Abstract
التصلب المتعدد هو مرض المزيل للالتهابات في الجهاز العصبي المركزي التي تتميز تشكيل لوحة تحتوي قليلة التغصن المفقودة، المايلين، المحاور، والخلايا العصبية. عودة الميالين هو آلية إصلاح الذاتية حيث يتم إنتاج المايلين جديد لاحقة في الانتشار، التوظيف، وتمايز الخلايا دبقية قليلة التغصن السلائف إلى قليلة التغصن تشكيل المايلين، وضروري لحماية محاور من مزيد من الضرر. حاليا، كل العلاجات لعلاج التصلب المتعدد تستهدف المكون المناعة الشاذة لهذا المرض، والتي تقلل التهابات الانتكاسات ولكن لا تمنع التقدم إلى انخفاض العصبية لا رجعة فيه. ولذا فمن الضروري أن استراتيجيات تعزيز عودة الميالين وضعها الذي قد يؤدي إلى تأخير تطور المرض وربما عكس أعراض عصبية. عدة نماذج حيوانية من إزالة الميالين موجودة، بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي وcurprizone. ومع ذلك، هناك حدها الاقصىطفرات في استخدامها لدراسة عودة الميالين. نهج أكثر قوة هو حقن البؤري من السموم في الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك ليزوليسيتين مواد التنظيف في الحبل الشوكي المادة البيضاء من القوارض. في هذا البروتوكول، ونحن تثبت أن العملية الجراحية التي ينطوي عليها عن طريق الحقن ليزوليسيتين في المادة البيضاء البطنية من الفئران هو سريعة وفعالة من حيث التكلفة، ويتطلب أي مواد إضافية من تلك المتاحة تجاريا. هذا الإجراء مهم ليس فقط لدراسة الأحداث الطبيعية التي تنطوي عليها عملية عودة الميالين، ولكن أيضا كأداة ما قبل السريرية لفحص المرشح العلاجات المعززة للعودة الميالين.
Introduction
التصلب المتعدد (MS) هو مرض مزمن المزيل للنظام العصبي المركزي (CNS) التي تتميز تسلل خلية المناعة، واللوحات التي تحتوي فقدت المايلين، قليلة التغصن، محاور والخلايا العصبية. معظم المرضى لديهم مسار المرض تتكون من الانتكاسات التهابات برفقة مجموعة واسعة من أعراض عصبية، تليها فترات من مغفرة. أكثر من نصف هؤلاء المرضى الانتقال في نهاية المطاف إلى مرحلة تقدمية الثانوية مع أي انتكاسات واضحة ولكن تراجع عصبي مستمر. ويعتقد أن هذا التدهور التدريجي بسبب الأضرار محور عصبي والخسارة، وساهمت في جزء من إزالة الميالين المزمن. وبالتالي تعتبر استراتيجيات لاستعادة المايلين المفقود نهج العلاج واعد لتأخير تطور المرض وربما عكس أعراض عصبية.
عودة الميالين هو استجابة إصلاح الذاتية في الجهاز العصبي المركزي حيث يتم إنشاؤها الأغماد المايلين جديدة من خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف تجنيدهم(يجد OPCs) التي تفرق في قليلة التغصن تشكيل المايلين. وقد تبين عودة الميالين في النماذج الحيوانية أن تكون قوية جدا 1-3، ومع ذلك، تنخفض كفاءتها مع تقدم العمر 4. في الواقع، يحدث عودة الميالين في البشر على الرغم من أنها غير مكتملة في معظم مرضى التصلب المتعدد 5. جميع الأدوية المتاحة حاليا لMS تستهدف في المقام الأول المكون المناعة الشاذة للمرض و، في حين فعالة في الحد من الانتكاسات، لا تأخير تطور المرض بشكل ملحوظ. وسيكون الجيل القادم من الاستراتيجيات العلاجية لإدارة MS دمج التقدم في تعديل مناعي مع تعزيز عودة الميالين الذاتية من أجل منع كل من الانتكاسات والتقدم 6.
طريقة واحدة لدراسة اكتئاب وعودة الميالين في الجهاز العصبي المركزي ينطوي على حقن المباشر للlysophosphatidylcholine المنظفات (ليزوليسيتين) في الحبل الشوكي المادة البيضاء 1،3،7. ينتج هذا الإجراء demyelinat تتميز أيضاإصابة تتألف أساسا من البلاعم / دبقية تسلل وتفعيل 8،9، دباق النجمي رد الفعل، اضطراب التوازن محور عصبي / إصابة محور عصبي، وانتشار OPC والهجرة 10 جي. الآفة تطور متوقع خلال فترة أسابيع قليلة، وقادر في نهاية المطاف من remyelinating بالكامل. وقد كان هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص في دراسة الرقص الشعبي من أحداث المشاركة في اجتثاث وعودة الميالين. وعلاوة على ذلك، فقد تم اعتماده كأداة لاختبار ما قبل السريرية من العلاجات مرشح لتسريع إصلاح التالية إهانة المزيل.
