hund eller svin fartyg med autologa celler som en biologisk transplantat som motstod koagulering och intimahyperplasi 17-19. Andra strategier i vaskulär vävnadsteknik inkluderar extracellulära matrixproteiner baserade kärltransplantat t.ex. sådd celler i fibringel 13 och genererar cellblad utan ställningsstöd 20, 21.
Det nuvarande protokollet visar differentieringen av humana PiPSC till funktionell endotel och glatta muskelceller, generering av en bioreaktor som består av en decellulariserad kärl scaffold att hysa funktionella PiPSC-härledda vaskulära celler, och ympning av vävnadstekniska kärlen i allvarlig kombinerad immunbrist (SCID ) möss. PiPSC är en optimal celltyp som ska användas för vävnadsteknik av fartygs transplantat eftersom dessa celler inte bildar tumörer hos möss eller höja etiska ochallo-immunresponser. Vidare har vi visat att strategin för att generera Pips-endotelceller och kärnor-glatta muskelceller är effektiv och reproducerbar 10,11. Därefter utformade vi en decellulariserad kärl för sådd av PiPSC-härledda vaskulära celler att noga efterliknar matrixproteiner som finns inom en infödd kärl, och därmed stärka ympning och överlevnad effekt. Dessutom decellularisering av fartygen före PiPSC sådd förhindrar uppkomsten av inflammatoriska svar monteras immuncelltyper såsom makrofager. Ännu viktigare, innebär detta protokoll inte bara utgör en metod för att generera lovande vaskulära ledningar för översättning till människor, men ger också värdefullt sätt att studera och förstå de molekylära mekanismer som styr kärlvävnadsregenerering genom musmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utför alla djurförsök enligt protokoll som godkänts av Institutional kommittén för användning och skötsel av försöksdjur.
1. Beredning av Kultur Media
- Gör odlingsmedier för human fibroblastcellinje CCL-153: F-12K Medium, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100 U / ml penicillin och streptomycin.
- Gör Omprogrammering Media for PiPSC generationen: Knockout Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 20% Knockout Serum Byte, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM Minimum Essential Medium (MEM) Icke-essentiella aminosyror, 10 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor 2 (bFGF-2) och 100 U / ml penicillin och streptomycin. Lägg bFGF-2 nyligen varje gång innan du använder mediet.
- Gör Differentiation media (DM) för att inducera glatt muskelcell (SMC) differentiering: α-MEM-medium innehållande 10% FBS, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 100 U / ml penicillin och streptomycin och 25 ng / ml Platelet Derived Growth Factor(PDGF-ββ).
- Gör Endothelial Differentiation Media (EG-DM) för att inducera endotelceller (EG) differentiering: Endothelial tillväxtmedia-2 (EGM-2) medium innehållande 50 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) och 100 U / ml penicillin och streptomycin.
2. programmera humanfibroblaster in Delvis-inducerade pluripotenta stamceller (PiPSC)
- Kultur human fibroblastcellinje CCL-153 på 0,04% -ig gelatinlösning belagda kolvar i odlingsmedium.
- Passage celler var 3 dagar i förhållandet 1: 6. Använd celler före passagen 9 för optimal effektivitet PiPSC generation. Celler är redo för transfektion på att nå 80-90% konfluens.
- Linjärisera polycistroniskt plasmid pCAG2LMKOSimO innehåller fyra omprogrammeringar faktorer oktamer bindande transkriptionsfaktor 4 (Oct4), Sox2, Kruppel-liknande faktor 4 (Klf4) och C-MYC (pCAG-OSKM). Digerera 5 | ag av plasmiden med 5 enheter av Pvul-restriktionsenzym för 3 h vid 37 ° C. Renaplasmiden med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll.
- Transfektera 2 x 10 6 humana fibroblaster med 4 pg av linjäriserade pCAG-OSKM plasmiden efter elektroporering med human dermal fibroblast (NHDF) nucleofection kit enligt tillverkarens protokoll. Utsäde Försiktigt transfekterade celler på pre- 0,04% gelatin belagda T25 kolv innehållande 5 ml förvärmda Omprogrammering Media.
