Abstract
Hoogwaardige sereus ovariumcarcinoom (HGSC), de oorzaak van wijdverspreide peritoneale metastasen, blijft een zeer slechte prognose; minder dan 30% van de vrouwen in leven zijn 5 jaar na de diagnose. Het omentum is een voorkeursplaats van HGSC metastasevorming. Ondanks de klinische betekenis van deze micro-omgeving, de bijdrage van omentale vetweefsel ovariële progressie van kanker blijft weinig bestudeerd. Omentalis adipose is ongebruikelijk doordat deze structuren bekend als melkachtige vlekken, die bestaan uit B, T en NK cellen, macrofagen en progenitorcellen omringende dichte nesten van bloedvaten bevat. Melkachtige vlekken spelen een sleutelrol in de fysiologische functies van het omentum, die nodig zijn voor peritoneale homeostase. We hebben aangetoond dat melkachtige vlekken bevorderen ook eierstokkanker metastatische kolonisatie van peritoneale vet, een belangrijke stap in de ontwikkeling van peritoneale metastasen. Hier beschrijven we de aanpak die we ontwikkeld om te evalueren en te kwantificeren melkachtige plekken in peritoneal vet- en bestuderen hun functionele bijdrage aan eierstokkankercellijnen metastatische kolonisatie van omental weefsels zowel in vivo als ex vivo. Deze benaderingen zijn generalizable extra muizenmodellen en cellijnen, waardoor de studie van eierstokkanker metastase vorming mogelijk van de eerste lokalisatie van cellen melkachtige vlek structuren om de opbouw van een grote peritoneale metastasen.
Introduction
In tegenstelling tot de meest solide tumoren, worden uitzaaiingen van hoogwaardig sereuze eierstokkanker (HGSC) beperkt tot de buikholte 1. Zo zou effectieve peritoneale therapieën mogelijk te controleren of uit te roeien HGSC. Momenteel is een standaard therapeutische benadering is chirurgische cytoreductie gecombineerd met chemotherapie 1-3. Helaas is de overgrote meerderheid van de patiënten en bezwijken aan de complicaties van terugkeer van de ziekte. Deze sombere statistieken blijkt de noodzaak van een beter begrip van metastatische kolonisatie, het proces waarbij kankercellen lokaal te maken aan, gebruiken en verspreiden binnen gastheerweefsels om uitzaaiingen 2 vormen.
Het omentum is een voorkeurs vroege plaats van HGSC metastase 4-7. In tegenstelling tot andere peritoneale vet, omental vetweefsel bevat ongebruikelijke immuun structuren bekend als melkachtige vlekken, die B, T en NK-cellen en macrofagen bevatten, die een belangrijke rol spelen in de peritoneale homeosTasis 8,9. Naast hun fysiologische functies, vonden we dat melkachtige vlekken een actieve rol spelen bij eierstokkanker metastatische kolonisatie 4. In experimentele metastase assays, SKOV3ip.1, CaOV3 en HeyA8 (menselijke) en ID8 (muizen; C57BL / 6) eierstokkanker cellen zich snel thuis te melkachtige vlekken, wat suggereert dat de cellen zijn op weg naar een uitgescheiden chemotactische factor. Interessant, hebben de kankercellen niet koloniseren peritoneale vet ontbreekt melkachtige vlekken (dwz, gonadale en baarmoeder vet) 4.
Om de mechanismen reguleren melkachtige spot kolonisatie te identificeren, hebben we geoptimaliseerd xenotransplantaatmodellen dat de ondervraging van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in het tijdsverloop van metastatische kolonisatie 4 mogelijk te maken. Een specifiek voordeel van de hierin beschreven benaderingen is de nadruk op weefselarchitectuur en functie, waarmee gebruikers hypotheses in volledig geïntegreerd in vivo en ex vivo modellen van metastatic kolonisatie 4,10. Door het vergelijken van kankercel lokalisatie en groei in peritoneale vet depots die ofwel bevatten of gebrek melkachtige vlekken, kunnen de onderzoekers de relatieve bijdrage (n) van adipocyten en cellen binnen melkachtige vlekken op de accommodatie en progressieve groei van ovariumkanker cellen in fysiologisch relevante weefsels te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden gehuisvest, onderhouden en gedood volgens Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen en onder toezicht van de Universiteit van Chicago Animal Resource Center.