Protocol
ملاحظة: تتم رعاية الحيوانات المستخدمة في هذا الإجراء وفقا للمجلس الكندي للرعاية الحيوان (CCAC) المبادئ التوجيهية. وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق رعاية الحيوان من جامعة كالجاري.
1. إعداد الحقنة للحقن
- حل ليزوليسيتين إلى حل 1٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) وتخزينها في -20 درجة مئوية في مأخوذة صغيرة (75 ميكرولتر). ذوبان الجليد قارورة لRT.
ملاحظة: إذا ليزوليسيتين هي غير منحل، يصوتن الأنبوب في نظافة بالموجات فوق الصوتية (40 كيلو هرتز) لحوالي 30 دقيقة لتشكيل حل موحد. - التعامل مع الزجاج الشعرية سحبت قبل بعناية فائقة لتجنب إتلاف طرف دقيق. فك الجوز من حقن حقنة 10 ميكرولتر والخيط وضعها على نهاية شقة للالشعرية تليها 2 الحلقات، وضمان أن ينتهي التزاوج من الحلقات محاذاة والشعرية غير مريح في الطويق مخروطي الشكل (الشكل 1). شطف المحاقن مع isopropالكحول يل وإزالة المكبس. الجاف مرة واحدة، والمسمار من ناحية التجمع إبرة ضيق على حقنة عن طريق الحقن.
- إرفاق الإبرة مركز معدنية لحقنة فتيلة. بيرس قرص المطاط مع الإبرة والانزلاق إلى أسفل إلى القاعدة. ملء حقنة فتيلة مع ليزوليسيتين. خفض بلطف حقنة فتيلة حتى السائل مرئيا في رأس الإبرة. وهذا يضمن لن يتم إدخال فقاعات الهواء في حقنة عن طريق الحقن.
- ادخال الإبرة مركز المعدني للحقنة فتيلة في حقنة عن طريق الحقن. جعل ختم حازم مع القرص المطاطي، خفض ببطء حقنة فتيلة حتى يملأ الشعرية إلى طرف مع الحل. إزالة بعناية حقنة فتيلة بينما الاكتئاب في وقت واحد لملء برميل من الحقنة عن طريق الحقن دون إدخال فقاعات الهواء. إدراج المكبس إلى حقنة عن طريق الحقن، وضمان تدفق الحل من طرف الشعرية كما هو الاكتئاب الغطاس بلطف.
ملاحظة: إذا كان أي فقاعات الهواء مرئية في الحد الأقصىillary أو حقن حقنة، يجب أن يتكرر إعداد حقنة من البداية. السائل المستمر في الجهاز عن طريق الحقن أمر بالغ الأهمية لضمان كميات حقن دقيقة. - نعلق حقنة حقن الانتهاء إلى ذراع مياداة مجهرية المجسم. وهذا الجهاز أكملت تكون قادرة على ضخ 15-20 الحيوانات قبل أن تحتاج إلى إعادة ملئها.
- تجاهل ليزوليسيتين المتبقية من حقنة فتيلة. سحب وخفض ايزوبروبيل عدة مرات، وفصل الإبرة مركزا المعدنية. الانتظار عدة ساعات لتبقى ايزوبروبيل في المحقنة فتيلة لتتبخر قبل ملء مرة أخرى.
2. إعداد الحيوان للإجراء الجراحي
ملاحظة: يتم وصف هذا الإجراء لالإناث C57BL / 6 الفئران، والذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع.
- تخدير الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين (200 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) أو في اللوائح رعاية الحيوان المؤسسية. خطة لالحيوان لتكون تحت التخدير لحوالي 1 ساعة إذا باستخدام التخدير عن طريق الحقن.
- اختبار أن هذا الحيوان هو تخدير عميق من معسر بحزم القدم. لن تستجيب حيوان تخدير بشكل صحيح إلى قرصة.
- باستخدام كليبرز، حلاقة سم 2 مساحة 2-3 على الجانب الظهري من الحيوان، على مقربة من الأذنين. يجب الحرص على عدم الإضرار الأذنين.