- Efter 24 h, ändra medium med tillskott av 25 | ig / ml neomycin för att välja en ren population av transfekterade celler.
- Ändra medel varannan dag till dag 4.
Obs: Mänskliga fibroblaster blir PiPSC efter 4 dagars omprogrammering.
3. Differentiering av PiPSC in Endothelial och glatta muskelceller
- Seed PiPSC på kollagen IV förväg belagda skålar innehållande DM i 4 dagar för att inducera differentiering till SMC. Ändra medel varannan dag till dag 4.
- Seed PiPSC på kollagen IV förbelagda rätter containing endotel-DM för sex dagar för att inducera differentiering i endotelceller. Ändra medel varannan dag till dag 6.
4. decellulariserade Aorta Graft Framställning
Obs! Alla lösningar och utrustning bör vara sterila.
- Offra musen genom cervikal dislokation och fixera musen i liggande ställning enligt dissektionsmikroskop.
- Skär genom bröstbenet och runt bröstkorgen för att öppna brösthålan. Ta bort hjärta, lungor och matstrupe att exponera aorta. Ta försiktigt bort peri-aorta fett med pincett.
- Skär aorta från den främre änden med sax och försiktigt hålla änden med trubbiga pincett. Lossa aorta från ryggraden kolumnen bakom genom dissektion. Stäng försiktigt alla förgrenings artärer från aorta genom ligering med en bipolär electrocoagulator och sågar från bortre änden av ligering med en sax.
- Använd en 5 ml spruta för att spola aorta lumen med 3 ml saltlösning innehållande 100 U av heparin för att förhindra bildningen av blodproppar.
- Skär den bakre änden av aorta före den grenar in i njur. Att hålla integriteten av aorta är mycket viktigt under hela förfarandet.
- Spola aorta lumen med 5 ml 0,075% natriumdodecylsulfat (SDS) lösning utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Blöt bröstaortan i 0,075% SDS-lösning i en 10 cm petriskål. Placera petriskålen på en orbital skakapparat under 2 h vid 150 varv per minut vid RT.
- Spola aorta lumen med 5 ml PBS.
- Blöt aorta i PBS i en 10 cm petriskål. Placera petriskålen på orbitalskak under 2 h vid 150 varv per minut vid RT. Refresh PBS var 20 min.
- Spola aorta lumen med 5 ml PBS.
- Håll decellulariserade aortatransplantat i PBS vid 4 ° C i upp till en vecka.
5. Dubbla sådd av PiPSC och Bioreaktor Conditioning
Obs: All lösnings och utrustning bör vara steril. Utför all verksamhet i en vävnadskultur huva.
- Montera bioreaktorn flödeskretsen som visas i figur 1. Anslut inkubationskammare, media reservoar, peristaltisk pump och efterlevnad kammare med slang. Minimal volym medium som behövs för cirkulation är 40 ml.
- Pre-condition den decellulariserade kärlet med odlingsmedium genom att blöt aorta i DM-medium i en 10 cm petriskål. Placera petriskålen på orbitalskak under 1 h vid 50 rpm vid RT.
- Sätt 1 cm längd Nylon rören (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) i båda ändarna av decellulariserade fartyg under mikroskop. Knyt fartyget och rören med 8-0 silkessuturer.
- Montera den decellulariserade aortatransplantat i inkubationskammaren genom att ansluta nylonrören med inlopps- och utloppsportar (1/32 "slangar) från kammarväggen. Behåll inkubation kammare med 5 ml medium varje gång.
- Trypsinisera PiPSC genom tillsats förvärmdatrypsin att täcka kulturen skålen och försiktigt vicka skålen 10 gånger. Kasta trypsin och lämna skålen i inkubatorn 2 - 3 min. Lägg förvärmda odlingsmedium i skålen och blanda mediet med cellerna.
- Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera två alikvoter av cellsuspensionerna innehållande 5 x 10 5 celler vardera för 5 min vid 300 x g. Aspirera supernatanten helt.
- Efter aspire supernatanten helt, suspendera 1 pellet av Pips cellpellets i 50 ^ DM. Injicera denna cellsuspension i decellulariserade kärllumen.
