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Medicine

के दृश्य Published: April 7, 2015 doi: 10.3791/52590
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The University of Texas Health Science Center at San Antonio

Abstract

Bacteremia दौरान स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया मायोकार्डियम में संवहनी अन्तःचूचुक भर सरकाना और असतत बैक्टीरिया से भरे सूक्ष्म घावों की वजह से प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ के अभाव के उल्लेखनीय हैं कि (microlesions) के रूप में कर सकते हैं। कारण cardiotoxic उत्पादों की उनकी रिहाई, एस के लिए microlesions भीतर निमोनिया अक्सर वयस्कों में फूटना आक्रामक न्यूमोकोकल रोग के दौरान मनाया जाता है कि दिल की विफलता के लिए योगदान करने के लिए लगा रहे हैं। इस के साथ साथ 30 घंटा के भीतर हृदय microlesion गठन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए जाता है कि प्रयोगात्मक माउस संक्रमण के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाता है। निर्देश hematoxylin और दाग दिल वर्गों और जल्दी और देर microlesions के बीच रूपात्मक भेद eosin में microlesion पहचान पर प्रदान की जाती है डाला जाता है। निर्देश एस के सत्यापन के लिए एक प्रोटोकॉल पर प्रदान की जाती है न्यूमोकोकल सम्पुटी polysaccharide और के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग microlesions भीतर निमोनियाImmunofluorescent माइक्रोस्कोपी। पिछले है, संक्रमित चूहों और पता लगाने और स्वास्थ्य लाभ चूहों के दिलों में निशान गठन के आकलन के लिए बचाता है कि एंटीबायोटिक हस्तक्षेप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है। साथ में, इन प्रोटोकॉल एस से संपर्क का एक परिणाम के रूप में न्यूमोकोकल हृदय आक्रमण, cardiomyocyte मौत, हृदय remodeling के अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच की सुविधा होगी निमोनिया, और दिल में pneumococci के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया।

Introduction

समुदाय उपार्जित निमोनिया (कैप) के लिए वयस्कों के अस्पताल में भर्ती मृत्यु दर 1-4 के लिए योगदान देता है कि प्रतिकूल हृदय की घटनाओं के लिए एक दस्तावेज जोखिम वहन करती है। Corrales-मदीना एट अल द्वारा हाल ही में एक अध्ययन में। कार्डियक जटिलताओं के साथ और / या जिम्मेदार निमोनिया से जुड़े लोगों की मृत्यु तीन के 27% के लिए जुड़ा पाया गया। स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus), टोपी और पूति 5 का सबसे आम कारण, सीधे भर्ती कराया वयस्क रोगियों 6 के रूप में कई के रूप में 19% में प्रतिकूल हृदय की घटनाओं के साथ संबद्ध किया गया है। निमोनिया के साथ जुड़े प्रतिकूल हृदय की घटनाओं की आवृत्ति 6 घटते के क्रम में नए या बदतर congestive दिल विफलता, अतालता, और रोधगलन शामिल हैं।

ब्राउन एट अल द्वारा हाल ही में एक PLoS रोगज़नक़ों लेख में।, एस निमोनिया myocardiu में हृदय संवहनी अन्तःचूचुक, प्रविष्टि के माध्यम से स्थानान्तरण करने में सक्षम होना पाया गयामी, और आक्रामक न्यूमोकोकल रोग (आईपीडी) 7 दौरान निलय में बैक्टीरिया से भर असतत गैर पीबयुक्त सूक्ष्म घावों (microlesions) के गठन। हृदय microlesion गठन के साक्ष्य न्यूमोकोकल संक्रमण के आगे घुटने टेक दिए थे जो गैर मानव प्राइमेट और व्यक्तियों से हृदय नमूनों में मनाया गया। इसी तरह, प्रयोगात्मक संक्रमित चूहों reproducibly हृदय microlesions विकसित की है। चूहों में, microlesion आकार और संख्या सकारात्मक अवधि और bacteremia, सीरा में कार्डियक ट्रोपोनिन के स्तर की गंभीरता, और न्यायपालिका हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ सहसंबद्ध किया गया था। दिल में बैक्टीरियल स्थानान्तरण रक्त मस्तिष्क बाधा और न्यूमोकोकल दिमागी बुखार के विकास, एक Laminin रिसेप्टर और प्लेटलेट में संवहनी endothelial कोशिकाओं की यानी, Choline बाध्यकारी प्रोटीन एक मध्यस्थता आक्रमण भर pneumococcus के स्थानान्तरण के लिए जिम्मेदार एक ही तंत्र के माध्यम से हो पाया था -activating कारक रिसेप्टर निर्भर तरीके 8। Microlesआयन गठन भी cardiomyocytes 7 को मारने के लिए पाया गया था कि न्यूमोकोकल ताकना गठन विष pneumolysin की आवश्यकता है।