- مسح منطقة نظيفة مع الايثانول 70٪ تطبق على الشاش. ضمان تمت إزالة كل الشعر قص من المنطقة. تطهير المنطقة مع اليود.
- تطبيق الفازلين للعيون لمنع جفاف في جميع أنحاء الداخلي.
- حفاظ على الحيوانات في غرفة الإنعاش ساخنة حتى على استعداد لبدء الإجراء.
3. تنفيذ الإجراء الجراحي
ملاحظة: تأكد تقنية العقيم الكافية لجميع مراحل العملية. وهذا يشمل الاستخدام السليم للقفازات، hairnets، والأقنعة، وستائر. يجب تعقيم جميع الأدوات قبل مجيئه في CONTACر مع الحيوان.
- نقل الحيوانات إلى إطار المجسم، الجانب الظهري يصل، مرتفعة في القسم منتصف بواسطة مناشف ورقية مطوية المبالغة في انحناء في العمود الفقري. ربط الذراعين والذيل مع الشريط الجراحية وتأمين الرأس مع المشبك الأسنان. استقرار القضبان الأذن ليست ضرورية لهذا الإجراء.
- استخدام مشرط لجعل 3 سم شق خط الوسط، بدأت للتو تحت الأذنين وقطع في اتجاه الذيلية.
- تحديد الفجوة بين الهياكل الدهنية كبيرة (2) واستخدام ملقط غرامة في كل يد لسحب هذه على حدة. نشر الكامشات لفتح المجال الجراحي.
- تحت المجهر الجراحي، حدد موقع عملية ثمرة بارزة للفقرة T2 (ملاحظة: هذه الميزة المميزة للسلالة الماوس C57BL / 6). إجراء تشريح حادة مع مقص الربيع مغلقة من خلال عضلات تتراكب لتصور أفضل T2. باستخدام ملقط، ويشعر لالأسطح الصلبة من T3 و T4 لتأكيد مكان التشريحي السليم.
- باستخدام مقص الربيع، وجعل التخفيضات الجانبية الضحلة (2-3 ملم العميقة) من النسيج الضام بين T3 و T4. نظرا لتباعد الطبيعي بين الفقرات في الجزء العلوي الصدري من العمود الفقري الفأر، وهو الثقب ليس ضروريا للكشف عن الحبل الشوكي. أن تضع في اعتبارها أن عميقة جدا خفضا سوف تخترق وتلف الحبل.
ملاحظة: درجة صغيرة من النزيف هو شائع خلال هذه الخطوة. إذا حدث هذا، عقد الرمح الإسفنج في المنطقة حتى ينحسر النزيف (30-60 ثانية). - تصور الحبل الشوكي. سيتم تغطيتها بطبقة سميكة من الجافية واضحة اذا لم تقطع هذه الطبقة السحائية بعد حين فضح الحبل. A الأوعية الدموية بارزة تدير الذيلية / منقاري من خلال خط الوسط تقريبي من الحبل الشوكي.
ملاحظة: لا ينبغي أن تستخدم هذه الأوعية الدموية كمعلم لخط الوسط. بدلا من ذلك، يجب أن الإضاءة الكافية تكشف عن حدود المادة الرمادية البيضاء المرافقة العمود الظهري، وهذه ينبغي أن تستخدم لتقدير خط الوسط. - إذا الجافيةلا تزال على حالها، وجعل الورطات الجانبية لطيف مع 32 G المعادن الإبرة حتى يتم مسح عليه. والهدف هو إزالة الجافية في حين لا قطع السحايا الكامنة المتبقية، والتي هي وليس كما سميكة وأصعب لنرى.
ملاحظة: الإفراج عن السائل النخاعي يشير إلى وجود خرق للالعنكبوتية وبينما يمكن أن يحدث هذا دون الأضرار الميكانيكية للأنسجة، يجب إزالة السائل المخي الشوكي المتراكمة مع الرمح الإسفنج لتصور أفضل للسطح من الحبل. - نقل حقنة عن طريق الحقن في مكان وخفض ببطء حتى غيض من الشعرية بالكاد تلامس النخاع الشوكي الجانبي فورا من جانبي خط الوسط. قفل الذراع في المكان.
- استخدام القياسات متدرج من Z-الاتجاه الذراع المجسم لجعل قياس موقف خط الأساس. من هذه القراءة، طرح 1.3 ملم. تستخدم حركة الهبوط سريعة وسطحية لاختراق الأنسجة ومن ثم خفض بعناية الشعرية حتى يتم الوصول إلى قياس جديد. اختياري: إذا رغبت في ذلك،يمكن أن تنتج الآفات في العمود الظهري من قبل نفس الحركة ثقب في خط الوسط وعلى عمق 0.3 مم (انظر المناقشة لمزيد من المعلومات).