- Därefter resuspendera andra PIPS cellpelleten i 100 | il av Matrigel. Försiktigt pipet blandningen på den decellulariserade aorta transplantat.
- Vänta 10-15 minuter tills blandningen övergår i ett gel-liknande tillstånd och jämnt sveper runt kärlets yttre yta. Fyll inkubationskammaren med DM.
- Placera hela bioreaktorn inställningen i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C. Rotera manuellt decellulariserad transplantatet 90 ° runt längdaxeln varje halvtimme i den första 2 tim.
- Håll statisk kultur för 12 timmar för att möjliggöra celladhesion.
- Deliver DM genom lumen av den peristaltiska pumpen för att inducera glatt muskelcelldifferentiering. Starta initial flödeshastighet vid 5 ml / min och stegvis ökning till 20 ml / min under 24 h.
- Håll cirkulationsmediet flödeshastigheten vid 20 ml / min under 24 h.
- Stoppa medieflödet och flytta bioreaktor fastställande av inkubatorn.
- Åter frö lumen transplantatet med PiPSC. Trypsinize, räkna och centrifugera 1 x 10 6 PiPSC som i steg 5,5-5,6. Resuspendera cellerna i 50 | il EGM-2-medium innehållande 50 ng / ml VEGF. Injicera cellblandningen in i lumen av transplantatet.
- Ändra mediet i inkubationskammaren och hela cirkulationen till EGM-2-medium innehållande 50 ng / ml VEGF att inducera endoteliala differentiering.
- Flytta bioreaktor inställningen tillbaka till the inkubator. Rotera manuellt transplantatet 90 ° var 30 min i första 2 timmar och sedan hålla en statisk kultur för 12 timmar.
- Börja cirkulerande flödet från 5 ml / min och stegvis öka till 35 ml / min. Håll flödeshastigheten vid 35 ml / min under 5 dagar. Ändra cirkulerande och kammarmediet varannan dag.
- Skörda konstruerad transplantat för ytterligare ympning till musen.
6. Nageldubbel seedade PiPSC Graft i möss
- Använd NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl hanmöss som kärl transplantatmottagare. Se alltid till att möss är ungefär 10 veckor gammal, väger ca 25-35 g, och är i goda hygienkrav.
- Bedöva mottagare mus genom administrering av en kombination av Hypnorm (25 mg / kg) och Hypnovel (25 mg / kg) intraperitonealt. Applicera vaselin oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Bekräfta effektiv anesthetization genom att se till att möss har avslappnade muskler och andas stadigt.
- Fäst musen i ryggläge med halsen rakades och utvidgas. Administrera atropinsulfat (1,7 mg / kg) i kombination med anestetika för att säkerställa att musen luftvägarna förblir klar.
- Förbered en mittlinjeincision från underkäken till bröstbenet på musen. Under ett dissektionsmikroskop med 5- till 10-faldig amplifiering, lyfter upp den högra spottkörtlar i sidled och ta rätt cleidomastoid muskeln för att exponera den högra gemensamma halsartären.
- Ta försiktigt bort bifogade vävnader för att mobilisera den högra gemensamma halsartären från den distala änden mot den proximala änden. Ligate mittdelen av den gemensamma halsartären två gånger med en 8-0 silkessutur och dissekera mellan de två banden.
- Passera genom en manschett gjord av autoklaverbar nylonröret i varje kärl änden och fäst varje ände med microhemostat klämmor.
- Avlägsna sutur slips i ena änden och en droppe av heparin (100 U / ml). Omedelbart efter, invertera den distala änden av the artär för att täcka hela manschetten kroppen och fixa den inverterade fartyg med en 8-0 silke sutur till manschetten.
- Upprepa samma procedur för att den andra delen av artären. Spola artär med koksaltlösning för att avlägsna blodproppar.
- Implantera en decellulariserad kärl transplantat mellan två ändar av den karotiska artären genom att skjuta den decellulariserade kärländarna av över artären manschetter och fixera den med 8-0 silkessuturer. Ta bort kärlklämmor från antingen slutar före utvärdera pulse av transplantatet.
- Lägg höger spottkörteln tillbaka till sitt ursprungliga läge. Stäng huden på den kirurgiska platsen med en avbruten sutur med användning av en 6-0 polyglaktin sutur.
