この原稿は、生産、特性評価および正常な初代ヒト食道線維芽細胞および脱細胞化ブタの足場内に播種した扁平上皮細胞から調製した組織工学3D食道構造物の潜在的な用途を説明しています。結果は、正常なヒトの食道に似成熟重層上皮の形成を実証します。
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この記事について
サマリー
要約
食道腺癌およびその前駆体、バレット化生の両方の発生率は、西部の世界で急速に上昇しています。さらに、食道腺癌は、一般的に、近年の生存率にはほとんど改善して、予後不良を持っています。これらは、勉強する困難な状況であり、食道粘膜の障害を調査するために、適切な実験プラットフォームの欠如がありました。
ヒト食道粘膜のモデルは、従来の2D細胞培養系とは異なり、 生体内に存在する細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用を再現すると、正常なヒトの場合と同様、成熟、重層上皮を生成する、マクニールの研究室で開発されました食道。簡単に言うと、モデルは、ブタ由来の無細胞食道足場内で増殖させた形質転換されていない正常な初代ヒト食道線維芽細胞および上皮細胞を利用します。このモデルの免疫組織化学的特性評価CK4、CK14によって、Ki67のとインボルクリン染色は、正常なヒト食道粘膜の組織学の適切な要約を示しています。
このモデルは、ヒトの食道粘膜の強固な、生物学的に関連する実験モデルを提供します。これは、簡単に薬剤の有効性と、アルコール、毒素、高温または胃食道refluxate部品などの環境要因への曝露の影響を含む研究課題の数を調査するために操作することができます。モデルはまた、最大20日間の関心のある物質に成熟した上皮の反復暴露の影響の研究を、 とりわけ可能、従来の2D細胞培養では達成できない、拡張培養期間を容易にします。さらに、このような食道腫瘍またはバレット化生に由来するものなどの細胞株、種々の、例えば、腫瘍浸潤および薬物responsiveneなどのプロセスを調査するためにモデルに組み込むことができますより生物学的に関連する環境でのSS。
概要
食道粘膜は、結合組織の層の上に層状、扁平上皮、粘膜固有層を含み、摂取環境ストレスに遭遇した最初のサイトの一つです。 duodenogastro食道逆流は、食道腺癌への進行のリスクの増加と関連しているバレット化生、の病因における重要な要因である一方、食物毒素への暴露は、食道扁平上皮癌の発症に関与しています。食道がんは、英国の男性と食道腺癌で8 番目の最も一般的な悪性腫瘍が急速に西洋世界1に増加しています。また、約15％の全5年生存率と疾患の予後でほとんど改善、がありました。したがってdeveloでこの食道上皮の環境ストレスへの曝露の影響とその潜在的な関与を調査するための実験的なプラットフォームが必要とされています化生または新生物のpment。
不死化または腫瘍細胞株は、研究者は、インビトロでこれらのストレスには、上皮細胞の応答を研究することを可能にするが、それらは、増殖性のままであり、食道粘膜の最上層上に見出される成熟上皮細胞に分化することができません。また、既に腫瘍形成を起こした細胞株は、環境要因に上皮内の正常細胞の初期応答に関する限られた情報を提供することができます。これは、治療的介入の可能性が最も高いとすることができるステージがあります。最後に、従来の細胞培養系は、上皮および間葉細胞の間でおよびインビボでの組織内で発生し、これらの細胞と周囲のマトリックスとの間の潜在的に重要な相互作用を捕捉する....
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プロトコル
ヒト食道細胞は胃や食道の手術を受けた患者から得られます。組織は、研究目的のために使用されるためにインフォームドコンセントを得て、組織が適切な倫理的承認（SSREC 165/03、ヒューマン研究の組織バンクライセンス12179）の下で匿名で使用します。
ヒト食道上皮細胞の単離1。
- 層流の組織培養フード内で作業し、無菌技術を使用して、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）および3のハムF12混合することにより、上皮培養培地を調製：1の比（V：V）を。 10％の追加（v / v）のFCS、10 ngの/ mlの上皮成長因子、0.4 / mlのヒドロコルチゾン、1.8×10 -4 Mのアデニン、5μg/ mlのインスリン、5μg/ mlのトランスフェリン、2×10 -7 Mトリヨードサイロニン、1×10 -10 Mのコレラ毒素、2×10 -3 Mのグルタミン、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.625 / mlのアムホテリシンBを
- 標準の使用滅菌技術は、T75組織培養フラスコ中に100μg/ mlのストレプトマイシンDMEM 11mlの10％FCS、2×10 -3 MのL-グルタミン、100 IU / mlペニシリン、および0.625 / mlのアンホテリシンBを入れます。同じ培地1ml中に1×10 6致死的に照....