ملاحظة: هذه القيم هي محددة لحقن بين T3 و T4. إذا اختارت لأداء الحقن في أي مكان آخر في النخاع الشوكي، يجب ان تستمد هذه القيم من أي أطلس مخ الفأر المتاحة. - استخدام مياداة مجهرية لخفض ليزوليسيتين في الحبل الشوكي المادة البيضاء بطني. جعل 1 دوران مياداة مجهرية كل 5 ثانية لمدة 2 دقيقة، مما أدى إلى الحجم النهائي من 0.5 ميكرولتر. ترك الشعرية في مكان لمدة 2 دقيقة إضافية لمنع ارتجاعي من الحل، ومن ثم إزالة بعناية الشعرية.
- ربط خياطة واحدة في الأنسجة العضلية / الدهنية تتراكب العمود الفقري. استخدام الخيط غير انقطاع لإغلاق الجلد. تطبيق المزيد من اليود لموقع شق.
- وضع الحيوان في غرفة الإنعاش ساخنة حتى يتعافى، ثم إعادته إلى قفصه. تطبيق المسكنات ما بعدالجراحة وفقا للوائح رعاية الحيوان المؤسسية. الرعاية الإضافية اللاحقة للعمليات الجراحية هي عادة ليست ضرورية لأن الحيوانات المتنقلة بالكامل وقادرة على التغذية الذاتية والشرب بمجرد الشفاء من التخدير.
- كرر الإجراء للحيوانات المتبقية.
ملاحظة: مع الكفاءة، وهذه العملية يمكن أن تكتمل في 10-15 دقيقة لكل حيوان، وخاصة مع مساعدة من شخص ثان ربط الغرز. الزجاج نفسه الشعرية يمكن استخدامها لحوالي 15-20 العمليات الجراحية قبل أن يصبح طرف حادة ويجب استبداله. جراحات السيطرة يمكن أن يؤديها مماثل كما وصفها، مع حقنة من برنامج تلفزيوني في الحبل الشوكي بدلا من ليزوليسيتين. نحن لا ننصح تنظيف الشعيرات الدموية لاستخدامها في المستقبل.
4. معالجة الأنسجة وتحليل
- تضحية الحيوانات مع جرعة زائدة داخل الصفاق من الكيتامين (500 ملغ / كلغ) وزيلازين (25 ملغ / كلغ) في نقاط الوقت المطلوب. تتطور الآفات عادة في الفلالطريقة بسبب: 1-3 أيام، إزالة الميالين نشطة؛ 3-7 أيام، والتوظيف OPC. 7-10 أيام، دبقية قليلة التغصن التمايز. 10-21 يوما، عودة الميالين نشط 2،10،11.
- لإعداد الأنسجة لالأنسجة، نفذ لأول مرة نضح transcardial 12 مع 20 مل PBS RT تليها 20 مل الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني. لإعداد الراتنج الأنسجة جزءا لا يتجزأ من لشبه أو سامسونج باجتزاء، راجع الخطوة 4.9.
- إزالة الحبل الشوكي باستخدام مقص العظام المنحنية لقطع طريق كل فقرات ابتداء من نهاية عنق الرحم العمود الفقري والعمل وصولا الى مستوى الصدر أقل. إصلاح النخاع الشوكي O / N في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. تبديل الحبال إلى 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة 72 ساعة على الأقل.
- تحديد موقع الحقن كما شذوذ على السطح الظهري للحبل الشوكي. قطع 3 مم قطعة من النسيج (مع موقع الحقن في الوسط) ومحاذاة القطع في cryomolds تحتوي على درجة الحرارة المثلى القطع (OCT) شاركmpound. تعليق الجانب السفلي من cryomolds في خليط المبردة من 2-methylbutane والثلج الجاف حتى أكتوبر هو المجمدة تماما. تخزين في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للمقطع.
- قسم النخاع الشوكي على ناظم البرد في عرض 20 ميكرومتر على الشرائح المجهر والسماح للهواء الجاف O / N قبل تخزين الشرائح في -20 ° C.