न्यूमोकोकल हृदय microlesions स्ताफ्य्लोकोच्चुस सहित अन्य ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की वजह से कर रहे हैं कि पीबयुक्त नरम ऊतक और हृदय फोड़े से अलग कर रहे हैं। ये न्यूट्रोफिल और आतंच बयान 9,10 से घिरा हुआ बैक्टीरिया की एक भी foci की विशेषता है। Microlesions एस द्वारा गठित निमोनिया एक प्रभावित दिल भर में वितरित आकार में छोटे होते हैं, और प्रतिरक्षा सेल पैठ की कमी है। संक्रमण के प्रारंभिक चरण के दौरान, microlesions एस की वजह से निमोनिया कार्डियोमायोपैथी के रोग लक्षण की याद ताजा क्षतिग्रस्त या सूजन के ऊतकों के क्षेत्रों के रूप में दिखाई देते हैं। कुछ monocytes लेकिन उनकी उपस्थिति कम रहता है और घावों तेजी से एक साथ जीआर करने के लिए जारी है, जबकि उपस्थिति में परिगलित हो जाते हैं और बैक्टीरिया से भरा है, इस समय के दौरान देखा जा सकता हैजानवर या रोगाणुरोधी हस्तक्षेप की मृत्यु तक के आकार में ओउ। महत्वपूर्ण बात है, एंटीबायोटिक हस्तक्षेप के 3 दिन के भीतर, विपुल प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ पूर्व घाव स्थल पर मनाया जाता है और इस मजबूत कोलेजन बयान के साथ है। इसी प्रकार के हृदय remodeling के हृदय समारोह 11-15 पर परिणामों को स्थायी के साथ रोधगलन निम्नलिखित घटित करने के लिए सूचित किया गया है। इस प्रकार, microlesions रोग प्रकरण बच गया है जो स्वास्थ्य लाभ व्यक्तियों में हृदय संबंधी मृत्यु दर की वृद्धि हुई घटना आइपीडी के दौरान और संभवतः होती है कि प्रतिकूल हृदय की घटनाओं के लिए एक संभावित व्याख्या कर रहे हैं।

इस के साथ साथ, अनुदेश संक्रमण के जल्दी और देर चरणों में आइपीडी और हृदय घाव गठन और हृदय microlesions के दृश्य का प्रायोगिक माउस मॉडल पर प्रदान की जाती है। रोगाणुरोधी हस्तक्षेप से बचा लिया गया है कि पशुओं में कोलेजन बयान का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाता है। इस अनुच्छेद के लक्ष्य एफ करने के लिए हैइस महत्वपूर्ण और उपन्यास न्यूमोकोकल विकृति पर अन्य जांचकर्ताओं के अनुसंधान acilitate।

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Protocol

नोट: सभी माउस प्रयोगों की समीक्षा की और सैन एंटोनियो में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल # 13032-34-01C) में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया। पशु की देखभाल और पब्लिक लॉ 89-544 (पशु कल्याण अधिनियम) और उसके संशोधनों, सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवाओं के दिशा निर्देशों, और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड (स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग के अमेरिका) का पालन प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल।