1. Voorbereiding dieren voor experimentele studies
- Sta dieren wennen aan nieuwe woningen en de omgeving, om te herstellen van mogelijke fysiologische effecten van transport en handling.
Opmerking: De volgende techniek is van toepassing op alle commercieel beschikbare muizenstammen. Het aantal dieren dat moet worden gebruikt voor een proef is afhankelijk van de onderzoeksopzet en moet gebeuren met raadpleging van een statisticus.
2. Identificatie en isolatie van peritoneale Fat Depots.
- Euthanaseren dieren via CO 2 overdosis en een secundaire fysische methode om de dood te bevestigen.
- Zoals oogsten peritoneale vetdepots vormt interne orgaanverwijdering (secundaire methode), make een middellijn incisie nabij de inguinale papillen door de peritoneale wand aan de inwendige organen (figuur 1A) bloot.
- Voor de omentale Vet (OM), het blootstellen omentale / pancreascomplex door uitbreiding van de milt uit de peritoneale holte met een pincet (Figuur 1C). Los omentum van de alvleesklier en de milt door nauw samen te trimmen alle weefsel verbindingen. Ervoor te zorgen dat alle resterende pancreas weefsel wordt weggesneden 4.
- Voor de Gonadale Vet (GF), een tang om de gonadale vet rond de eierstokken en accijnzen door te snijden weefsel verbindingen (Figuur 1A bovenste righ t) 4 tillen.
- Voor de Baarmoeder Vet (UF), een tang om de baarmoeder vet rond de baarmoederhoorns en accijnzen door te snijden weefsel verbindingen tillen (Figuur 1A rechtsonder) 4.
- Voor de Mesenteriale Vet (MF), snijd de verbinding tussen de dunne darm en de pylorus. Gebruik een tang om stevig greep het vrije einde vande dunne darm, en langzaam "peel" het vanaf de mesenteriale vet. Laat de mesenteriale vet van de mesenteriale wortel met het ontleden van een schaar (figuur 1A linksonder) 4.
- Voor de Splenoportal Vet (SF), tilt het distale uiteinde van de milt behulp van een tang om de dunne vette band weefsel verbinden de hilus van de milt van de pancreas bloot. Accijnzen de splenoportal vet door eerst los uit de alvleesklier, en vervolgens voorzichtig ontleden uit de milt (Figuur 1B) 4.
3. Milky Spot Identificatie Met behulp van Giemsa kleuring
- Excise omenta (zie stap 2,3) uit C57BL / 6-muizen en fixeer 5% neutraal gebufferde formaline bij 4 ° C gedurende 16 uur (O / N).
- Voor paraffine inbedding het vaste weefsel, kiest een vorm die geschikt is voor de afmetingen van het weefsel. Giet gesmolten paraffine van de paraffine reservoir om de vorm te vullen. Open de cassette en het gebruik van warm voorCEPS, de overdracht van het weefsel in de mal.
- Voorzichtig oriënteren het weefsel tijdens paraffine inbedding te langsprofielen produceren. Plaats de gelabelde weefselcassette over de vormen en druk stevig op zijn plaats. Laat de vorm afkoelen gedurende minstens 30 min.
- Snijd seriële secties (4 micrometer dik) van de met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel blok. Plaats een voorgereinigde dia onder de secties als het lint van het weefsel komt uit het paraffineblok.
- Serieel afdeling de hele omentum; verzamelen en vlekken op elke derde gedeelte voor Giemsa vlek (zie 3.6). Laat het glasplaatje met de secties aan de lucht drogen, bij voorkeur O / N bij RT. Gedroogde dia's zijn klaar voor fixatie. Vlekken op het eerste gedeelte voor hematoxyline en eosine voor vergelijkingen met Giemsa gekleurde dia's.
- Deparaffinize de dia's door twee opeenvolgende 5 min incubaties in xylenen. Hydrateren dia's door twee opeenvolgende incubaties in de volgende: 100% ethanol, 95% ethanol, en tik tenslotte water.
- Neem voldoende voorzorgsmaatregelen om de dia's van uitdroging te voorkomen. Voer alle stappen bij RT.
- Volledig de objectglaasjes onder in een Coplin pot met 5% Giemsa-oplossing (w / v bereid in leidingwater) en incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Spoel dia's in leidingwater gedurende 60 sec, de lucht drogen en monteer met dekglaasje met behulp van montage media.