- كشف موقع الآفة وحجم باستخدام eriochrome cyanine وصمة عار النسيجية المايلين 13. تنفيذ جميع الخطوات في RT. الشرائح الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة. مكان الشرائح في تطهير وكيل لمدة 1 دقيقة تليها الإماهة في حلول الايثانول متدرج (100٪، 95٪، 90٪، 70٪، 50٪، والمياه) لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
- مكان الشرائح في eriochrome حل cyanine لمدة 15 دقيقة، تليها غسل 1 دقيقة بالماء. التفريق في هيدروكسيد الأمونيوم بنسبة 0.5٪ لمدة 10 ثانية، يليه غسل 1 دقيقة بالماء. يذوى في حلول الايثانول متدرج (عكس النظام كما هو موضح أعلاه) لمدة 1 دقيقة لكل منهما، ساترة مع وسائل الإعلام المتصاعدة، وصورة على ميل مشرق الميدانcroscope.
- استخدام المناعية لتصور محاور والمايلين. الشرائح الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة. يذوى مع الإيثانول متدرج (ماء، 50٪، 70٪، 90٪، 95٪، 100٪) لمدة 2 دقيقة لكل منهما في RT، ثم عكس أجل العودة إلى المياه. نتائج هذه الخطوة بمزيد من قرار من حلقات المايلين الفردية 14.
- منع تفاعلات الأجسام المضادة غير محددة باستخدام 10٪ مصل الماعز و 0.25٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 60 دقيقة في RT. تمييع الأجسام المضادة الأولية (الماوس مكافحة SMI312 1: 2،000، أرنب مكافحة MBP 1: 1،000) في برنامج تلفزيوني واحتضان على الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية.
- يغسل 5 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني في RT. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا 488 المضادة للأرنب 1: 500، اليكسا 546 المضادة للماوس 1: 500) في برنامج تلفزيوني واحتضان على الشرائح لمدة 60 دقيقة في RT. يغسل 5 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني في RT. جبل الشرائح مع coverslips باستخدام gelvatol والصورة على المجهر الفلورسنت.
- استخدام المناعية لتصور خلايا دبقية قليلة التغصن النسب. اتبع الإجراء للشارعEP 4.7، حذف الخطوة الجفاف / الإماهة، واستخدام 10٪ مصل الحصان بدلا من مصل الماعز. استخدام التخفيفات الأجسام المضادة الأولية التالية: الماعز مكافحة PDGFRα 1: 100، والماوس مكافحة CC1 1: 200، أرنب مكافحة Olig2 1: 200. استخدام التخفيفات الأجسام المضادة الثانوية التالية: اليكسا 488 مكافحة الماعز 1: 500، اليكسا 594 المضادة للماوس 1: 500، اليكسا 647 المضادة للأرنب 1: 500.
- لإعداد الأنسجة لشبه أو سامسونج باجتزاء، نفذ لأول مرة نضح transcardial 12 مع 20 مل PBS RT تليها 20 مل الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ / 1٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني. إزالة الحبل الشوكي كما هو موضح في الخطوة 4.3. إصلاح O / N في بارافورمالدهيد 4٪ / 1٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
- تحديد موقع الحقن كما هو موضح في الخطوة 4.4. قطع 1 ملم قطعة من الأنسجة التي تحتوي على موقع الحقن. إضافية كتل 1 ملم على جانبي الآفة يمكن تحضير وكذلك إذا كان المطلوب.
- في غطاء الدخان، إضافة 10 مرات حجم 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم / 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم لكل كتلة على الجليدلمدة 60 دقيقة.
ملاحظة: رباعي أكسيد الأزميوم هو مادة شديدة السمية وينبغي التعامل معها بعناية فائقة. يجب وضع جميع المواد في اتصال مع رباعي أكسيد الأوزميوم في زيت الذرة (مرتين حجم كحل رباعي أكسيد الأوزميوم) لتحييد. - غسل الحبال 3 مرات مع 0.2 M كاكوديلات لمدة 10 دقيقة في RT، ونبذ في زيت الذرة. يذوى مع حلول الايثانول متدرج (ماء، 50٪، 70٪، 90٪، 2 مرات مع 95٪، 2 مرات مع 100٪، 2 مرات مع أكسيد البروبيلين) لمدة 10 دقيقة في RT.
- الحبال تضمين في الراتنج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- قطع الكتل على مشراح مستدق وجبل أقسام على قطرات الماء على الشرائح المجهر. مكان الشرائح على طبق ساخن (حوالي 50 درجة مئوية) حتى تجف.
- تصور المايلين بإضافة بضع قطرات من 1٪ طولويدين الأزرق / 2٪ محلول البوراكس على الشرائح لمدة 10-15 ثانية عند 50 درجة مئوية. شطف مع الماء وجافة، وساترة مع وسائل الاعلام المتزايدة. أقسام الصورة على المجهر مشرق الميدان.
