Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Zusammenfassung

Sowohl der Transkription und post-transkriptionelle Regulation haben einen großen Einfluss auf Gene Expression. Jedoch konzentrieren sich allgemein angenommen zellbasierten Screening-Assays auf der transkriptionellen Regulation, wobei im wesentlichen auf die Identifizierung von Promotor-Targeting-Moleküle ab. Dadurch werden posttranskriptionale Mechanismen weitgehend durch Genexpression gezielte Medikamentenentwicklung aufgedeckt. Hier beschreiben wir ein Assay auf Zellbasis bei der Untersuchung der Rolle von der 3'-untranslatierten Region (3 'UTR) in der Modulation des Schicksal der mRNA ist, sowie für die Identifizierung von Verbindungen in der Lage, ihn zu ändern. Der Test basiert auf der Verwendung eines Luziferase-Reporterkonstrukt, das die 3'-UTR des Gens von Interesse stabil in einer krankheitsrelevanten Zelllinie integriert basiert. Das Protokoll wird in zwei Teile aufgeteilt, wobei die anfängliche Konzentration auf der primären Screening auf die Identifizierung von Molekülen beeinflussen Luciferase-Aktivität nach 24 Stunden der Behandlung ab. Der zweite Teil des Protokollbeschreibt die Gegen Screening notwendig, Verbindungen modulieren Luciferase-Aktivität spezifisch durch die 3'-UTR diskriminieren. Neben dem detaillierten Protokoll und repräsentative Ergebnisse stellen wir wichtige Überlegungen über die Assay-Entwicklung und bei der Validierung des Treffers (en) des endogenen Ziel. Die beschriebene zellbasierten Reportergentest ermöglicht es den Wissenschaftlern, um Moleküle zu modulieren Protein-Ebene über posttranskriptionale Mechanismen abhängig von einer 3'-UTR identifizieren.

Einleitung

Für eine lange Zeit der Transkriptionsregulation der Genexpression wurde gedacht, eine wichtige, wenn nicht ausschließliche Rolle bei der Kontrolle der Proteinproduktion zu spielen. Immer mehr deutet jedoch an, dass nach der Transkriptionsregulation trägt so viel, wenn nicht mehr als, Transkriptionsregulation, zelluläre Proteinmenge ^1,2 zu bestimmen. Post-Transkriptionskontrolle der Genexpression ist viel komplexer und aufwendiger, als es auf den ersten Gedanken. In der Tat, alle verschiedenen Phasen der Post-Transkriptionskontrolle sind entstanden, um zu regeln, einschließlich mRNA-Prozessierung, Lokalisierung, Umsatz, Übersetzung ³ sowie die n....

Protokoll

HINWEIS: Der Durchsatz solcher Testsysteme hängt von der verfügbaren HTS Laborausrüstung. Dieses Protokoll wird von einem Tecan Freedom EVO 200 Roboter, der Liquid-Handling in 96-Well-Format führt erleichtert. Miniaturisierung zu 384-Well-Format ist ebenfalls möglich. Die Roboter-Liquid-Handling-System wird unter einer Steril um aseptischen Bedingungen in allen experimentellen Schritte halten positioniert. Wenn kein Liquid-Handling-Automatisierung zur Verfügung steht, kann das Protokoll leicht in Niedrigdurchsatzformat angepasst werden.

Primär Screening

1. Tag 1: Bereiten Sie und Samenzellen

Ergebnisse

Mit dem beschriebenen Ansatz, abgeschirmt wir eine 2.000-Substanzbibliothek für potentielle Modulatoren der posttranskriptionellen Kontrollmechanismen durch die 3'-UTR des Gens MYCN ausgeübt wird. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse des primären Screening von einer einzigen Bibliotheksplatte veranschaulicht. Luciferase-Signal in Prozent der mit Träger behandelten Kontrollen angezeigt, wurde bestimmt, indem die Luciferase-Aktivität in dreifacher Platten CHP134-mycn3UTR Zellen mit Verbindungen e.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen zellbasierten Reportergen-Assay, der auf die Identifizierung von Modulatoren abzielt, die auf 3'-UTR-abhängige posttranskriptionelle Prozesse abzielen. Es umfasst das primäre Screening und das Gegenscreening und kann bei Bedarf von einem Zytotoxizitätstest begleitet werden. Das Ergebnis des primären Screenings ist eine Reihe wertvoller Wirkstoffkandidaten, deren Reproduzierbarkeit und Spezifität im Gegenscreening weiter validiert wird.

Die Identifizierung prim.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kulturplatte 96 Well Weiß	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96 Well U Boden (Verdünnungsplatte)	PerkinElmer	6008190
100 ml Einweg-Trog für Reagenzien	Tecan	10 613 048
300 ml Einweg-Roboter-Reservoir	VWR	PB12001301
Roboterspitzen DITI 50  μ l Sterile	Tecan	30038607
Roboterspitzen DITI 200  μ l Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1,4 ml 2D mit Barcode, Röhrchen mit flachem Boden	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luziferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, ohne Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamin 200  mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (Compound Library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 Roboter	Tecan	N/A
Tecan F200 Multiplatten-Lesegerät	Tecan	N/A