- Afbeelding de gekleurde dia's met behulp van een hele Dia Scanner en proces fabrikant van software. Kwantificeren van de melkachtige vlek volume in de Giemsa-gekleurde omental secties met behulp van ImageJ software 4.
4. Voortplanting en voorbereiding van eierstokkanker cellen voor in vivo en ex vivo studies
- Pre-warme 15 ml celkweekmedium tot 37 ° C in een warmtebad. Bereid een juiste maat weefselkweekfles (bv 75 cm 2 oppervlakte) door middel van etikettering met de naam van de cellijn, passage nummer, de datum en de persoon die de bevroren voorraad voorbereid, en de datumen de persoon die het ontdooien / plating de cellen.
Opmerking: In onderzoeken van metastase dergelijke gedetailleerde informatie is van cruciaal belang, omdat de datum van de bevriezing beneden en passage nummer kan invloed hebben op de metastatische fenotype. - Met de steriele omgeving van de biologische beschermkap, pipet 10 ml medium in de T-75 kolf. Verwijder een flacon van cellen uit de vloeibare stikstof-systeem en controleer het label om het celtype te bevestigen. Ontdooien slechts één flacon van cellen in een tijd van opwarming in 37 ° C hitte bad.
- Met behulp van steriele techniek, pipet 1x10 6 ontdooide cellen in de kolf. Plaats de kolf in de couveuse om cellen te hechten. Schud de fles heen en weer om een uniforme cel suspensie te vormen.
- Plaats kolf in weefselkweek incubator handhaven op 37 ° C in 5% CO2 omgeving. Sta cellen zich te houden O / N.
- Zuig media, en te vervangen door verse voorverwarmde groeimedia. Plaats de kolf in de couveuse en alow cellen groeien. Monitor celgroei daags visuele controle per 2-3 dagen met behulp van een omgekeerde microscoop. Gebruik standaard celcultuur technieken om de passage cellen bij het bereiken van 70-80% samenvloeiing.
Opmerking: Voor experimentele testen oogsten van de cellen 70% samenvloeiing om ervoor te zorgen dat cellen actief prolifererende. - Zuig het kweekmedium en spoelen met 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Zuig PBS en voeg 0,25% trypsine / EDTA (2-3 ml van een 75 cm2 oppervlak) en incubeer 5 min bij 37 ° C. Visueel bevestigen dat de cellen losgemaakt en een gelijk volume groeimedium, en voorzichtig pipet cellen op en neer om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
Opmerking: Het is essentieel dat het kweekmedium serum bevatten zoals trypsine inactiveert. Maak minstens 2- tot 4-voudig meer cellen dan het aantal dat voor een bepaald experiment ter compensatie van cellen tijdens daaropvolgende stappen - Bepaal het percentage levensvatbare cellen in desuspensie via trypan blauw exclusietest met een hemacytometer of een geautomatiseerde celteller.
Let op: Hier alleen celpreparaten die ≥ 96% van de cellen levensvatbaar zijn. - Breng de celsuspensie uit de kolf naar een 50 ml conische buis. Pellet cellen door centrifugeren 5 min bij 1100 xg bij 4 ° C.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in PBS tot een concentratie van 2x10 6 cellen per ml.
5. intraperitoneale injectie van cellen
Noot: In onze experimenten worden muizen behandeld in een laminaire luchtstroom of bioveiligheid kast in ons barrière faciliteit om het risico van blootstelling aan pathogenen te beperken Om deze techniek duidelijk aantonen, de procedures in de bijbehorende video werden uitgevoerd in een laboratorium erkend voor dierlijke werk. Deze specifieke techniek geen dieren noodzakelijk om onder narcose. Onder goedgekeurde protocollen, voert deze technique op levende dieren. Gebruik geschikte stammen van muizen voor dit onderzoek. Bijvoorbeeld: gebruik een verzwakt immuunsysteem, athymische naakt muizen voor de studie van de menselijke eierstokkanker cellen (SKOV3ip.1 en HeyA8) kolonisatie; Gebruik immuuncompetente C57BL / 6-muizen te bestuderen van muizen ovariumkankercellen (ID8) kolonisatie.
- Belasting 500 pi van de enkele celsuspensie in de spuit en zet in de steriele bedekte 25 G naald. Dit vermindert cel afschuiving voor de injectie.
