Het is een uitdaging om stabiele, intravitale, hoogwaardige beelden van immuuncellen in de lever te maken. Hier bieden we een zeer gevoelige en betrouwbare methode om migratie en cel-cel-interacties van immuuncellen in de muizenlever gedurende langere perioden (ongeveer 6 uur) te bestuderen door middel van intravitale multifoton laser scanning microscopie in combinatie met intensieve zorg monitoring.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lever ontsteking als reactie op letsel is een zeer dynamisch proces dat de infiltratie van verschillende subtypen van leukocyten, waaronder monocyten, neutrofielen, T-cel subsets, B-cellen, natuurlijke killer (NK) en NKT cellen. Intravitale microscopie van de lever toezicht immuun celmigratie is een bijzondere uitdaging vanwege de hoge eisen met betrekking monstervoorbereiding en fixatie, optische resolutie en langdurige dieroverleving. Toch kon de dynamiek van inflammatoire processen, alsmede cellulaire interactie onderzoeken kritische informatie om beter te begrijpen de initiatie, progressie en regressie van inflammatoire leverziekte bieden. Daarom werd een zeer gevoelige en betrouwbare methode vastgesteld migratie en cel-cel-interacties van andere immuuncellen in muizenlever gedurende lange perioden (ongeveer 6 uur) door intravitale twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM) studie in combinatie met intensive care monitoring. ent "> Werkwijze ontvangen omvat een zachte preparaat en stabiele fixatie van de lever met minimale verstoring van het orgaan en lange termijn intravitale beeldvorming met multicolor multifoton microscopie met vrijwel geen fotobleken en fototoxische effecten gedurende een periode van maximaal 6 uur, waardoor volgen van specifieke leukocyten subsets en stabiele beeldvorming omstandigheden te wijten aan een uitgebreide controle van de muis vitale parameters en stabilisatie van het verkeer, de temperatuur en de gasuitwisseling.
Om lymfocytenmigratie op leverontsteking onderzoeken CXCR6.gfp knock-in muizen werden onderworpen aan intravitale leverbeeldvorming onder basisomstandigheden en na acute en chronische leverschade geïnduceerd door intraperitoneale injectie (s) van koolstoftetrachloride (CCl4).
CXCR6 is een chemokine receptor expressie op lymfocyten, voornamelijk Killer Natural T (NKT) -, Natural Killer (NK) - en subsets van T-lymfocyten zoals CD4 T-cellen maar ook mucosale Associated invariante (MAIT) T-cellen 1. Naar aanleiding van de trekkende patroon en de positionering van CXCR6.gfp + immuuncellen toegestaan een gedetailleerd inzicht in hun veranderde gedrag op leverschade en dus hun mogelijke betrokkenheid bij progressie van de ziekte.
Inleiding
De visualisatie van cellen en cellulaire functies geheel organen of zelfs hele organismen is van groot belang voor meer dan 50 jaar, waaronder vrijwel alle delen van het lichaam 2. Daarom zijn sommige vroege studies reeds in dienst intravitale beeldvorming van de lever 3,4. Echter, een aantal beperkingen bestaan op de hoogte over de lange termijn een stabiele hoge-resolutie beeldvorming van leverweefsel.
Door de anatomische positie van de lever in nauw contact met het membraan en het maagdarmkanaal 5, het meest voorkomende probleem voor microscopische beeldvorming intravitale beweging door ademhaling en,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake dierproeven na de 'Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren' (NIH publicatie, 8e editie, 2011) en de Richtlijn 2010/63 / EU betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden (Publicatieblad van de Europese Unie, 2010). Officieel toestemming is verleend uit de gouvernementele dier zorg en gebruik op kantoor (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Duitsland).
OPMERKING: Stappen die kan worden weggelaten voor de korte termijn beeldvorming (bv snap shots, 3-D stapels of ook korte duur time....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om onze intravitale TPLSM benadering te valideren, we onderworpen CXCR6 GFP / + muizen om intravitale TPLSM beeldvorming. Muizen werden ofwel onbehandeld als basislijn controles of onderworpen aan een enkele intraperitoneale injectie van tetrachloorkoolstof (CCl 4) om acute leverschade 20 induceren.
Video sequenties werden genomen over een periode van 2-5 uur, en cellen werden getraceerd tijd vanwege hun groene fluorescentie. Om algemene cellulaire beweeglijk.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van onze studie was een zeer gestandaardiseerde, stabiele en reproduceerbare werkwijze voor intravitale TPLSM beeldvorming van de lever ontwikkelen. Intravitale beeldvorming in het algemeen heeft waardevolle inzichten in cellulaire gedrag onder real life omstandigheden volgende homing en interactie van verschillende leukocyten bevolkingsgroepen in ontwikkeling, homeostase en ziekte gegeven. De bosweg anatomische positie van de lever, waardoor respiratoire en intestinale peristaltische beweging direct worden doo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven geen belangenconflicten aan.
Dankbetuigingen
De auteurs danken de Centrale Dierfaciliteit van het Universitair Ziekenhuis Aken voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) en door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Aken. Dit werk werd verder ondersteund door de Kernfaciliteit ”Two-Photon Imaging”, een Kernfaciliteit van het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Aken binnen de Faculteit Geneeskunde van de RWTH Aken Universiteit.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anesthetics | |||
| Buprenorfine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac-anesthesiesysteem | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) verdamper | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotone (0,9%) NaCl-oplossing | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamine 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Verbruiksartikelen | |||
| 20 ml spuit | BD Plastipak | ||
| 250 ml Erlenmeyerkolf | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml Beker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml spuit | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl-naald | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | Commercieel verkrijgbaar | ||
| Bepanthen oog- en neuszalf | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Gaasjes | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Dekglas 24x50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore-zijdetape | 3M | 1538-1 | |
| Feather wegwerp-scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polyethyleenbuis 0,58 mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscopenglazen | ROTH | 1879 | |
| Poly-alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican-naald 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican-naald 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Weefselpapier | Commercieel verkrijgbaar | ||
| Chirurgische instrumenten | |||
| Amalgaam polijstmachine 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractoren (4-taks (bot)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont nr.7 pincet | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe pincet gebogen x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe pincet recht x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatel HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Naaldhaakjes Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Schaar | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken pincet | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Kleine chirurgische schaar gebogen | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Kleine chirurgische schaar recht | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standaard pincet | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas veerscharen | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Apparatuur | |||
| ECG-triggereenheid | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR eind-expiratoire koolstofdioxide-analysator | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multifoton-microscoop Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8-kanaals recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperatuurgeregeld verwarmingskussen | Sygonix | 26857617 | |
| Temperatuursensor | Commercieel verkrijgbaar | ||
| Temperatuurgeregeld systeem voor microscopen -Cube&Box | Life Imaging Services |
Referenties
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluores....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
