Introduction
מחקר של melanogaster תסיסנית סיפק תובנות גדולות לרגולציה הגנטית של מגוון רחב של תופעות. בפרט, חל מחקר מקיף על התפתחות ביצית, כי אאוגנזה מספקת דרך צייתנית לחקור תהליכים רבים ושונים התפתחותיות, כוללים דפוסי רקמה, שינויי קוטביות תא, מיתוג מחזור התא, ורגולצית translational 1,2,3,4. אירוע morphogenic אחד חשוב במהלך אאוגנזה הוא המפרט, הרכישה של תנועתיות, וההגירה של קבוצה של תאים הנקראים תאי גבול (שנסקרו ב5). מאז נדידת תאים הוא תכונה מרכזית של המורפוגנזה בעלי החיים, ובגלל הרגולציה הגנטית של תהליך זה נשמרת היטב, מנגנונים שנקבעו בזבובים עשויים להיות חשוב בהקשרים אחרים. לפיכך, אנו חוקרים את השליטה המולקולרית של נדידת תאי גבול. ללימודים שלנו, פיתחנו שיטה חדשה כדי לבחון את הקטבים הקדמי של פיתוח ביצים,שבו תאי גבול להתעורר, לבחון כיצד הם מפתחים בפירוט.
בתוך השחלה, תאי ביצה בשלבי התפתחות שונים קיימים לאורך שרשרות נקראות ovarioles, שנארזות בנדן דק (איור 1 א). כל תא ביצה ימשיך ליצור ביצה אחת. במהלך אאוגנזה, כמה סוגי תאים שונים חייבים לפתח באופן מתואם. ד תא ביצת melanogaster מורכב מ -16 תאי נבט-קו, כוללים ביצית אחת, מוקף בשכבה אחת אפיתל זקיקי 6. מספר קטן של תאים מיוחדים, הנקרא תאים קוטביים, להתעורר בקטבים הקדמי והאחוריים של האפיתל. תאי הגבול 6-8 מקורן באפיתל הקדמי של תא הביצה, הנגרם על ידי התאים הקוטביים 5,7. באמצע אאוגנזה-(שלב 9), תאי הגבול להתנתק משכניהם ולהעביר בין תאי האחות להגיע לביצית באחורית של תא ביצת 5,7. תנועה זו חייבת להיות מושלמתבעוד תאי הגבול יישארו בקבוצה שסבבה את שני תאים קוטביים שאינו ניע, מה שהופך את זה סוג של נדידת תאים קולקטיבית. הגירה מוצלחת של אשכול תא הגבול מבטיחה התפתחות תקינה של micropyle של קליפת הביצה, אשר הכרחית להפריה.
תאי הקוטב הקדמי להורות גורל תא גבול על ידי הפעלת מפל הולך אותות. תאים קוטביים להפריש ציטוקינים, מזווג (UPD), אשר נקשר לקולטן הטרנסממברני, Domeless (DOME), על תאי שכני זקיק בשלב 8 של פיתוח ביצית 8,9. הכריכה של UPD גורם טירוזין קינאז יאנוס (JAK) לphosphorylate מתמר האותות וActivator של תמלול (STAT) 8,10,11. STAT לאחר מכן עובר לגרעין כדי להפעיל שעתוק. תאים איטיים גבול (SLBO) הוא גורם שעתוק שהוא יעד תעתיק ישיר של STAT וגם נדרש לתא גבול הגירה 12. צפיות ברוחב של תאי ביצה מצביעות tפעילות STAT כובע מוסדרת בשיפוע פני האפיתל הקדמי 8,11,13. יש תאי זקיק הקרובים ביותר לתאים הקוטביים הרמות הגבוהות ביותר של STAT הופעל, כך הם הופכים לתאי גבול ולפלוש לרקמות נבט-הקו הסמוכים.