- Pick de muis door het nekvel en houd de staart met behulp van de palm en wijsvinger en zet de linker achterpoot tussen de ring en pink (wanneer de muis wordt vastgehouden met de linkerhand).
Opmerking: traumatizing buikorganen voorkomen, beperken de muis goed, zodat het niet kan bewegen tijdens het injecteren. - Stel je een lijn over de buik net boven de knieën, en zoek een punt aan de rechterkant van het dier en dicht bij de middellijn. Het punt van binnenkomst is de schedel aan en enigszins medialevan de laatste nippel.
Opmerking: Het plaatsen van de naald aan de rechterkant van de muis vermijdt de blindedarm en de kans van prikken darmen 11. - Steek de naald in de onderste laterale gebied van het muizen abdomen tot een diepte van ongeveer 0,5 cm. Trek de zuiger om te bevestigen dat de naald niet is doorgedrongen een bloedvat of ander peritoneale organen.
- Als een vloeistof wordt opgezogen gooi de spuit (en monster) 11. Een groen-bruin of geel aspireren geeft naald penetratie in de darmen of blaas, respectievelijk.
- Injecteren van het monster met behulp van langzame, constante druk. Trek de naald en breng de muis naar zijn kooi. Heeft de spuit niet recap vóór verwijdering in naaldencontainer.
- Offer muizen via CO 2 stikken en vitale organen te verwijderen op specifieke tijdstippen na de injectie.
6. Milky spot kolonisatie In vivo
- Quantitatie van kankercel lokalisatie aan melkachtige vlekken met behulp van flowcytometrie
- Isoleer peritoneale vetdepots van muizen (zie stap 2,3 - 2,7) geïnjecteerd met fluorescent gelabeld kankercellen en weefsels onmiddellijk plaats in ijskoude PBS.
- Voor deze bijzondere techniek, gewicht-match alle vet vetweefsel te omentum. Overdracht weefsel 5 ml buisjes met 1,5 ml serumvrij DMEM en 0,1% (w / v) runderserumalbumine scheiden. Pool weefsels geoogst uit drie onafhankelijke muizen een voldoende opbrengst van cellen voor flowcytometrie garanderen.
- Hak weefsels met behulp van chirurgische scharen en voeg 1,5 ml serumvrij DMEM met 0,4% (w / v) collagenase I. Incubeer het weefsel suspensie bij 37 ° C gedurende 30 min bij rotatie mengen.
- Als een optionele stap, het weefsel verder distantiëren door kauwen. In dit geval brengt het weefsel-collagenase suspensie een microstomacher zak, kauwen gedurende 10 min bij lage, roterende oriëntatievan de zakken na 5 min.
- Monsters filter door een nylon mesh filter (60 pm porie) groter vuil te verwijderen. Verzamel cellen via centrifugatie bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande fractie gooi.
- Resuspendeer de celpellet in 100 pl PBS gecombineerd met 900 ui ACK lysisbuffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Centrifugeer cellen bij 250 g gedurende 5 min en gooi supernatans.
- Resuspendeer de celpellet in 250 ul ijskoude PBS. Filter de monsters door een 60 micrometer porie nylon mesh om enkele celsuspensie te garanderen. Spoel de filter met 250 ul ijskoude PBS.
- Kwantificeren het aantal fluorescent gelabelde cellen in de populatie met een flow cytometer uitgerust met een 561-nm geelgroene laser en 585 nm / 15 nm banddoorlaatfilter. Stel de poort voor tdTomato-positieve cellen op basis van analyse van de ouderlijke cellen en / of passende negatieve controles 4.
- Kwantificering van microscopische en macroscopische metastasen
- Bij de gewenste experimentele eindpunt (s), isoleren en zij plaatst weefsels in de juiste fixatie media. Fix grotere monsters, zoals intacte gonadale, baarmoeder en mesenteriale vet depots in 10% neutrale gebufferde formaline gedurende 48 uur bij 4 ° C. Fix kleinere monsters (omental en splenoportal vet, alsmede weefselequivalenten van baarmoeder- en mesenteriale vet) in 5% neutraal gebufferde formaline bij 4 ° C gedurende 2-16 uur.
- Als alternatief, snap weefsel bevriezen door ze in een bevriezing medium zoals oktober en vallen in een geschikte hoeveelheid vloeibare stikstof.