1. संक्रमण

  1. उम्र के 10-12 सप्ताह की उम्र के बीच दोनों लिंगों के BALB / ग चूहों प्राप्त करते हैं।
    टिप्पणियाँ. निमोनिया सीरोटाइप चार तनाव TIGR4 16 अनुक्रम किया गया है कि एक विषमय नैदानिक ​​अलग है।
  2. एक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) 0.5 से 620 तक पहुँचने तक 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर टोड-हेविट शोरबा में TIGR4 बढ़ो (1.0 एक्स 10 8 कॉलोनी बनाने इकाइयों [CFU] / मिलीलीटर करने के लिए इसी)। 3 पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा न्यूमोकोकल संस्कृति गोली, 500 XG और एक निर्वात लाइन का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटा दें। निलंबित और 1.0 एक्स 10 4 CFU / एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ बैक्टीरिया पतला।
  3. एक प्रेरण कक्ष का उपयोग करना, ऑक्सीजन में 2.5% वाष्पीकृत isoflurane के साथ चूहों anesthetize। कुंद चिमटी के साथ कोमल पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा anesthetized राज्य की पुष्टि करें।
    1. एक हाथ से अपनी कूड़ा द्वारा anesthetized माउस पकड़ और ईमानदार, एस के 100 μl के साथ प्रत्येक माउस intraperitoneally (आईपी) इंजेक्षन (1.0 एक्स 10 3 CFU की एक चुनौती खुराक के लिए इसी) एक 27-30 गेज सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग निमोनिया निलंबन। अपने पिंजरे में माउस वापस जगह है। चूहे आम तौर पर इंजेक्शन के बाद 30-40 सेकंड जगाने।
  4. संक्रमण कम से कम (प्रारंभिक) 24 या 30 (उन्नत) घंटा के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति दें।
    1. सीओ 2 asphyxiation द्वारा चूहों euthanize। माउस सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करना मृतक की है। इच्छामृत्यु आगे हटाने से इसकी पुष्टि की हैकदम 1.6 में दिल की।
  5. एक शराब झाड़ू के साथ पूंछ को शुद्ध करना और एक 2-3 मिमी अनुभाग धज्जी। खून की 2 μl लीजिए और क्रमानुसार सोडियम हेपरिन एक यू / मिलीलीटर पांच बार युक्त पीबीएस में रक्त 10 गुना पतला। प्लेट धारावाहिक एक tryptic सोया रक्त अगर प्लेट पर dilutions और कॉलोनी से अगले दिन एक्सट्रपलेशन bacteremia के स्तर मायने रखता सीओ 2. 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  6. एक शल्य चिकित्सा मंच पर एक लापरवाह स्थिति में माउस स्थिर। 70% इथेनॉल और पैट सूखे के साथ सीने में स्प्रे। शल्य कैंची और संदंश छाती गुहा को खोलने का प्रयोग, रिब पिंजरे हटाने, और हृदय और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए डायाफ्राम आड़ा काट। का प्रयोग कैंची दिल से जुड़ा रक्त वाहिकाओं में कटौती और धीरे संदंश के साथ चोट से बचने के लिए सावधानी से दिल आबकारी।
  7. पीबीएस के साथ दिल कुल्ला और फिर राज्याभिषेक वर्गों ऊतक सेक्शनिंग के दौरान प्राप्त किया जाएगा कि इस तरह के ऊतक नमूना संग्रह कैसेट में जगह है। आयल एम्बेडिंग, पीएलए के लिएआयल embedding के लिए भेजने के लिए 10% बफर-formalin समाधान और अगले दिन में कैसेट सीई।
    1. वैकल्पिक रूप से सूखी बर्फ पर रखा गया है कि एक cryomold भीतर अक्टूबर यौगिक का उपयोग फ्लैश फ्रीज।