כדי להבין כיצד תאי הגבול מפורטים ובלהתנתק מהאפיתל, אנחנו צריכים לבחון כיצד הרקמה מאורגנת. אם אנו רואים את תאי ביצה מנקודת מבט קדמי-על, שהיינו מצפה סימטריה הרדיאלית של פעילות STAT בתאי הזקיק המקיפים את התאים הקוטביים. קצה בתצוגה גם באופן מדויק יותר להראות הבדלים של חלבונים בממברנה וממשקי תאי תאים לפני ובמהלך הניתוק מהשוואת תאים במטוסי מוקד שונים. בגלל תאי ביצה מוארכים ומחובר זה לזה על ידי תאי גבעול, הם להתיישב על גבי שקופיות רוחבית, ולכן קשה לבחון את הארכיטקטורה הקדמית. לפיכך, מידע רב על התאים בקטבים של תא הביצה ישכבר משתמע מנופים לרוחב. למרות שניתן להשיג קצת מידע דרך שחזורים אלגוריתמיים 3-D של חלקים אופטיים, פיזור אור, photobleaching, וגבולות עניים יותר של רזולוציה בציר Z-להפוך את המידע הזה פחות מפורט ואמין, בהעדר טכניקות יקרות כמו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר 14 . סוגים אחרים של הדמיה מבוססת סעיף (למשל, במיקרוסקופ אלקטרונים או חתך microtome) דורשים מניפולציה נרחבת של רקמות, כולל התייבשות, ויגדיל את הסבירות לחפצים. לפיכך, פיתחנו שיטה חדשה לתמונת ד תאי ביצת melanogaster תוך זקוף. שיטה זו כבר הוכיחה שימושית בהבהרה כיצד תאי ניעתי נגזרו (ראה תוצאות נציג ומאנינג et al, הנסקר), והוא צפוי להיות באופן רחב יותר יקר במחקרים של היבטים אחרים של אאוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissection של Ovarioles
- העבר כרבע זבובים נקבת 2-4 יום בן וכמה גברים לבקבוקון מזון טרי זבוב עם שמרים יבשים פעילים הוסיפו. השתמש כותנה כתוספת לבקבוקונים, ולהוסיף כמה טיפות של מים לכותנה כדי לשמור על לחות גבוהה.
- בקבוקון מקום בחממה C ° 25 ל14-16 שעות כדי למקסם את מספר שלב 8-10 תאי ביצה.
הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לטמפרטורה ושלב רצוי. - הכן תקשורת לנתיחה, פתרונות 0.1M KPO 4 וNP40 כנדרש ליום המחרת (ראו חומרים).
- להרדים את הזבובים באמצעות CO 2, ומניח תחת מיקרוסקופ לנתיחה. Pipet כמה טיפות של תקשורת לנתיחה לכל חלל בשקופית זכוכית הדיכאון.
- החזק מלקחיים בכל יד בכ 30 מעלות זווית לראש הטבלה ולהתמצא זבוב נקבה אחת עם הכנפיים כלפי מטה. עם היד הלא הדומיננטית שלך, להרים את הנקבה באמצעות מלקחיים, האחיזה בnterior של הבטן, ליד בית החזה, ולהטביע אותה לתקשורת לנתיחה בשקופית הדיכאון (הבלעה איור 1 א).
- עם זוג מלקחיים האחר, לתפוס את השלד החיצוני באחורית הגחון של הבטן ולחדור מבעד. תפוס את השחלות בקצה האחורי, ואז למשוך אותם אל מחוץ לבטן ומניח לתקשורת טרי בצד השני של שקופית הדיכאון האחר. (הבלעה איור 1 א). הימנע קרע לגזרים את המעיים. מחק את הפגר.
- חזור עם זבובי נקבה האחרים עד שכל השחלות הם גזורים. מחק את הזכרים.
- עם זוג אחד של מלקחיים, להחזיק השחלה בסוף האחורי (סמוך לתאי הביצה הגדולים ביותר), ועם היד השנייה להשתמש זוג המלקחיים לצבוט אחד מהתאים קדמי ביותר הביצה (germarium). (איור 1 א).
- לאט ובהתמדה, למשוך שרשרת ovariole מתוך מעטפת השחלה. תמשיך לנתח את ovarioles בנפרד עד שכל תאי הביצה הרצויות הם removed.
- חזור על שלבים 1.7-1.8 לכל השחלות גזורים.
- לאחר השלמת פעולה, להעביר ovarioles לצינור 0.6ml בעזרת פיפטה העברה פלסטיק.
- בואו ovarioles ליישב לתחתית של צינור, ולאחר מכן להמשיך לשלבים תיקון וצביעה.