- Transfer gefixeerde weefsels tot 70% ethanol en bewaar bij 4 ° C totdat inbedding in paraffine. Insluiten en proces weefsel, zoals beschreven in 3.2 en 3.3.
- Gebruik het H & E gekleurde coupe naar weefsels op de aanwezigheid of afwezigheid van metastasen microscopische evaluatie (dwz clusters van 50 cellen). Bevestigen thij aanwezigheid van microscopisch kleine uitzaaiingen door een secundaire methode, zoals een IHC vlek voor cytokeratine 18/08 om eierstokkanker cellen te detecteren.
- Bij de gewenste experimentele eindpunt (s), isoleren en zij plaatst weefsels in de juiste fixatie media. Fix grotere monsters, zoals intacte gonadale, baarmoeder en mesenteriale vet depots in 10% neutrale gebufferde formaline gedurende 48 uur bij 4 ° C. Fix kleinere monsters (omental en splenoportal vet, alsmede weefselequivalenten van baarmoeder- en mesenteriale vet) in 5% neutraal gebufferde formaline bij 4 ° C gedurende 2-16 uur.
7. Milky Spot Kolonisatie Ex Vivo
- Vaststelling van fundamentele ex vivo omental orgelcultuur voorwaarden
- Plaats elke omentum in een enkele cultuur plaat insert en plaats binnen één putje van een twaalf-well weefselkweek plaat met 500 ul van DME / F12 medium met 20% FCS. Handhaaf orgaan kweken bij 37 ° C in een 5% CO2 omgeving 24 tot 48 uur en / of extra tijdstippen. Gebruik drie onafhankelijke omenta (drievoud monsters) voor elke aandoening (bijvoorbeeld mediatype / tijdstip).
- Om de integriteit van de weefsels in een experimentele eindpunten te bevestigen, vast te stellen en procesmonsters zoals beschreven in stap 3. Het tellen gezonde versus necrotische adipocyten op H & E secties kunnen weefselintegriteit beoordelen. Minimaal ~ 120 cellen uit5 biologische monsters is vereist om een percentage levend weefsel aanwezige 10 formuleren.
- Om weefselfunctie, plaats omenta (n = 3) in afzonderlijke putjes van een 24-wells plaat met 500 ul van DME / F12 medium met 20% FCS meten. Laat omenta de media conditioneren bij 37 ° C in een 5% CO2 omgeving voor 24 uur, en verwijder 250 ul voor gebruik in een IL-6 ELISA-test 10.
- Ex vivo co-cultuur van de muis omentum met SKOV3ip.1-GFP-cellen
- Groeien en bereiden fluorescent gelabeld cellen zoals beschreven in hoofdstuk 4 en resuspendeer in een concentratie van 2 x 10 6 cellen per ml.
- Breng ~ 6 pi van het weefsel lijm op de membraan van de kweekinsert en laat het aan de lucht drogen. Was het membraan tweemaal met steriel water om overmatige lijm te verwijderen. Lucht drogen de membranen onder een laminaire kap.
- Accijnzen de omenta zorgvuldig en bevestig deze aan de lijm-gecoate membRane met een steriel pincet. Laat het weefsel te hechten aan het membraan gedurende 1 min voor het toevoegen media. Voeg 500 ul van de celsuspensie op elkaar omentum in elke cultuur insert. Vul het gebied rond de transwell kamer met 2,5 ml DME / F-12 10.
- Incubeer omenta met celsuspensie gedurende 6 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 omgeving. Verwijder en was de omenta met ~ 10 ml PBS zorgvuldig. Zichtbaar fluorescent kankercel foci met een geschikt fluorescent beeldvormingssysteem 10.