कार्डिएक घावों और घावों के भीतर Pneumococci 2. दृश्य

  1. दिल की चार कक्षों प्रत्येक ऊतक अनुभाग में दिखाई दे रहे हैं कि इस तरह के आयल एम्बेडेड दिल वर्गों में कटौती। 5 माइक्रोन की मोटाई पर स्लाइड काटें।
  2. मानक तरीकों 17 का उपयोग कर hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ Deparaffinize और दाग स्लाइड।
  3. आवर्धन: देखें एच एंड ई कम (100x, 200X) और उच्च (400X, 1,000X तेल विसर्जन) में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग हृदय वर्गों दाग। मायोकार्डियम में microlesions की उपस्थिति के लिए दिल की विशेषताएँ। इधर, एक 100X 1.3 संख्यात्मक एपर्चर प्लान-NEOFLUAR उद्देश्य से लैस एक Zeiss Axioskop दो माइक्रोस्कोप का उपयोग एच एंड ई छवियों के अधिग्रहण।
    नोट: जल्दी हृदय एल चरणोंesions प्रतिरक्षा कोशिकाओं monocytes होना दिखाई देते हैं क्या (monocytes और granulocytes) की उपस्थिति में उनके अंतर रंगीन उपस्थिति से और कुछ मामलों में भेदभाव कर रहे हैं। विशेष रूप से उन 30 घंटा में देखा उन्नत घावों में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं अनुपस्थित और बड़े रिक्तिका-तरह के घावों को उनकी जगह में मनाया जाता हैं। यह हृदय घाव विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान प्रतिरक्षा सेल आमद हो सकता है, जबकि यह एक आवश्यकता प्रतीत नहीं होता है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है।

Microlesions भीतर Pneumococci के लिए 3. Immunofluorescent माइक्रोस्कोपी

  1. सकारात्मक आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर 5 माइक्रोन और जगह वर्गों की मोटाई के लिए सूक्ष्म साथ cryomolds में धारा दिल। जमे हुए हृदय वर्गों पिघलना और शुष्क हवा की अनुमति दें। (25 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 6.8-7.2) 10 मिनट से 10% में तटस्थ बफर formalin के लिए वर्गों को ठीक करें।
  2. फिर पीबीएस में फिर से धोने, पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 में 15 मिनट के लिए permeabilize, 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड्स (3x) धो लें।
  3. ब्लॉक ऊतक secti 1 घंटे के लिए पीबीएस में 10% बकरी सीरम के साथ स्लाइड्स पर पर।
  4. पीबीएस, कवर के साथ स्लाइड कुल्ला और एक पर खरगोश विरोधी सीरोटाइप 4 pneumococcus सीरमरोधी साथ हृदय वर्गों सेते: 1,000 पीबीएस में 10% बकरी सीरम के साथ दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण के लिए जांचकर्ताओं अनुभवहीन खरगोश सीरमरोधी का उपयोग करना चाहिए
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2000: 1 में बकरी विरोधी खरगोश FITC संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ 10% बकरी सीरम पीबीएस के साथ वर्गों पीबीएस, कवर के साथ धोने और सेते के बाद।
  6. निर्माता के अनुदेश के बाद, यूकेरियोटिक नाभिक के दृश्य के लिए 5 मिलीग्राम / एमएल पर DAPI (4 ', 6- diamidino-2-phenylindole) का उपयोग करें। धो और FluorSave साथ ऊतक वर्गों माउंट।
  7. निम्न और उच्च दोनों बढ़ाई पर एक confocal खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग फ्लोरोसेंट छवियों मोल। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए तदनुसार संख्यात्मक एपर्चर समायोजित करें। इधर, एक 60X 1.42 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य के साथ एक confocal प्रणाली का उपयोग फ्लोरोसेंट छवियों के अधिग्रहण।
सेप्टिक चूहे की "> 4। एंटीबायोटिक बचाव