2. Immunofluorescent (IF) הכתמה של Ovarioles
- מוציא בזהירות את התקשורת לנתיחה מovarioles עם טפטפת. הקפד שלא להסיר את כל ovarioles או תאי ביצה. השאר כ -50 μl של ovarioles ותקשורת לנתיחה.
- הוסף 50 μl של paraformaldehyde 16% ל -150 μl של 0.1 מ '4 מאגר KPO בצינור, ולהוסיף פתרון לתאי ביצה כדי לתקן אותם. דגירה בעוד נדנדה במשך 10 דקות. זהירות: paraformaldehyde הוא רעיל.
- הסר מקבע ולשטוף פעמיים עם חיץ לשטוף NP40 0.5 מיליליטר.
- לשטוף פעמיים במשך 15 דקות כל אחד ב RT.
- עיין סטנדרטי IF פרוטוקול 15 לשלבים הבאים.
- בקצרה, לאחר קיבוע, להוסיףנוגדנים עיקריים בדילולים המתאימים דגירה O / N ב 4 ° C. לשטוף מספר פעמים בNP40, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משני (1: 200 דילולים).
- לשטוף מספר פעמים בNP40, ולאחר מכן להוסיף DAPI (1: 1000) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לחזור שוטף. פעם אחת אם הפרוטוקול הוא מלא, להוסיף 200 μl של גליצרול 50% ב- PBS לתאי ביצה ותן לו לשבת בRT עבור שעה 2.
- הסר פתרון, להחליף אותו עם גליצרול 70% ב- PBS, ומכסה בנייר כסף. הנח מדגם ב 4 ᵒC עד מוכן להרכבה. בינתיים, תמשיך עם שלב 3.
3. Advance הכנת שקופיות ג'לי גליצרין
- למדוד לפחות 4 מיליליטר של גליצרין ריבה בעזרת מרית ולמלא צינור תרבות תא זכוכית לסימן חצי הדרך. להמס ריבת גליצרין באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- יוצקים טיפה קטנה של גליצרול, כ -300 μl, מפתרון המניות על שתי שקופיות מיקרוסקופ. שימוש ברקמה, להפיץ גליצרול בla דקYer פני כל אחת מהשקופיות. זה מספק בסיס ומאפשר להסרת קלה של ג'לי גליצרין בשלב 5.6.
- חותך את הקצה של קצה פיפטה 1,000 μl מסונן. קצה פיפטה לחתוך שימוש להעברת 1,000-1,500 μl של ג'לי גליצרין החם לאט לכל שקופית מיקרוסקופ. לטפל כדי למנוע בועות.
- בואו שקופיות ג'לי גליצרין לשבת במשך 5 דקות בRT להגדיר.
- מניחים כל שקופית ג'לי גליצרין ב 60 מ"מ × 15 מ"מ צלחת פטרי ולכסות בניילון הנצמד. מקום 4 ° CO / N. לחלופין, חנות גליצרין שקופיות ריבה עד 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
4. הרכבה צ'יימברס הביצה
- באמצעות דגימות מהשלב 2.5, טיפות 3 μl כמה פיפטה של תאי ביצה בגליצרול 70% על פני שקופית ג'לי גליצרין אחד. המשך pipetting 3 טיפות μl עד שכל תאי הביצה בשקופית זו. ודא שכל טיפה מכילה לפחות עשרה תאי ביצה. בינתיים, מחמם צינור תרבות של ג'לי גליצרין באמבט המים C ° 55.
- מניחים את שקף ג'לי גליצרין עם תאי ביצה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. התאם הגדלה, כך שרק טיפה אחת של תאי ביצה היא בשדה הראייה (איור 1).
- באמצעות מחט 30 מד ככפית, להרים את תא ביצת שלב הרצוי. כאשר תאים נחוצים, נפרדים רצויים ביצה משרשרת ovariole באמצעות המחט כסכין.
- כדי להימנע מפסולת שעלול להפריע להדמיה, להעביר את תא הביצה לשקופית ג'לי גליצרין השני, עם הקדמי פונה שמאלה (איור 1E -1). חזור על פעולה עד שיש לפחות שבעה תאי ביצה בשורה בטור (איור 1 ג).
- טופס עמודות חדשות של שבע עד שכל תאי הביצה הרצויות מועברים לשקופית ג'לי גליצרין השנייה.