- Isoleer peritoneale vetdepots van muizen (zie stap 2,3 - 2,7) geïnjecteerd met fluorescent gelabeld kankercellen en weefsels onmiddellijk plaats in ijskoude PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identificatie en histologisch onderzoek van peritoneale Fat Depots
Gross anatomische dissectie maakt de identificatie van vier van de vijf primaire bronnen van peritoneale vet (figuur 1A). Kloksgewijs van het midden boven zijn: het omentum (OM; uiteengezet) zich boven de maag en de milt, de gonadale vet (GF) rondom de linker eierstok (ov), de baarmoeder vet (UF) gekoppeld aan de baarmoederhoornen (uh) en het mesenterium (MY) gekoppeld aan de dunne darm (si). De eierstok (ov), baarmoedertak (uh) en dunne darm (si) worden aangeduid als referentie. De splenoportal vet (SP) omringt de milt slagader en verbindt de hilus van de milt om de coeliakie slagader (Figuur 1B). Tenslotte wordt het omentum de maag en pancreas (figuur 1C) gevoegd. De grove structuur en de relatieve grootte van deze weefsels wordt getoond in figuur 1D. Histologisch onderzoek van the weefsels blijkt dat splenoportal en omental vet bevatten melkachtige spot [MS] structuren op het weefsel periferie, omgeven door adipocyten [A]; baarmoeder, gonadale en mesenteriale vet niet (figuur 1E).
Milky spot identificatie met behulp van Giemsa kleuring
De vergelijking van de totale melkachtige spot inhoud tussen verschillende muizenstammen, melkachtige vlek volume en het gebied aanwezig is in individuele omenta staat werd gekwantificeerd met behulp van een nieuwe methode. Zoals beschreven in Methods, een "digitale ganse berg" van de omenta werd geconstrueerd door het kleuren van elk derde gedeelte van weefsel in een 5% Giemsa-oplossing en het vastleggen van beelden van de gekleurde weefsels (Figuur 2A). Melkachtige vlekken verschijnen als regio kleuren donkerblauw (Figuur 2B). De identiteit van deze regio's melkachtige vlekken werd bevestigd in seriële secties van zowel H & E kleuring en IHC op cellen positief voor CD45, een gemeenschappelijke lymfocyt marker (
Kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van kanker kolonisatie van omentum
Een flowcytometrie-gebaseerde methode werd ontwikkeld om het aantal kankercellen aanwezig in het vet- depots na intraperitoneale injectie kwantificeren. Dit protocol is met name nuttig voor vroege kolonisatie stappen van de metastatische proces te bestuderen. Bijvoorbeeld, in figuur 3A, ID8 tdTomato-cellen werden bereid en intraperitoneaal geïnjecteerd in C57BL / 6-muizen. Op 7 dagen na de injectie (dpi) werden de adipose organen geoogst en gedissocieerd in een enkele-celsuspensie zoals beschreven in de Werkwijzen. Het aantal tdTomato cells werd gekwantificeerd met behulp van flowcytometrie (Figuur 3A, links). De omentum vertoonde een ongeveer 12-voudige toename van het aantal tdTomato-positieve gebeurtenissen opzichte van PBS- geïnjecteerde controles (Figuur 3A, rechts), maar er was geen significante toename van celpreparaten van de gonadale vet, uterine vet of mesenterium . Een aanvullende kwalitatieve IHC-benadering bleek ook dat 7 dagen na ip injectie van SKOV3ip.1 cellen vergelijkbaar kankercel lesies waargenomen in beide omental en splenoportal vet (figuur 3B). IHC voor menselijke pan-cytokeratine (pan-CK) bevestigt de aanwezigheid van kankercellen in de melkachtige vlekken. De specificiteit van IHC kleuring werd bevestigd met behulp van een IgG-controle voor de pan-cytokeratine antilichaam (Figuur 3B). ID8 eierstokkanker kolonisatie van peritoneale vetdepots werd geëvalueerd met C57BL / 6 muizen op 7 dpi. Grote kankercel laesies in de melkachtige vlekken van zowel de omentum en splenoportal vet uitgevoerd. Kleine clusters kankercellen werden af en toe waargenomen in andere vetdepots, zoals weergegeven in het deelvenster inzet. Aldus kan men toegang tot zowel het relatieve aantal en de lokatie van cellen in een bepaald weefsel.