- Konsekvent observera vitala tecken på musen efter ingreppet är klar, tills den återupptar medvetandet. Offra recipientmöss genom cervikal dislokation och skörd fartygstransplantat antingen 24 tim eller 3 veckor senare för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den framgångsrika generationen PiPSC bekräftades 4 dagar efter nucleofecting mänskliga fibroblaster med en linjäriserad pCAG2LMKOSimO plasmid som bär fyra transkriptionsfaktorer, Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc (OSKM). PiPSC visade en tydligt avskild fenotyp jämfört med fibroblaster (Figur 2A) och uttryckte de fyra omprogrammeringar faktorerna på mRNA (Figur 2B) och protein (figur 2C) nivåer 10. Effektiviteten av en PiPSC baserad kärlgraft är starkt beroende av förmågan hos PiPSC differentieras till både endoteliala och glatta muskelceller linjerna. Det är därför viktigt att bekräfta dessa egenskaper PiPSC in vitro genom att differentiera cellerna i definierade medier innan utnyttja dem för att generera fartygstransplantat. Figur 3 visar förmåga PiPSC att differentiera till funktionella endotelceller både genen (Figur 3A) och protein ( Figur 3B-D) levels, baserad på endotelceller specifika markörer 10. Likaså PiPSC har även möjlighet att differentieras till den glatta muskulaturen härstamning som svar på specifika medier (Figur 3E-H) 11.
Hela aorta decellularisering uppnåddes genom behandling med SDS, en anjonisk detergent som lyserar celler och solubiliserar cytoplasmatiska komponenter. Efter 2 h av behandling, föreföll den decellulariserade aortan som en genomskinlig acellulärt scaffold jämfört med en nyskördade aorta (fig 4A-B) 22. Histologisk utvärdering i fig 4C-F illustrerar avsaknaden av kärnor eller cytoplasmisk färgning i decellulariserade kärl, men inte i den normala musen aorta. Efter dubbel sådd av PiPSC-härledda endotelceller och glatta muskelceller inom decellulariserade aortor, de konstruerade vaskulära transplantat visar endotelceller och glatta muskelceller egenskaper respektive. Hematoxylin och eosin (HE) färgning av dubbel-seeded transplantat avslöjade en arkitektur som liknar den inhemska fartyg (Figur 4G) med flera lager av glatta muskelceller och ett monolager av endotelceller vilket bekräftas av positiv färgning för glatt muskulatur-22α (SM22), glatt muskulatur-α aktin (SMA) , CD31 och CD144 markörer respektive (figur 4H-M) 11.
För att bekräfta öppenheten hos de vävnadstekniska kärl in vivo, var de dubbla seeded PiPSC-härledda fartyg inympade i möss - både normal mus och decellulariserade artärer användes som kontroller. Efterföljande analys visade att medan möss ympade med decellulariserade fartyg som presenteras med markant högre dödlighet så tidigt som dag 1, PiPSC fartygs transplantat ges en överlevnad på 60% 3 veckor efter transplantation (Figur 5A) 11. Dessutom genomfördes tre veckor gamla PiPSC-härledda transplantat karakteriserats fullständigt med avseende på närvaron av humant PiPSC endotelial och glatta muskelceller och värd makrofaginfiltration (figur 5B och tabell 1) 11. Sammantaget indikerar resultaten att PiPSC har kapacitet att differentiera till både vaskulära härstamningar och är potenta för generering funktionella vävnadstekniska fartyg som kan ersätta nativa kärl in vivo.