- לתלוש פיסה קטנה של רקמה ושזירה. להשתמש בזה כדי לספוג את PBS-גליצרול העודף מתאי הביצה על ידי נוגע בקלילות כל אחד. יש להיזהר שלא להסיר את תאי ביצה.
- מנותקקצה קצה פיפטה 200 μl מסונן. להשתמש בזה כדי להעביר 150 μl של גליצרין ג'לי כדי לכסות את כל העמודות של תאי ביצה.
הערה: כמות ריבת גליצרין הדרושה כדי לכסות את העמודות מבוססת על שלבי תא ביצה ומספר העמודות. הסכום עשוי להיות מותאם. - בואו תאי ביצה רכובים לשבת במשך 5 דקות ב RT עד השכבה העליונה של ג'לי גליצרין הוא התגבש לגמרי (1D איור).
- שקופית מקום תאי ביצה רכובים בצלחת פטרי מ"מ 60 מ"מ × 15 ומכסים בניילון נצמד. חנות ב 4 ° CO / N כדי לאפשר את שכבות ריבת גליצרין כדי לחזק יחד (מקום בחושך, אם קיים חשש לגבי photobleaching).
5. הכנת לשכות ביצת הדמיה
- הנח שקופיות של תאי ביצה רכובים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. התאם הגדלה, כך שרק אחד עמודה של תאי ביצה היא בשדה הראייה.
- באמצעות אזמל זעיר 45 ° זווית, לחתוך straigקו ht בצדו הימני של העמוד הראשון של תאי ביצה (קרובים לצד האחורי של תאי הביצה). (איור 1D-E)
- בשלב הבא, לחתוך מעל תא הביצה הראשון בחלק העליון ומתחת לתא הביצה האחרון בטור. בשלב זה הטור של תאי ביצה יש לחתוך משלושה צדדים.
- באמצעות microknife, הפרוסה בצדו השמאלי של העמוד, קרוב ככל האפשר לצד הקדמי של תאי הביצה (איור 1E -3).
- פיפטה של קר 1X PBT 100 μl על העמודה לחתוך.
- השתמש במרית קצוות עגול כדי להסיר את ג'לי גליצרין העודף סביב שלושה צדדים של טור החתך של תאי ביצה וזורקים, והשאיר את שאר בשקופית.
- הכנס את המרית בחתך שנעשה בצד הקדמי של תאי ביצה ולהפריד את העמודה מגוש ג'לי גליצרין העיקרי.
- הכן דגימות מיקרוסקופית לאו הפוך (5.8.1) או זקוף (5.8.2).
- להפוך מיקרוסקופים: העברה tהוא הטור של תאי ביצה לcoverslip עם הצד קדמי של תאי ביצה פונה כלפי מטה. חזור על שלבים 5.2-5.8 עד שכל העמודות של ג'לי גליצרין הוסרו ורכובה. הוסף כמה טיפות של 50% PBS-גליצרול על כל בלוק של תאי ביצה כדי למנוע מהם מהתייבשות. תאי ביצת תמונה ישירות על coverslip.