Ex vivo test voor eierstokkanker kolonisatie van melkachtige vlekken bestuderen
Om de beperkingen van in vivo omstandigheden pakken behoud weefselsamenstelling en architectuur, optimaliseerden we een ex vivo benadering eierstokkankercellijnen kolonisatie van omental weefsels te bestuderen. Hele omental weefsels uitgesneden uit muizen met succes gekweekt ex vivo aan eierstokkanker interactie kanker te bestuderen met melkachtige vlekken. SKOV3ip.1-GFP-cellen werden gezaaid op het ex vivo gekweekte omental weefsels en gehandhaafd op 37 ° C gedurende 6 uur. GFP-positieve fluorescerende cellen zichtbaar waren in discrete foci in zowel ex vivo als in vivo (Figuur 4A). Onder beide voorwaarden, histologische verificatie met behulp van H & E kleuring bevestigde kankercel lokalisatie aan melkachtige vlekken (Figuur 4B). Bevestigende vlek gebruik cytokeratine kleuring voor kankercellen toonde de aanwezigheid van kankercellen foci binnen de melkachtige vlekken (figuur 4C). Deze gegevens tonen de haalbaarheid van het gebruik van ex vivo benaderingen voor mechanisme gebaseerde studies in vivo bevindingen aan te vullen.
Figuur 1. De relatieve locaties en structuren van de belangrijkste peritoneale vet depots. (A) Bruto anatomische dissectie die de relatieve locatie van vier van de vijf primaire bronnen van peritoneale vet. De omentum (OM, geschetst), gonadale vet (GF), baarmoeder vet (UF), mesenterium(MY), eierstok (ov), uterine hoorns (uh) en dunne darm (si) getoond (B) Splenoportal vet (SP, uiteengezet). Blootgelegd door het optillen van de milt met een pincet (C) De muis omentum getoonde ontleed. vrij van de alvleesklier om visualisatie te verbeteren D:. Relatieve formaten en structuren van weggesneden peritoneale vet; het mesenterium wordt bevestigd aan de mesenteriale wortel. E. Histologische evaluatie van peritoneale vet op de aanwezigheid van melkachtige vlekken (A) adipocyten, (MS) melkachtige plek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Giemsa-gebaseerde aanpak voor het kwantificeren melkachtige plekken in omental weefsel. (EEN); Afbeelding van sectie van hele omentum gekleurd met Giemsa. Seriële secties van omental weefsel beoordeeld door: (B) Giemsa kleuring; melkachtige plekken zijn aangegeven met zwarte pijlen (C) H & E kleuring.; en (D) IHC met anti-CD45 antilichaam aan lymfocyten in de melkachtige vlek structuur identificeren. De schaal bar is hetzelfde voor BD en geeft 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Eierstokkanker cellen preferentieel koloniseren peritoneale vet dat melkachtige vlekken bevat. Flowcytometrische analyses van omentum (OM), baarmoeder vet (UF), gonadale vet (GF), en het mesenterium (MY) geoogst uit muizen op 7 dpi van ID8- tdTomato cellen (links). Gegevens zijn weergegevenals fold-change toename van tdTomato-positieve cellen over PBS-geïnjecteerde muizen (rechts). Fout balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. ** Geeft p <0,01 in vergelijking met PBS-controles. (B) Onderzoek van weefsel met zowel standaard histologie en IHC toont vergelijkbare kolonisatie van melkachtige spots in zowel omentum en splenoportal vet (na injectie van 1x10 6 cellen in SKOV3ip.1 Naakt muizen). Secties werden geëvalueerd door H & E-kleuring. De aanwezigheid van epitheliale (kanker) cellen in de laesies werd bevestigd door IHC detectie van cytokeratine met een pan-cytokeratine (pan-CK) antilichaam. IHC met een IgG isotype antilichaam voor pan-cytokeratine werd gebruikt als controle voor het kleuren specificiteit. De schaalbalk is hetzelfde voor alle beelden en geeft 100 urn. (C) Evaluatie van ID8 eierstokkanker kolonisatie van peritoneale vet depots in C57BL / 6 muizen op 7 dpi. Klikhier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Ex vivo kolonisatie van eierstokkanker cellen omentum. De kolommen geven een vergelijking van de drie experimentele omstandigheden blijkt naïeve omenta (links), omenta van muizen die 6 uur na ip injectie van 1 x 10 6 cellen SKOV3ip.1 (midden) en omenta met SKOV3ip.1-GFP gekoloniseerd onder ex vivo omstandigheden (rechts). Naïve omenta (blanco), omenta gekoloniseerd door SKOV3ip.1-GFP van in vivo test (bijlage in vivo) of omenta gekoloniseerd door SKOV3ip.1-GFP in ex vivo kweekomstandigheden (bijlage ex vivo). Fluorescentie beeldvorming van gehele omenta voor GFP geeft zelfde kolonisatiepatroon zowel in vivo en ex vivo assays (A). H & E kleuring van seriële secties vanhet omenta van paneel A bevestigt de aanwezigheid van kankercellen gelokaliseerd in het melkachtige vlekken (B). Cytokeratine voor eierstokkanker cellen valideert de H & E kleuring (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ontwikkeling van therapieën voor uitgezaaide doelcellen vereist een mechanistisch begrip van metastatische kolonisatie, de belangrijke eerste stap in de ontwikkeling van peritoneale ziekte. Om deze problemen melden wij benaderingen die kunnen worden gebruikt om te onderscheiden hoe uniek weefsel samenstelling en architectuur van het omentum bevorderen ovariumkanker metastatische kolonisatie pakken. Onderscheidende kenmerken van onze aanpak zijn: 1) de focus op de vroege gebeurtenissen in de kolonisatie proces; 2) vergelijking van melkachtige-spot met en gebrekkige vet depots; 3) beschikbaarheid van een reproduceerbare techniek om melkachtige vlek volume in weefsels te kwantificeren; 4) beschikbaarheid van complementaire in vivo en ex vivo zal eierstokkankercellijnen kolonisatie van melkachtige spot structuren te evalueren.