  1. पहले से चरण 1 में संकेत के रूप में TIGR4 की 1.0 एक्स 10 3 CFU के साथ चूहों संक्रमित आईपी के साथ शुरू करो।
  2. 30 घंटा के बाद संक्रमण में शुरू हुए 36 घंटे के लिए 100 μl खारा में हर 12 घंटा दवा ग्रेड एम्पीसिलीन आईपी (80 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) प्रशासन। आयल embedding और ऊतक, सेक्शनिंग के लिए कदम 1.6 में वर्णित के रूप में वांछित समय बिंदु है और इस प्रक्रिया में दिल ले लीजिए।

5. कोलेजन बयान जांच

  1. मानक तरीकों 17 का उपयोग कर विआयनीकृत पानी, deparaffinize और हाइड्रेट ऊतक वर्गों के साथ xylene और श्रेणीबद्ध शराब washes के उपयोग करना। 5 मिनट के लिए जलीय 0.2% phosphomolybdic एसिड के साथ वर्गों को समझो और 5 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी से कुल्ला।
  2. कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए Picric एसिड में 0.1% सीरियस लाल के साथ दाग वर्गों।
  3. 3 मिनट के लिए 0.01 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड में वर्गों धो लें और 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग कुल्ला।
  4. Dehydraसमान का उपयोग कर वर्गों ते लेकिन 5.1 में उल्लिखित है कि करने के लिए washes के आदेश रिवर्स, xylene बढ़ाने में कार्डियक वर्गों निर्जलीकरण और फिर इथेनॉल की सांद्रता का दर्जा दिया गया।
  5. सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए एक बढ़ते समाधान के साथ माउंट ऊतक वर्गों।
  6. कोलेजन बयान के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कम और उच्च वृद्धि के तहत गहरी पढ़ें धुंधला के क्षेत्रों के लिए दाग ऊतक वर्गों की जांच। लाल है कि दिल की निलय भीतर किसी भी क्षेत्र कोलेजन जमा किया गया है, जहां एक क्षेत्र है। इस लाल दाग के बिना क्षेत्रों कोलेजन बयान कमी स्वस्थ ऊतकों की साइटों रहे हैं। इस के साथ साथ, एक 20X 0.5 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य से लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग Picro सीरियस लाल दाग छवियों के अधिग्रहण।
    नोट: स्वस्थ ऊतकों में लाल आलिंद दाग।

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Representative Results

एच एंड ई द्वारा Microlesions के दृश्य

कार्डिएक microlesions 1 चित्रा। TIGR4 साथ अपने आईपी चुनौती निम्नलिखित आइपीडी साथ चूहों से हृदय वर्गों दाग एच एंड ई के निलय में मनाया hematoxylin की अधिक से अधिक संख्या के साथ 24 और 30 घंटा के बाद संक्रमण (HPI), के बीच इन घावों के आकार में वृद्धि को दर्शाता गया घाव के भीतर दिखाई दे -stained (यानी, बैंगनी, नीला) pneumococci। Microlesions एक रिक्तिका की तरह आकृति विज्ञान, सघन eosin (लाल) घाव साइट के लिए तुरंत आसन्न कोशिकाओं में cardiomyocytes की धुंधला, घावों के भीतर diplococci, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक सामान्य अभाव की विशेषता थे। लगभग आधे घावों दिखाई दे रक्त वाहिकाओं के निकट थे। HPI 24 और 30 के बीच microlesions अधिक कई और काफी बड़ा हो गया। 30 HPI में कोशिकी बैक्टीरिया अक्सर कोशिकाओं के बीच एक घाव से स्ट्रीमिंग देखा जा सकता है।

Visualizatiएस के पर निमोनिया Immunofluorescent माइक्रोस्कोपी का उपयोग

कल्पना और पुष्टि करें कि एस निमोनिया के घावों के भीतर वास्तव में थे, TIGR4 द्वारा निर्मित है कि सीरोटाइप 4 सम्पुटी पोलीसेकेराइड (चित्रा 2) के लिए immunofluorescent धुंधला इस्तेमाल किया गया था। कब्जा कर लिया छवियों एस के कसकर बांध और घने समुच्चय की मौजूदगी से पता चला microlesion साइटों के भीतर निमोनिया।