- למיקרוסקופ הזקוף: העבר את העמודה של תאי ביצה לשקופית מיקרוסקופ עם הצד הקדמי פונה כלפי מעלה. חזור על שלבים 5.2-5.9 עד שכל העמודות של ג'לי גליצרין הוסרו ורכובות על שקופיות מיקרוסקופ. הוסף כמה טיפות של 50% PBS-גליצרול על כל בלוק של תאי ביצה וחוסם כיסוי עם coverslip ½ # 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת ההדמיה הזקופה אפשרה לנו לראות באופן ישיר את הארגון של תאים באפיתל הזקיקים הקדמי בשלב 8. סמן כללי לגורל תא זקיק, העיניים נעדרות (EYA) חלבון, כמו גם את סמן DNA הגרעיני DAPI, הראה גם ביטוי על פני תחום זה של תאים, והוכיח כי כל התאים ניתן היו לראות עם עוצמות צביעה דומות (איור 2 "). חלבונים מווסתים בתגובה לUPD ציטוקינים, לעומת זאת, הראו דפוסים משתנים ורמות ביטוי. תאים קוטביים לשחרר UPD apically לפני שלב זה של התפתחות ביצת 16,17, ולכן אנחנו צפויים STAT להיות מופעלים רדיאלית על התאים הקוטביים, שהיה לפעמים במקרה. לעתים קרובות, אם כי, אנו ציינו כי מטרות במורד הזרם של STAT, כוללים SLBO, היו דפוסי ביטוי מורכבים יותר. לדוגמא, כתב GFP לביטוי SLBO הופיע ברוב, אך לא כולם, תאים שהקיפו את התאים הקוטביים (איור 2, ותראה מאןing et al הנסקר). שם לב הבדלים קלים בביטוי / לוקליזציה E-cadherin (איור 2 ב '), שעשוי לשקף שינויים בהידבקות, אבל יותר עבודה תהיה צורך לכמת ולפרש את התוצאה הזאת. דקויות אלה לא היו לזיהוי באמצעות שחזור תלת ממדים לרוחב של תאי ביצה מבוימים (איור 2C-D). ההבדלים בציר הפסגה-בסיס של תאי הזקיק גם ניתן להבחין בשיטה הזקופה. נהגנו קו כתב חלבון תעלת טבעת Visgun (VSG), אשר שוהה באזור הפסגה של ממברנות פלזמה 18 (איור 3 א). ביטוי VSG הדמיה אישרה זקוף התגלה בחלק הפסגה של תאי הזקיק, בסמוך לחלק הצר ביותר של התאים הקוטביים (איור 3).
יש לנו גם מצא כי שיטת ההדמיה הזקופה עובדת היטב כדי להציג אפיתל הקדמי בשלב 9 תאי ביצה. בdevel זהשלב opmental, תאי הגבול להתגבש יחד סביב התאים הקוטביים (איור 4 א). אנחנו יכולים להתבונן הצבירים הללו נדחסו באמצעות הקצה על הדמיה (איור 4 ב-ג). כמו בשלב 8, מצאנו רמות דומות של ביטוי EYA בכל תאי אפיתל (לא מוצג), ואילו -GFP slbo כמו גם STAT הופעל, גרעיני סימן את תאי ניעתי גבול (איור 4 ו4C). לוקליזציה של חלבון FAS3 הצביעה על ממשק תא-קוטבי הקוטבי תא (איור 4). בנוסף, בשני השלבים 8 ו -9 היינו יכולים לראות את תאי אחות הגדולים, כפי שצוין על ידי DAPI או phalloidin מכתים של אקטין קליפת המוח (לא מוצג), אשר טוען בשיטה זו גם תהיה שימושית במחקר של תאי נבט קו או תאי נבט אינטראקציות תא -follicle.
איור 1. הרכבה זקופה של תא ביצת דרוזופילהs. השחלה () דרוזופילה מצביעה תא ביצה, נדן, וovariole. תיאור ממחיש את עמדתו של מלקחיים למשייכת ovariole לאט מנדן השחלה. הבלעה מראה מיקום של זבוב לנתיחה. צד הגחון של זבוב נקבה פונה כלפי מעלה. -קדמי, P-אחורי. נוהל (BD) של הרכבה תאי ביצה. (ב) ירידה קטנה של תאי ביצה ב- 70% גליצרול-PBS, שנצפה תחת סטראו לנתיחה. החץ הצהוב מצביע על שרשרת ovariole; ראש החץ צהוב מצביע על תא ביצה בודד. חץ אדום מציין את הקצה של ירידת גליצרול-PBS. עמודות (C) של תאי ביצה מסודרים על שכבה דקה של ריבת גליצרין הקרושה. צהוב ראש החץ מצביע על תא ביצה בודד. (ד ') שכבה דקה של ריבה שנייה גליצרין נמס מכסה את עמודות תא הביצה להטביע אותם. קו מקווקו צהוב מציין היכן קיצוצים צריכים להיעשות לאחר הדגירה O / N ב4ᵒC. חץ אדום מציין אתקצה של השכבה השנייה של ג'לי גליצרין. מספרים אדומים מציינים את סדר חיתוך עמודות תא ביצה (למעלה אופקי וחתכים תחתון אינם מוצגים). הקדמי הוא בצד השמאל. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. הדמיה של האפיתל הקדמי של תא ביצה בשלב מוקדם 8. (: Slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP גנוטיפ) 19,20, מוכתם בDAPI ונוגדנים עיקריים כפי שצוין או לslbo> GFP תצוגה לרוחב של 8 תאי גבול איטיים (slbo) קאמרי שלב כתב גן ביצה (). Armadillo (ARM) הוא homolog הזבוב של β-קטנין. קדמי (A) הוא בצד השמאל, האחורי (P) לימין. (BB ") End-על נופים של צ'ה ביצהmber. שלושה שחזור ממדי של תמונות Z-ערימת תא ביצת שלב 8 slbo- כתב הגן רכוב זקוף, מוכתם בנוגדנים ראשוניים כפי שצוין. כוכביות Magenta מצביעות על תאים קוטביים. DAPI מסמן את הגרעינים. (ב ') slbo> GFP מתבטא רק בתאים משוערים הגבול (SLBO). E-cadherin (E-CAD) היא מולקולת הידבקות מקומית לממברנה והמועשרת בתאי גבול. (ב '') עיניים נעדרת (EYA) נמצא הביע באופן שווה בכל הגרעינים של תאי הזקיק מלבד תאים קוטביים. (C) תצוגה רגילה לרוחב של שלב 8 תא ביצת -reporter slbo מגואלות DAPI (כחול) ונוגדנים כנגד GFP (SLBO, ירוקה), ARM (אדום), וFAS3 (לבנה). הבלעה מראה צירים: ציר ה- X הוא למטה (חץ ירוק), ציר Y הוא לכיוון השמאל (החץ אדום), וציר Z-הוא לעבר הצופה (הכחול) (ד) לשם השוואה לטכניקה החדשה. , לוח זה מציג Crea הסוף על-נוףטד על ידי שחזור תלת ממדים, מעובד עם תוכנת Volocity, באמצעות Z-ערימה של תמונות לרוחב של תא הביצה מוצג ג הבלעה מראה צירים הפכו: ציר ה- X הוא למטה (חץ ירוק), Z-ציר הוא עכשיו לכיוון השמאל (חץ כחול), וציר Y הוא לעבר הצופה (אדום). תאים בודדים מטושטשים עקב רזולוציה נמוכה בציר ה- Z; כך, הגישה החדשה שמוצגת בB מייצגת שיפור משמעותי הדמיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. השוואת ביטוי חלבון בתחומים רוחביים וקדמיים של האפיתל הזקיקים של תא ביצת שלב 8. (א) שחזור של תצוגה לרוחב של תא שלב 8 ביצה של visgun (VSG) -GFP כתב <sup 21-23>, מוכתם לנוגדנים המכוונים נגד GFP או ARM (לבן). DAPI מסמן את הגרעינים בכחול, וגרעיני תאי אחות גדולים הם לכאורה. VSG localizes לתעלות הטבעת של תאי זקיק (הירוקה). (BB ") End-על נופים של שיקום chamber.Three ממדי ביצה של Z-ערימה של תמונות של שלב 8 תא ביצת כתב VSG-GFP, מוכתם ב נוגדנים עיקריים כפי שצוינו. חלבון SLBO (אדום) הוא זוהה בשני גרעיני תא קוטביים וגבול. ARM מסמן קרום תא זקיק והוא מועשר בתאי גבול; DAPI תוויות גרעינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הדמיה של תאי ביצה בשלב מוקדם 9. תצוגה רוחבית של שלב 9 sl המוקדם ()תא ביצת -reporter bo. תאי הגבול (הירוק) שהתקבצו בתוך האפיתל הקדמי (חץ לבן). End-על לפני הספירה) נופים של תאי הביצה. שלושה שחזור ממדי של Z-ערימה של תמונות משלב מוקדם 9 תא ביצת כתב גן slbo-, מוכתם באמצעות נוגדנים עיקריים המכוונים נגד החלבונים כפי שצוין או