Figur 1. Schematisk representation av den decellulariserade transplantat bioreaktorn flödeskrets. Den decellulariserade kärlet transplantat är monterad i inkubationskammaren. En peristaltisk pump är vid uppströms av inkubationen kammaren för att åstadkomma stabil medieperfusionshastighet flöde. Medierna tanken är den nedströms inkubationskammaren. Den följs Kammaren är att förbättra den ordning flödet. Flödesriktningen indikeras med pilar.large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Generering av PiPSC från humana fibroblaster. Mänskliga fibroblaster nucleofected med antingen fyra omprogrammering gener (Oct4, Sox2, Klf4 och C-MYC) eller en tom vektor (kontroll). (A) faskontrast bilder visar morfologin kärnor efter 4 dagar. PiPSC uttryckte alla fyra transkriptionsfaktorer, både på mRNA (B) och protein (C) nivåer. Skala bar för bilder som visas är 50 pm och data är medelvärden ± SEM (n = 3); * P <0,05, *** P <0,001. Denna siffra har modifierats Margariti, A. et al. 10 Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ A>
Figur 3. PiPSC kan differentiera till både endoteliala och glatta muskelceller. PiPSC eller kontrollceller differentieras till endotelceller. (A) I jämförelse med kontrollceller, PiPSC-härledda endotelceller uttryckte endotelceller specifika markörer såsom CD31, CD144, kinasinsättningsdomänreceptorn (KDR), endotelial kväveoxidsyntas (eNOS) och von Willebrand-faktor (vWF) på mRNA nivå. (B) Detta bekräftades på proteinnivå med hjälp western blot-analys. (C) immunofluorescensfärgning indikerade positiv färgning av CD144 (VE-cadherin) i PiPSC-endotel, men inte styra cellerna. (D) Flödescytometrisk analys bekräftade PiPSC-endotelceller uttryck av CD31 och CD144. Kollagen IV-seedade PiPSC (eller kontrollceller) var också differentieras inglatta muskelceller. (E, F) I motsats till kontrollceller, PiPSC-härledda glatta muskelceller uttryckte glatta muskelceller specifika markörer på gennivå, inklusive SMA, calponin, SM22, glatt muskulatur myosin tung kedja II (SMMHC), serumresponsfaktorn (SRF) , myocardin, smoothelin, elastin och kollagen 1A1. (G) De uttrycksnivåer av SMA, calponin och SM22 i PiPSC-härledda celler bekräftades med hjälp western blot-analys. (H) immunofluorescensfärgning använder konfokalmikroskopi visade en typisk glatt muskulatur markör färgning för calponin och SM22. Data representerar medelvärden ± SEM (n = 3); * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Skala bar för bilder som visas är 25 pm eller 50 pm. Dessa siffror har ändrats från Margariti, A. et al. 10 och Karamariti, E. et al. 11 Pleaseklicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Generation dubbel-seedade PiPSC-härledda vävnadstekniska kärlimplantat. (A, B) decellularisering av mus bröstaortan bevarat sin struktur och fortfarande liknade den hos en normal kärl, ursprunglig förstoring 2X. (CF) HE-färgning av decellulariserade aorta bekräftade lyckad decellularisering och fullständigt avlägsnande av celler vid jämförelse med kontroller, ursprunglig förstoring: 50X eller 200X. (G) HE-färgning av PiPSC-härledda endotelceller och glatta muskelceller dubbel sådda kärl avslöjade en arkitektur som liknade ett nativt kärl. (J, M) Dubbel-seeded PiPSC vävnadstekniska fartyg färgade positivt för endotelial (CD31 och CD144) och glatta muskelceller (SM22 och SMA) markörer skillnad decellularized kärltransplantat. (H, K) Samtidig expression av vaskulära markörer liksom den karakteristiska morfologi och lokalisering av PiPSC-härledda endotelceller och glatta muskelceller inom mediala och intimala områden var jämförbar med nativa fartyg. Skala bar för bilder som visas är 50 pm. Dessa siffror har ändrats från Tsai, T. et al. 22 och Karamariti, E. et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Dubbel seedade PiPSC-härledda vävnadstekniska kärltransplantat är patent för att ersätta inhemska fartyg in vivo. PiPSC-härledda fartyg inympade i halspulsådern av svår kombinerad immunbrist (SCID) möss, normal mouse och decellulariserade artärer användes som kontroller. (A) Analys av möss ympade med PiPSC-härledda fartyg visade 60% överlevnad 3 veckor