कार्डिएक scarring के साक्ष्य

Picro सीरियस लाल धुंधला एम्पीसिलीन और असंक्रमित नियंत्रण के साथ बचाया गया था कि चूहों से हृदय वर्गों पर प्रदर्शन किया गया था। एंटीबायोटिक बचाया स्वास्थ्य लाभ चूहों में, निलय (चित्रा 3) में पूर्व घाव साइटों होना दिखाई देते हैं क्या से स्ट्रीमिंग बैंड के साथ Picro सीरियस लाल दाग की उपस्थिति और तीव्रता में एक नाटकीय वृद्धि हुई थी। इसके विपरीत, नियंत्रण वर्गों में निलय कोलेजन बयान अनुपस्थित था यह दर्शाता है कि बेदाग गया (नहीं दिखाया)।

एक साथ इन परिणामों गंभीर आइपीडी के साथ चूहों में हृदय microlesions कल्पना करने के लिए और मानक ऊतकीय प्रक्रियाओं का उपयोग निलय में परिणामी निशान गठन उपयोग करने की क्षमता प्रदर्शित करता है। महत्वपूर्ण बात है, हृदय microlesions सदा ही एस के उच्च titers से जुड़े होते हैं निमोनिया और समय उनके गठन मध्यस्थता करने की जरूरत है।

चित्र 1
चित्रा 1: एच एंड ई दाग हृदय वर्गों में microlesions की जांच 24 होर और 30 घंटा के बाद संक्रमण पर मनाया हृदय microlesions के प्रतिनिधि छवियों (1,000X)।। काला पैमाने सलाखों 10 माइक्रोन के अनुरूप हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: एस के Immunofluorescent का पता लगाने हृदय microlesions भीतर निमोनिया। सीरोटाइप 4 सम्पुटी पोलीसेकेराइड (हरा) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग Immunofluorescent माइक्रोस्कोपी एस की उपस्थिति की पुष्टि की हृदय microlesions भीतर निमोनिया। नाभिक DAPI के साथ नीले रंग के दाग थे। व्हाइट पैमाने बार 20 माइक्रोन के अनुरूप हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक स्वास्थ्य लाभ माउस में एक पूर्व हृदय microlesion स्थल पर कोलेजन बयान प्रतिनिधि छवि (200X) एक Picro सीरियस रेड 5 दिनों में के लिए एंटीबायोटिक के हस्तक्षेप के बाद एक माउस के निलय में कार्डियक microlesion दाग दिखा।vasive न्यूमोकोकल रोग। लाल कोलेजन बयान इंगित करता है। काला पैमाने बार 20 माइक्रोन के अनुरूप हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस रिपोर्ट में, एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि एस प्रेरित करने के लिए निमोनिया आइपीडी दौरान चूहों में हृदय microlesions मध्यस्थता और उनके दृश्य के लिए तकनीक का प्रदर्शन किया जाता है। चूहे मानव पूति के दौरान होता है, और मायोकार्डियम में अंतिम बैक्टीरियल स्थानान्तरण की ओर जाता है, जो कि इसी तरह उच्च ग्रेड bacteremia, के लिए अग्रणी निकासी के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की दहलीज पार कर जाने वाले बैक्टीरिया की एक खुराक से संक्रमित हैं। एस, अभी तक अज्ञात कारणों के लिए दिल में निमोनिया मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से व्याकुल दोहराने में सक्षम है। यह चल रही जांच का विषय है और इस प्रकाशन भाग लेने के लिए उनके प्रयासों में अन्य जांचकर्ताओं सुविधा हो सकती है।