GFP. (B) slbo> GFP מתבטא בתאי הגבול (ירוקה) , בעוד Fasciclin 3 (FAS3, לבנים) localizes מאוד הקרום בין שני התאים קוטביים; DAPI מסמן את הגרעינים (הכחול). כוכביות Magenta מצביעות על תאים קוטביים. (ג) שני גרעיני (מופעלים) STAT וslbo> ביטוי GFP נמצאים רק בתאי הגבול, בעוד E-cadherin (E-CAD) מסמן את הקרומים של תאי זקיק, וDAPI מציין את הגרעינים. כוכביות Magenta מצביעות על תאים קוטביים. תוצאות מכתים מוצגות בנפרד עבור slbo> GFP (ג ') וSTAT (ג' ') לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה להר ותמונה קטנה, פיתוח תאי ביצה מנקודת מבט סוף-על. טכניקות נפוצות לתאי ביצת הדמיה מותאמות להשקפות לרוחב ובעיקר לאפשר להדמיה מדויקת של תאי זקיק Medio-צדדי כאשר מוכתם עם נוגדני ניאון. השימוש בZ- ערימות או עזרי שחזורים 3-D בצפיית מטוסי מוקד מרובים, אבל עדיין לא מספיק לפתרון משנה הסלולר של הקטבים של תאים סגלגלים ביצה (איור 2 ד). אמנם זה ניתן להתגבר באופן חלקי עם שיטות מיקרוסקופיה החדשות כגון הדמיה ברזולוציה סופר, השיטות אלה הן יקרות ולא תמיד זמינות. יש לנו להתאים פרוטוקולי הדמיה זקופה לתסיסנית עוברי 24,25 לשמש לתאי ביצה הקטנים בהרבה. יש כמה שינויים מרכזיים בשיטה כדי להסביר את הגודל קטן בהרבה של תאי ביצה בהשוואה לעוברים. מרכיב מרכזי של הטכניקה המתוארת הוא separ הפיזיation של תאים בודדים, שאינו נדרשו בעוברים. שינוי נוסף הוא השימוש בשקופיות ג'לי גליצרין שני במהלך ההרכבה (4.4). גודלם של תאי ביצה ואת הקשר שלהם באמצעות תאי גבעול לתאי ביצה אחרים דורש מניפולציה עם המחט ומוביל להרס של ג'לי גליצרין. לכן, תאי ביצה חייבים להיות מועברים עם מחט לשקופית ג'לי גליצרין חדשה להרכבה (4.5). הדמיה זקופה מאפשרת הדמיה של האזורים מטושטשים על ידי נופים רוחביים או אופקיים, חושפת מידע חדש על ארגון הרקמה במהלך התפתחות ביצית. זה הוביל לתובנות חדשות על אירועי דפוסים, ואנו מציעים כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור היבטים נוספים של אאוגנזה.
יש לנו כמה שלבים קריטיים שנקבעו בהרכבה זקופה מוצלחת. מצאנו שזה נחוץ כדי להסיר את רשתות ovariole לחלוטין מהנדן במהלך נתיחה, ותאי ביצה רצויים יש לחתוך מovariolשרשרת דואר. אי תאי ביצה חופשיים מovariole עושה את זה קשה להרים את התא הנכון ביצת שלב (שלב 4.3). אנו ממליצים לעבוד עם כמויות קטנות של ריבת גליצרין בכל פעם על ידי aliquoting אותו לצינורות. אין לחמם גליצרין ריבה יותר מפעמיים כי חימום חוזר ונשנה משנה עקביות שלו ומונע ממנו לחיזוק כראוי (3.1). השתמש בעצות מסנן למניעת aspirating ג'לי לpipettors. לאפשר ג'לי גליצרין לבסס על שקופיות מיקרוסקופ לפחות 8 שעות על 4 מעלות צלזיוס. קיצור צעד זה הופך את ההרכבה תאי הביצה קשה (3.6). חשוב לוודא לקלוט את כל PBS-גליצרול מלשכתו רכובה ביצה (4.6). אם יותר מדי נוזלים הוא הווה, הוא מונע את השכבה העליונה של ג'לי גליצרין מהיצמדות לתחתית. במקרה זה, תאי ביצה עשויים לצוף ולשנות את העמדה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר הדמיה, גליצרין לוקי ג'לי יש לחתוך קרוב לצד הקדמי של תאי ביצה כפיזי אפשרי (5.4). יותר מדי ריבת גליצרין על זהצד יורד איכות תמונה בשל המרחק גדל בין הדגימה וcoverslip.