efter operationen, medan möss ympade med decellulariserade fartyg som presenteras med markant högre dödlighet och lägre överlevnad (20%). Data representerar medelvärden (n = 10). (B) De vävnadstekniska fartyg också skörd 3 veckor efter ympning och utsattes för HE (vänster paneler) eller immunofluorescensfärgning (höger sida) för förekomst av humant CD144 och calponin eller mus CD11b / CD18 (Mac-1); kvantifiering av färgning sammanfattas i tabell 1. Original förstoring för bilder som visas är 400X om inget annat anges. Denna siffra har modifierats Karamariti, al. E. et 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Positiva celler Field (40X) | Konstruerad-kärl före ympning | Konstruerad-kärltransplantat (3 veckor) |
| calponin | 72 ± 9 | 22 ± 11 * |
| CD144 | 20 ± 8 | 5 ± 6 * |
| Mac-1 | 0 | 71 ± 11 * |
Tabell 1. Karakterisering av vävnadstekniska fartyg 3 veckor efter ympning. Antalet PiPSC-härledda endotelceller och glatta muskelceller och värdmakrofager kvantifierades efter immunofluorescensfärgning med human calponin, humant CD144 och mus Mac-1 respektive. Data representerar medelvärde ± SEM (n = 6); * P <0,05, signifikant skillnad från vävnadstekniska fartyg före ympning. Denna tabell har ändrats från Karamariti, E. et al. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande protokollet visar ett ljud, snabb, enkel, effektiv och reproducerbar strategi där funktionella vävnadstekniska fartyg kan genereras med PiPSC från humana fibroblaster. Denna teknik representerar ett värdefullt verktyg för regenerativ medicin, vävnadsteknik och potentiellt patientspecifik cellterapi inom den närmaste framtiden. Kritiska åtgärder för att säkerställa effektiviteten av protokollet inbegripa förberedelse av PiPSC, beredning av sterila och fullt decellulariserade aorta transplantat, framgångsrik sådd och differentiering av PiPSC i stöden och upprätthålla sterilitet aorta transplantat i kärl bioreaktorn.
För att initiera framgångsrika generationen av vävnadstekniska transplantat, är det av yttersta vikt att se till att beredningen av PiPSC utförs effektivt. Protokollet har framgångsrikt omprogrammerade en human fibroblast-cellinje in PiPSC via nucleofection med en pCAG2LMKOSimO OSKM plasmid. Den survival av fibroblaster efter nucleofection förlitar sig på flera viktiga punkter såsom användning av högkvalitativa OSKM plasmider, plasmider av koncentrationer som sträcker sig mellan 500 - 1.000 ng / l, undvika förseningar i sådd av fibroblaster omedelbart efter nucleofection som celler är särskilt känsliga efter införandet av relativt stora plasmider och slutligen tillägg av FGF-2, som är avgörande och bör läggas in i nylagade media strax före användning. Dessutom fann vi att det var viktigt att använda celler upp till passagen 9 för att undvika replika åldrande, för att garantera en effektiv "omprogrammering" i PiPSC och efterföljande differentiering till endotelceller och glatta muskelceller. Renheten hos PiPSC kan förbättras genom val av nucleofected celler med neomycin. Den pCAG2LMKOSimO plasmiden har en neomycin resistent gen och sålunda tillsats av neomycin i ett område av 25 | ig / ml en dag efter den nucleofection för 3 dagar kommer att resultera i valet av en ren population avPiPSC. Att konstruera en effektiv PiPSC kärl för ympning i möss, ansåg vi integriteten och sterilitet av de decellulariserade artärer vara av högsta prioritet. För att upprätthålla integritet artärer före och efter decellularisering, var det nödvändigt att ständigt tillämpa fingerfärdighet samtidigt hantera fartyg, som de var relativt ömtåliga och betydligt diminutiv i storlek. Den effektivt avlägsnande av perivaskulär vävnad och tätning av förgrenings artärer med hjälp av en bipolär elektro koagulator var avgörande för att säkerställa efterföljande kompetent cellsådd och för att undvika läckage av media. Vid någon punkt, såg vi att alla material och apparatur som används för att generera bioreaktorn (dvs pincett, rör, flaskor, kammare, saxar, adaptrar och kontakter) var autoklaverbar, vilket minskar risken för bakteriell kontamination och misslyckande av blodkärl före operation .