एच एंड ई धुंधला हृदय microlesions और गहरे बैंगनी दाग ​​नीले रंग के भीतर बैक्टीरिया, जबकि cardiomyocytes दाग गुलाबी के बाद से लाल करने के लिए मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग microlesion दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस तेज विपरीत आसान detecti सक्षम बनाता हैसंक्रमण के बाद के चरणों में microlesions की पर घावों बड़े होते हैं जब। एस की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए निमोनिया हृदय microlesions भीतर, TIGR4 द्वारा किया जाता है कि सीरोटाइप 4 सम्पुटी पोलीसेकेराइड के खिलाफ सीरमरोधी का उपयोग कर Immunofluorescent माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन किया था। महत्वपूर्ण बात है, इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि विशिष्ट विरोधी सम्पुटी एंटीबॉडी प्रयोगात्मक चुनौती के लिए प्रयोग किया जाता है कि न्यूमोकोकल तनाव की सीरोटाइप पर निर्भर करता है। वैकल्पिक रूप से, जांचकर्ताओं को भी, pneumolysin के खिलाफ एस के रोमकूप के गठन विष व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर सकते हैं निमोनिया, या न्यूमोकोकल सेल की दीवार के उस का पता लगाने के घटकों (यानी, TEPC-15)। इन एंटीबॉडी दिल के भीतर pneumococci का पता लगाने जबकि, पिछले अनुभव सम्पुटी पोलीसेकेराइड खिलाफ एंटीबॉडी सबसे सम्मोहक छवियों 7 प्रदान करते हैं कि पता चलता है।

एस निमोनिया मध्यस्थता हृदय microlesion गठन की बातचीत की आवश्यकता हैसेल 7,8 के माध्यम से संवहनी endothelial कोशिकाओं और बैक्टीरिया स्थानांतरगमन के लिए मेजबान प्लेटलेट को सक्रिय कारक रिसेप्टर के साथ बैक्टीरिया कोशिका दीवार phosphorylcholine की बातचीत करने के लिए जीवाणु आसंजन के लिए मेजबान प्रोटीन Laminin रिसेप्टर के साथ प्रोटीन एक बाध्यकारी न्यूमोकोकल adhesin Choline। यह microlesion गठन कसकर इन मुलाकातों की आवृत्ति और अवधि बढ़ जाती है और विकसित करने के लिए बैक्टीरिया को दोहराने और दिखाई घावों के लिए समय की अनुमति देता है जो संक्रामक बोझ और समय, से जुड़ा हुआ है कि नोट करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। हम पहले से निर्धारित है एस के एक आईपी संक्रामक खुराक से अधिक 1.0 एक्स 10 3 CFU कि निमोनिया तनाव TIGR4 माउस का भी तेजी से मृत्यु में और एक परिणाम के गरीब घाव गठन के रूप में यह परिणाम है। इस संक्रामक खुराक सहज निकासी कुछ चूहों में और दूसरों में होता है नीचे गंभीर बीमारी की देरी शुरुआत में मनाया जाता है। फिर भी 24 के बीच TIGR4 की 1.0 एक्स 10 3 CFU और 36 घंटा के साथ चुनौती दी चूहों के लिए,घावों तेजी संख्या में जमा और माउस मरणासन्न हो जाता है जब तक लगातार आकार में बड़े होते हैं। इस प्रकार, को संक्रमित तनाव की संक्रामक खुराक एक मरणासन्न राज्य कोई कम से कम 30 HPI में विकसित करने के साथ बीमारी की एक ऐसी ही राज्य को दोहराने के लिए titrated किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात है, हम बार बार TIGR4 की 1.0 एक्स 10 5 CFU के साथ intratracheally 1.0 10 x 7 CFU के साथ intranasal संक्रमित थे और कि चूहों में हृदय घाव गठन मनाया है। गंभीर बीमारी के इन चुनौती मार्गों विकास के बाद बाद में समय अंक पर हुई। हम भी एस के अन्य विषमय उपभेदों के साथ microlesion गठन मनाया निमोनिया, ऐसे सीरोटाइप दो अलग D39 के रूप में, विभिन्न आवृत्तियों पर यद्यपि। इस प्रकार, घावों TIGR4 करने के लिए आईपी संक्रमण मार्ग या विशिष्ट का एक परिणाम नहीं कर रहे हैं, लेकिन इसके बजाय रोग प्रकरण की अवधि और तीव्रता से बंधा। इस के साथ साथ हम इस चुनौती का मार्ग reproducibility के उच्चतम डिग्री प्रदान करता है क्योंकि चूहों आईपी संक्रमित करने के लिए सलाह। एक रचनाकार हैंएस के erent तनाव जांचकर्ताओं कम से कम 24 घंटे के लिए रक्त की> 10 5 CFU मिलीलीटर स्तरों पर bacteremia लिए उद्देश्य होना चाहिए, निमोनिया प्रयोग किया जाता है या एक अलग संक्रामक मार्ग वांछित है।