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結果
この原稿が正常ヒト食道上皮の培養3Dモデルに、 図1に概略的に示され、必要なプロセスについて説明します。実験プラットフォームの組織学的および免疫組織化学的研究として、モデルの適合性を確認するために、正常なヒト食道扁平上皮粘膜との培養組織を比較行われています。
記載の方法により製造上皮の組織学的評価は、細胞の薄い（5〜10層にもかかわらず、正常なヒト食道（ 図2A）で観察されたものに匹敵する成熟した、多層、重層扁平上皮（ 図2B）を示します細胞は、それらが表面に向かって移動するように漸進的に平坦で、最終的に無核になってと、通常の食道用の10から20）、と比較。
増殖およびジのキーマーカーの免疫組織化学的特性評価fferentiationは、モデル上皮のミクロ解剖学が正常なヒト食道上皮に類似していることを示しています。同等のKi67発現は、基底内の細胞と即座に基底上層（ 図3Aおよび
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ディスカッション
この原稿は、食道上皮の際に環境ストレスへの暴露の影響を研究するための実験プラットフォームとして使用するのに適した生物学的に関連するヒト食道粘膜モデルの産生および特徴を説明しています。
ヒト食道粘膜モデルの成功の生産のための最も重要なステップは、次のとおりです。上皮細胞の大部分は、増殖のままであり、すでに足場上に播種する前に区別するために開始していないことを保証します。上皮の正しい成熟を確保するために、複合のための気液界面を維持します。拡張された培養期間を通して無菌性を維持します。
これにより、細胞分離のための入手可能なヒト組織の限定された量に直接足場にし、その結果細胞増殖pHを新たに単離した細胞を播種するために単一の組織試料から十分な細胞を得るために、一般的には不可能です細胞を、標準的な二次元細胞培養条件下で増殖させる場合に、ASEが必要です。これは、細胞はこの期間中に増殖ままであることを確認することが重要です。これは、培養物を完全にコンフルエントに到達させることがないことを保証する唯一の通路4までモデルのセルを使用して慎重に.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
私たちは、食道組織サンプルと私たちの仕事の支援獲得に彼らの助けのために、ミスターロジャーAckroyd氏アンドリュー·ワイマン氏とクリス·ストッダード、シェフィールド教育病院NHS財団トラストでのコンサルタント外科医に感謝しています。私たちはモデルに腫瘍細胞株を組み込んだ、彼の助けをAshrafulハクに感謝します。私たちは感謝Bardhan研究教育トラスト（BRET）とヨークシャー癌研究（YCR）からの補助金によって、この研究のための財政支援を認めます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| トリプシン | BDバイオサイエンス | 215240PBS | で0.1%w / v溶液を調製し、滅菌をろ過します。37で暖かい °使用前のCウォーターバス。 |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | ウォーム イン 37 °Cウォーターバス使用前 |
| ハムのF12 | Labtech | LM-H1236 | ウォーム 37 °C水浴場使用前の |
| 胎児の子牛血清 | Labtech | FB-1090 | |
| 上皮成長因子 | R + Dシステム | 236-EG-200 | 200を準備します200 & マイクロ;10 mM酢酸、1%FCS中のg / mlストック溶液 |
| ヒドルコルチゾン | Sigma-Aldrich | H0396 | PBSでストック溶液を準備し、使用前に滅菌をろ過 |
| アデニン | Sigma-Aldrich | A2786 | PBSでストック溶液を準備し、使用前に滅菌をろ過 |
| インスリン | Sigma-Aldrich | I2767 | 0.01 で10 mg / ml溶液を調製します。M HCl、蒸留水で1:10希釈し、使用前にフィルター滅菌 |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | 蒸留水で原液を調製し、使用前にフィルター滅菌 |
| トリヨードチロニン | Sigma-Aldrich | T2752 | 蒸留水で原液を調製し、使用前にろ過滅菌 |
| コレラ毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | 水中で原液を調製 |
| L-グルタミン | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| アムホテリシンB | Gibco | 15290-026 | ブランド名 Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | 1錠を100個に溶かします |
| コラゲナーゼA | ロシュ | 10103578001 | |
| ポビドンヨード溶液 | Ecolab | 10830E | ブランド名:ビデン |
| エタノール | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| 新生仔牛血清 | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 使用前にDMEMで原液を調製し、フィルター滅菌 |
| エタノールアミン | Sigma-Aldrich | E9508 | 使用前にDMEMで原液を調製し、フィルター滅菌 |
| ヒドロコルチゾン | Sigma-Aldrich | H0888 | 使用前にDMEMで原液を調製し、フィルター滅菌 使用 |
| O-ホスホリルエタノールアミン | Sigma-Aldrich | P0503 | 使用前にDMEMで原液を調製し、フィルター滅菌する |
| ITS(インスリン、トランスフェリン、セレン) | ロンザ | 17-838Z | 複合培地調製に使用 |
| トリプシン-EDTA | シグマ-アルドリッチ | T3924 | 37 °使用前のCウォーターバス |
| EDTA 0.02%溶液 | Sigma-Aldrich | E8008 | 37 °使用前のCウォーターバス |
| T75培養フラスコ | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml遠心分離管 | フィッシャー | 11819650 | |
| 15 mlユニバーサルチューブ | SLS | SLS7504 | |
| 180 mlポット | VWR | 216-2603 | |
| ペトリ皿 | SLS | 150350 | |
| 6ウェルプレート | VWR | 734-2323 | |
| ステンレス製リング | 自社製 - 医療グレードのステンレス鋼、内径10mm、外径20mm | ||
| スチールメッシュグリッド | 自社製造 - シートには直径0.3cmの穴があり、グリッド2 を生成するために曲げられています。cm(幅)×2cm(奥行き)×0.5cm(高さ) | ||
| KI67 | ノボカストラ | KI67-MM1-L-CE | クローンMM1。1:100で使用します。 |
| CK4 | アブカム | ab9004 | クローン 6B10。1:200で使用します。 |
| CK14 | ノボカストラ | LL002-L-CE | クローンLL002。1:200で使用します。 |
| インボルクリン | ノボカストラ | INV | クローンSY5。1:100で使用します。 |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| マウス 3T3 線維芽細胞 | ATCC-LGC | CRL-1658 | 照射(60Gy)により増殖が停止 |
参考文献
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture o....
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