Representative Results
حقن البؤري للليزوليسيتين في المادة البيضاء بطني تنتج آفة المزيل للالمنفصلة التي يمكن كشفها على مسافة حوالي 3 مم (الشكل 2). تلطيخ المناعى من جوهر الآفة لالمايلين (ب ب) والمحاور (SMI312) يظهر المحاور التي تم تجريده من المايلين في 7 أيام (الشكل 3). قبل 14 يوما، ويحيط العديد من المحاور التي كتبها حلقات MBP إيجابية، مما يشير إلى وقوع عودة الميالين. تلطيخ للخلايا من سلالة دبقية قليلة التغصن (PDGFRα، Olig2، CC1)، هناك زيادة كبيرة في كل من العدد الكلي للخلايا في 14 يوما مقارنة مع 7 أيام، فضلا عن توزيع قليلة التغصن ناضجة مقارنة يجد OPCs (الشكل 4) . وتمشيا مع هذا الاستنتاج، semithin أقسام ملطخة طولويدين الأزرق تكشف عن وجود الأغماد المايلين رقيقة في 14 يوما التي نادرا ما يتم الكشف عنها في 7 أيام (الشكل 5)، مشيرا إلى أن هذه هي remyelinated طnternodes.
هذا الإجراء هو تكرار للغاية بين الحيوانات. يحدث الاختلاف عندما يغير الثقيلة في التنفس موقف ثابت من الشعرية، هذه هي عادة ليست مشكلة مع تخدير كاف. الأضرار التي لحقت محاور يبدو أن الحد الأدنى، ما عدا في مركز جدا من الآفة، التي وصفت منذ استخدام أقرب للنموذج 1. ونحن نعتقد أن هذا اصابة الميكانيكية من الزجاج الشعرية، كما هو الحال أيضا ملاحظتها في برنامج تلفزيوني حقن الضوابط. ومع ذلك، وتقلب يميل إلى أن تكون صغيرة، ونحن والآخرين باستخدام إجراء مماثل وقد كشفت الاختلافات بين ظروف تجريبية مع عدد قليل من 4 حيوانات في كل مجموعة 15.
هي الخيوط الشكل 1. جمعية حقنة عن طريق الحقن. (A) والجوز من الحقنة الحقن على ر انه نهاية شقة من الزجاج الشعرية، تليها 2 الحلقات بحيث التزاوج ينتهي التعشيق. بمجرد دافئ الشعرية بقوة في الطويق مخروطي الشكل، هو مشدود الجمعية ناحية ضيق على نهاية الحقنة عن طريق الحقن. (B) قطعة مركز قرص المطاط مع الإبرة مركزا المعادن التي تعلق على حقنة فتيلة والانزلاق إلى أسفل ل القاعدة. (C) سحب ليزوليسيتين حل في حقنة فتيلة. (D) خفض بلطف حقنة فتيلة حتى أول قطرة من ليزوليسيتين مرئيا في رأس الإبرة. (E) إدراج حقنة فتيلة في برميل من الحقن المحاقن، مما يجعل ختم حازم مع القرص المطاطي. خفض بلطف الحل حتى يتم تشغيله حتى نهاية الشعرية. سحب بعناية حقنة فتيلة مع المحافظة على الضغط على المكبس لإزالة الإبرة مركزا المعادن دون إدخال فقاعات الهواء في حقنة عن طريق الحقن.تحميل / 52679 / 52679fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الممثل ليزوليسيتين الآفة ملطخة eriochrome cyanine. أقسام المسلسل (متباعدة 400 ميكرون بعيدا) من ليزوليسيتين الآفة المميزة في 14 يوما ملطخة eriochrome cyanine لتصور المايلين (الأزرق). ملاحظة يقتصر ذلك إزالة الميالين إلى المادة البيضاء بطني وأن آفة تمتد حوالي 3 ملم في منقاري / الاتجاه الذيلية. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. محاور عصبية والمايلين فينموذج ليزوليسيتين. (A) صورية (PBS) حقن الحبل الشوكي في 7 أيام يظهر محاور صحية التي تحيط بها حلقات المايلين. (ب) ليزوليسيتين الآفة في 7 أيام معارض تعرت محاور وكذلك المايلين المتدهورة. (C) في 14 يوما، ل وترتبط نسبة من المحاور (أمثلة تدل مع السهام البيضاء) مع ظهور حلقات المايلين. شريط النطاق = 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. خلايا دبقية قليلة التغصن النسب في نموذج ليزوليسيتين. (A، C) في 7 أيام، وهناك تمثيل أكبر للPDGFRα + يجد OPCs (أشرطة بيضاء) نسبة إلى CC1 + قليلة التغصن (الحانات أرجواني)؛ الأرقام داخل القضبان تمثل النسب المئوية. تم بحثها Olig2 لتأكيد تلطيخ الخلايا النسب دبقية قليلة التغصن. (B، C) في 14 يوما، وهناك زيادة كبيرة في العدد الكلي للخلايا دبقية قليلة التغصن النسب مقارنة مع 7 أيام (P <0.05، ثنائي الطرف اختبار t، ن = 4 لكل مجموعة ). وهناك أيضا زيادة كبيرة في توزيع قليلة التغصن ليجد OPCs في 14 يوما مقارنة مع 7 أيام (ع <0.0001، اختبار دقيق فيشر). = شريط نطاق 10 ميكرون. يتم التقاط كل حقل في والتكبير الأصلي من 60X. القيم يعني ± SD. * يدل ف <0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. عودة الميالين في نموذج ليزوليسيتين. (A) والأزرق طولويدين مستعرضة ملطخة semithin قسم من المادة البيضاء بطني في هيئة التعليم العاليlthy الماوس يظهر محاور على مجموعة واسعة من عيار مع سمك المايلين المعنيين. (B) في 7 أيام، ويلاحظ عدم وجود الأغماد المايلين المتاخمة للمنطقة لم تتأثر (أسفل اليمين). (C) في 14 يوما، الأغماد مياليني رقيقة ( تظهر أمثلة تدل مع السهام الحمراء) في جميع أنحاء الآفة، تدل على قطاعات remyelinated. شريط النطاق = 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وقد تم تطوير عدد من نماذج حيوانية لدراسة MS، الأكثر معترف بها التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (EAE) النموذج. في EAE، وتحصين ضد القوارض جزء من الببتيد المايلين والخضوع لتطوير الآفة التهابات يظهر في شلل تصاعدي. في حين كان هذا نموذجا مفيدا للاختبار ما قبل السريري لالمناعية المخدرات MS، فإنه ليست مثالية لدراسة عودة الميالين لثلاثة أسباب رئيسية: أولا، الموقع من الآفات الالتهابية هو عشوائي إلى حد ما، وتحديد الآفات عند معالجة الأنسجة لشبه أو سامسونج يمكن أن يكون تحديا أقسام. والثاني هو أن عودة الميالين يحدث خلال دورة زمنية محددة، وبالضبط سن EAE آفة واحدة لا يمكن أن يكون معروفا دون التصوير بالرنين المغناطيسي غير الغازية المستمر. والثالث هو أن عودة الميالين هو ظاهرة تحدث بشكل طبيعي في القوارض، ودليل على عودة الميالين التالية العلاج من تعاطي المخدرات في EAE قد لا يكون نتيجة الرئيسية لهذا العقار، ولكن فيبدلا ظاهرة الثانوية للحد من الالتهابات.
ويتحقق أسلوب شائع آخر من إنتاج إزالة الميالين عن طريق إدخال النحاس خالب cuprizone في النظام الغذائي. وهذا يؤدي إلى إزالة الميالين على نطاق واسع، وعلى الأخص في الجسم الثفني. هناك قيود في دراسة الجسم الثفني كموقع للعودة الميالين للأسباب التالية: أولا، أقطار محور عصبي (وبالتالي سماكة المايلين) هي أصغر من مناطق الجهاز العصبي المركزي الأخرى، ويمكن الأغماد بالتالي remyelinated رقيقة لا يمكن تمييزها عن تلك التي لم تكن عديمة الميلين. وثانيا، لأن الثفني الماوس الإحضار يحتوي> 70٪ محاور كمون الفعل 16، يمكن أن يكون من غير الواضح ما إذا كانت شريحة remyelinated هو إصلاح الحقيقي للتلف المايلين أو دي نوفو توليف المايلين في الكبار، والذي يحدث عادة 17.