रोगाणुरोधी हस्तक्षेप इंटेंसिव केयर यूनिट स्थापित करने में एक मानव मॉडलिंग स्वास्थ्य लाभ के दौरान घटित घटनाओं है कि, के अध्ययन की अनुमति देता है। यह नहीं है कि सभी चूहों रोगाणुरोधी उपचार के बावजूद जीवित है और बैक्टीरियल निकासी की पुष्टि की है कि ध्यान देने योग्य है। जांचकर्ता 50-60% के बीच और जानवरों के नुकसान के साथ सौदा करने के लिए तदनुसार पलटन आकार को समायोजित करना चाहिए जैसे जीवित रहने की दरों की उम्मीद करनी चाहिए। 24 घंटे के बाद जानवरों की नियमित निगरानी अत्यधिक संस्थागत पशु प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी साथ अनुपालन सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है। Picro सीरियस लाल धुंधला कोलेजन बयान कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक सरल और मानक तकनीक है। इस के साथ साथ, यह इस दाग एक दर्दनाक infectiou निम्नलिखित दिल की निलय में कार्डियक remodeling के जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शन किया हैप्रकरण। Picro सीरियस लाल, क्योंकि यह जमा कोलेजन और आसपास के ऊतकों के बीच की पेशकश की तेज विपरीत की, इस तरह के "मैसन का Trichrome दाग 'के रूप में, कोलेजन बयान कल्पना करने के लिए अन्य आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक पर चुना गया था। इस दौरे कोलेजन बयान की हद तक का आकलन करने के लिए इस तरह ImageJ के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक मात्रात्मक फैशन में एंटीबायोटिक निम्नलिखित जब काफी उपयोगी साबित हो गया है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd-Hewitt broth  Neogen 7161A
O.C.T Compound  Tissue-Tek (Sakura Finetek)  4583
Triton X-100  Fisher Scientific (Acros) 9002-93-1
Normal Goat Serum Abcam ab7481
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum  Statens Serum Institut 16747
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody  Jackson ImmunoResearch 111-096-144
DAPI Invitrogen D1306
Fluorsave Millipore 345789
Permount Fisher Scientific S70104
Ampicillin Sigma A9393
phosphomolybdic acid 0.2%  Electron Microscopy Sciences 26357-01
0.1% Sirius Red in picric acid  Electron Microscopy Sciences 26357-02
0.01 N hydrochloric acid  Electron Microscopy Sciences 26357-03
Tissue Tack Microscope Slides Polysciences, Inc 24216
Paralube Vet Ointment Dechra 12920060
Hematoxylin and Eosin Staining Kit unspeciified  Standard

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References

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चिकित्सा अंक 98, निमोनिया bacteremia दिल की विफलता आक्रमण हृदय microlesion फोड़ा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी
के दृश्य<em&gt; स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया</em&gt; कार्डिएक Microlesions और बाद में कार्डिएक Remodeling के भीतर
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Brown, A. O., Orihuela, C. J. Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling. J. Vis. Exp. (98), e52590, doi:10.3791/52590 (2015).

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