יש כמה אזהרות של הרכבה דגימות בג'לי גליצרין. לאחד, זה מגדיל את המרחק בין המדגם והאובייקטיבי. מרחק זה בהגדלה גבוהה, במיוחד בעת שימוש אובייקטיבי שמן, יכול ליצור קושי ביצירת מיקוד על הדגימה, אשר יכול לגרום לאיכות תמונה ירודה. לאור זאת, זה מאוד חשוב כדי לסלול את לוקי ג'לי גליצרין קרובים מאוד לתאי הביצה. למרות שג'לי גליצרין הוא ברור אופטי, שהיא עושה defract קצת אור. מגבלה נוספת היא שאות נוגדן עשויה להיות מופחתת עקב שילוב של מרחק עבודה של המטרה ואת העובי של ג'לי גליצרין. עלייה לריכוז של שני נוגדנים ראשוניים ו / או משניים יכולה לפעמים לסייע בהפחתת בעיה זו. למרות שזה משתנה בהתאם לנוגדן, אנחנו בדרך כלל רכשנו תמונות טובות יותר באמצעות כפול הריכוז של נמלה משניתibody בהדמיה זקופה בהשוואה לכמות שימוש בהדמיה לרוחב סטנדרטית. לא ידועים לנו חלופות לגליצרין ג'לי להרכבת תאי ביצה זקופה. חומרים אחרים כגון agarose וpolyacrylamide נשפטו אבל כל defracted אור בצורה חמורה יותר, גורם לאובדן של בהירות תוך הדמיה. כך, טכניקת הרכבה זו היא הטובה ביותר שזמין כעת לשימוש עם מיקרוסקופיה סטנדרטית.
בזמן שאנחנו מתמקדים בשלבי מפרט תא גבול וייזום של תנועתיות, תאי ביצה של שלבים שונים יכולים לשמש בפרוטוקול זה עם רק כמה התאמות קלות. והכי חשוב, מד של המחט יכול להיות שונה כדי לתפעל תאי ביצה בגדלים שונים ושלבי התפתחות. לשלבים 7-10, מחט 30 G עובדת היטב כי תאי הביצה להתאים בקלות בהטיה. לתאי ביצת שלב מוקדם יותר מחט גדולה יותר מד (פוע הקטן יותר) יש להשתמש ובאופן דומה מד קטן (פוע הגדול יותר) יש להשתמש לשימוש מאוחר יותר stתאי ביצה בגיל. שום דבר בשלב התפתחות בוגר יהיה גדול מדי עבור מד זה (4.3). כמו כן כל צד של חדר הביצה ניתן הדמיה באמצעות טכניקה זו על ידי סידור בלוק ג'לי גליצרין של תאי ביצה עם השטח של עניין לקראת המטרה.
יש הרכבה דגימות קטנות תמכו בג'לי גליצרין הפוטנציאל להיות שימושי בהקשרים רבים. אסטרטגיה זו יכולה לשמש כדי להציג סוגים שונים של רקמות קטנות, קבועות מאורגניזמים אחרים, במיוחד כאשר זה יהיה מספיק כדי לבחון את הדגימות מרק נקודת מבט אחת. ברגע שטכניקה זו היא שולטת, ניתן להשתמש בו כדי להציג תאי ביצה בכל זווית רצויה, תלוי איך תאי הביצה ממוקמים בריבה. שיטה זו מאפשרת לנוף ייחודי יוצר הבנה תלת ממדים הרבה יותר טובה של ארגון סלולארי. הדמיה זקופה של תאי ביצה בשיתוף עם מכתים נוגדן immunofluorescent מאפשרת איתור המדויק של חלבוןאנשי קשר של ותאי תאים שלא היו מתאפשרות בתנאי הרכבה סטנדרטיים. אנחנו מתכננים להשתמש בשיטה זו במיפוי אינטראקציות תא-תא המאפשרות הגיבוש וניתוק של אשכול תא גבול מן האפיתל. בשלב זה, את טכניקת ההדמיה הזקופה לא ניתן להשתמש בדוגמאות חיות, אבל אנחנו גם פועלים כדי להתגבר על מכשול זה. אנו צופים בשיטה זו גם תהיה ישימה ללמוד מהיבטים אחרים של אאוגנזה דרוזופילה, או יכולים להיות מותאמים לרקמות קטנות אחרות תמונה בזוויות חדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L.
- Bastock, R., St Johnston, D.
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al.
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al.
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