ومن إيماننا بأن أفضل نموذج لدراسة عودة الميالين هو الحقن المباشر من السموم، وإما ليزوليسيتين، ethidبروميد البوتاسيوم، أو غيرهم، في السويقتين الدماغية الذيلية 18 أو المادة البيضاء الحبل الشوكي. ويتحقق الموقع السابق إلا عن طريق الحقن الدقيق المجسم 3-البعد، ويقتصر على القوارض الكبيرة (الفئران) نظرا لصغر حجم السويقتين للدماغ. ويستثنى من هذا المورد واسعة من الفئران المعدلة وراثيا في دراسة اجتثاث وعودة الميالين. الحبل الشوكي، ومع ذلك، يحتوي على العديد من مساحات المادة البيضاء الكبيرة التي يسهل الوصول إليها جراحيا. فراغات بين الفقرات في هذا الجزء الصدري منقاري تسمح لتعرض الحبل الشوكي دون الحاجة إلى وجود الثقب، وهي خطوة ضرورية في العمليات الجراحية الصدرية الذيلية. ميزة استهداف تحديدا المادة البيضاء البطنية هي أن محاور هي أكبر موحد من المادة البيضاء ظهري، مما يجعل القياس الكمي للعودة الميالين إلى أقل غموضا-مهمة مماثلة للتحديات المرتبطة الجسم الثفني. بالإضافة إلى ذلك، المادة البيضاء بطني تشكل تي أكبر من ذلك بكثيرarget منطقة لحقن. أن عدة مئات من ميكرون أفقيا في المنطقة الظهرية تضع الشعرية خارج العمود، في حين أن نفس الانحراف سوف البطني تزال تنتج المزيل للآفة بارزة. بعض البروتوكولات حقن ليزوليسيتين في كل من ظهري وبطني الأعمدة من نفس الحيوان (19). هذا يمكن أن تزيد من احتمال وقوع التنسيب الشعرية السليم وعدد الآفات قابلة للقياس الكمي في عدد أقل من الحيوانات. في حين أن البيانات الحالية المقدمة هي بين 8-10 أسبوع الحيوانات القديمة في وقت العملية، كان لدينا أيضا نجاح باستخدام نفس الإجراء على الفئران القديمة 8-10 شهر، حيث وصفت عودة الميالين بأنها أبطأ بشكل ملحوظ 4.
الكمي للعودة الميالين ليست مهمة تافهة. والعقيدة المركزية تفترض أن قطاعات remyelinated هي أقصر في الطول وأرق في المتوسط من نظرائهم صحية، وبالتالي الحسابات ز-نسبة (قطر محور عصبي مقسوما على محور عصبي + قطر المايلين) من مستعرضة شبه سأصبحت أقسام ص سامسونج الإجراء العادي. ومع ذلك، فمن المعروف أن قطاعات remyelinated رشاقته على مر الزمن 2 و دراسة حديثة باستخدام مراسل المعدلة وراثيا من قليلة التغصن remyelinating تشير إلى أن العديد من السلاميات تصبح في نهاية المطاف تمييزه عن السيطرة 20. تحديد عدد ناضجة قليلة التغصن داخل الآفة هو وسيلة غير مباشرة لقياس إصلاح، وقليلة التغصن هي قادرة على صنع عدد كبير من السلاميات، ونسبة كبيرة من على نموذج اعتمادا عودة الميالين استخدامها يمكن أن يحدث من خلايا شوان 3. وبطبيعة الحال، كما تم ربط عودة الميالين إلى إعادة التوصيل قفزي 21، والمقياس النهائي للإصلاح سيكون الانتعاش وظيفية من العجز العصبية. في حين ارتبط عودة الميالين إلى استعادة وظيفة في بعض الأنواع 22،23، فإنه لم يصبح الإجراء القياسي في دراسات ليزوليسيتين الفئران. هذا هو الأرجح بسبب عدم وجود observ العلنيالعجز قادرة إما من الظهرية أو البطنية الآفات، مقارنة مع نماذج إزالة الميالين أكثر قوة مثل EAE وحتى cuprizone. ونحن نعتقد أن عجز وظيفي الناتجة عن ليزوليسيتين الحقن، والانتعاش لاحق مع عودة الميالين، سيكون الموثقة فقط باستخدام الاختبارات الحساسة من سير الحسية على ما يرام.
بحث في PubMed من "عودة الميالين" جنبا إلى جنب مع أي من النماذج الحيوانية المذكورة أعلاه، وإن كان الأسلوب المنهجي الفظ، ويظهر أقل يضرب البحث عن ليزوليسيتين (109) مقارنة EAE (188) وcuprizone (197). إذا حجتنا أن ليزوليسيتين إزالة الميالين هو النهج متفوقة لدراسة عودة الميالين، لماذا هو على الأقل مناقشتها؟ ربما يكون الخوف لاستخدام هذا الأسلوب مستمد من الاعتقاد الصعوبة الفنية في أداء العملية الجراحية. في واقع الأمر، وهذا الإجراء هو سريعة وفعالة من حيث التكلفة، وليس أكثر صعوبة من تشريح الأنسجة الروتينية، مما يتطلب المواد التي هي كلها commerمتوفرة cially. ويحدونا الأمل في أن هذا البروتوكول هو أمر مفيد بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في إضافة هذا نموذج قوي لذخيرتهم لدراسة حقل مثيرة وتوسيع للإصلاح المايلين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R.
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