Medan det nuvarande protokollet har lovande kliniska tillämpningar inom hjärt diseALL, finns det några begränsningar som bör förbättras inom en snar framtid för att ytterligare förbättra metodiken. Hittills har de OSKM transkriptionsfaktorer införts i humana fibroblaster via nucleofection. Även om denna teknik är relativt enkel och okomplicerad, det resulterade också i variabla transfektionseffektiviteter vid olika experimentella tidpunkter. Notably, kan denna inkonsekvens vinnas genom att införa ett ytterligare steg av ovannämnda neomycin val. På samma sätt kan man överväga införandet av de fyra faktorer i humana fibroblaster använder lentivirus integration, vilket potentiellt kan öka effektiviteten i "omprogrammering" och förbättra överlevnaden av celler efter infektion. I termer av bioreaktorn, fann vi att en fullständig decellularisering av artärer kan uppnås med 0,075% SDS. Även om denna teknik ansågs vara optimala för avlägsnande cell jämfört med andra rengöringsmedel (t.ex. Triton X-100), kan det emellertid orsaka potential förändringar inom de ultra strukturerna hos de extracellulära matrisproteiner 23. Detta fenomen förtjänar därför effektivare decellularisering strategier för att minimera störningar i de tillhörande extracellulära matrixproteiner. Dessutom ansåg vi också att tjockleken diameter och vägg decellulariserade artärer varierar mellan möss, beroende på deras ålder, stam och bakgrund, och därmed orsaka potentiella skillnader i hastigheten på flödet och skjuvspänning inom bioreaktorer och fördelningen av PiPSC efter PiPSC sådd . Allt detta återstår att klargöras.
Detta protokoll beskrivs här generationen av funktionella vävnadstekniska transplantat använder PiPSC som håller en lovande potential för framtida kliniska tillämpningar inom stamcellsterapi för hjärt-kärlsjukdom. Denna process som utnyttjar direkt omprogrammering från en somatisk härstamning (fibroblaster) till en annan (antingen endotelceller eller glatta muskelceller) genom att hoppa pluripoensstämmelse kan vara ett sätt för att erhålla säkra och lämpliga celler av intresse. I själva verket har flera protokoll publicerats för att beskriva uppkomsten av stamcellslinjer från mänskliga embryon, iPS-celler och vuxna stamceller 24-26, som alla dock fortfarande väcker i frågor med avseende på deras användning i kliniken. Det är nu känt att PiPSC inte utvecklar teratom i SCID-möss, vilket eliminerar oro för tumörbildning. Dessutom cellerna tar betydligt kortare tid att generera, kultur och differentiera 10,11, och har visat sig generera framgångsrika och funktionella vävnadstekniska fartyg transplantat som är jämförbara med infödda artärer. Därför PiPSC närvarande som en lovande cellkälla för behandling av patienter som använder personlig cellterapi eftersom fibroblaster (t.ex. från huden) kan härledas från en specifik individ. Den decellularised kärlsystem i detta protokoll ger en mer biomimetisk modell som ger seedade celler med en extracellular matrixprotein som är mer representativ för den hos en infödd aorta 11. Dessa viktiga punkter är avgörande för att säkerställa överlevnaden, differentiering och funktionalitet sådda celler och vävnadstekniska fartyg därefter. Färsk studie från Sumitran-Holgersson och kollegor visade en lyckad återinsättning av en tidigare decellulariseras illiac ventransplantat från en avliden person före engraftment 27, vilket postulera ett translationell värde av det nuvarande protokollet till människor inom en snar framtid. Dessutom kan de decellulariserade kärltransplantat utgör en bra modell där kan bedömas roll och beteende av andra typer kärlcell som också bidrar till vävnadstekniska transplantat. Detta modellsystem i möss skulle kunna ge ett kraftfullt verktyg för framtida läkemedelsscreening och även att belysa de cellulära och molekylära mekanismer som är inblandade i vaskulär stamcellsbiologi. Sammantaget har det nuvarande protokollet lovande värde för dess tillämpning i Vaseular vävnadsteknik och ett genombrott i personlig medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
- Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
- Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y.
- Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
- Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
- Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).
- Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
- Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
- Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
- Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
- Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
- Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
- Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
- Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
- Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
- Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
- Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
- Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
- Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
- Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