Bij het uitvoeren van deze studies kwamen we realiseren dat onderzoekers vaak niet bewust zijn van de locatie van de muis omentum en het bestaan van de splenoportal dikke band, die dient als een tweede bron van milky-spot bevattende peritoneale vet. Hoewel de hierin beschreven technieken mogelijk studies stappen in metastatische kolonisatie, ze bieden alleen "snapshots" van deze processen, en niet de beoordeling van de kolonisatie in real time. Als passende gevolgd, dient de protocollen beschreven reproduceerbare resultaten op een reeks onderzoekers. Cruciaal voor het succes van deze technieken zijn: 1) Het identificeren en het ontleden van specifieke peritoneale vetweefsel als verontreiniging door andere soorten weefsel kwantitatieve gegevens verkregen uit flowcytometrie scheef; en 2) Het implementeren van geschikte stammen van transgene muizen voor de studie in kwestie. Opgemerkt wordt dat het tijdsverloop studies worden bepaald voor individuele cellijnen. Empirisch aangezien het afhangt van een aantal factoren waaronder delingssnelheid, de tijd tot tumorprogressie te nemen en metastatisch potentieel.
Naast het ontleden van de interaegen van gevestigde eierstokkanker cellijnen en hun omental micro die belangrijk metastasering zijn, kunnen de hierin beschreven techniek ook worden toegepast om het maligne potentieel klinisch afgeleide cellijnen die vroege moleculaire veranderingen herhalen in sereuze eileiders intra-epitheliale carcinomen bij het evalueren fimbriae van de eileiders 12-17. Hoewel een route voor de moleculaire progressie van deze laesies is ontstaan, worden in vivo studies nodig zijn om de biologische betekenis van specifieke veranderingen bepalen. Complementaire in vivo en ex vivo assays kunnen worden gebruikt om specifieke maatregelen in metastatische kolonisatie van omental weefsel door dergelijke model precursor cellijnen informatie uit studies kunnen sleutel voor het genereren van therapeutische hypothesen en het ontwerp van verdere preklinische studies evalueren.
Het identificeren van mechanismen die metastatische kolonisatie controle kan de preventie mogelijk te makenof de controle van metastase vorming. Bijvoorbeeld vrouwen die een verhoogd risico op het ontwikkelen van eierstokkanker 18-22 (dat wil zeggen, BRCA1 of BRCA2-gen mutatie dragers) vaak ondergaan profylactische salpingo-ovariëctomie om het risico op het ontwikkelen van peritoneale ziekte 23,24 verminderen. Helaas patiënten vaak nog te ontwikkelen HGSC vanwege de uitgroei van eierstokkankercellen aanwezigheid in het omentum en andere metastasen ten tijde van de operatie. Identificatie van de middelen die omental weefsel micro kon kankercel lokalisatie en / of groei binnen de omentum voorkomen verstoren. Dergelijke benaderingen kunnen eventueel worden gebruikt in combinatie met therapeutische middelen die ovarium kankercellen metastase vorming voorkomen of onderdrukken kanker hergroei (na chirurgische debulking).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
- Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
- Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
- Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
- Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
- Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C.
- Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
- Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
- Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
- Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
- Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
- Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hans, H. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Vang, R., Shih, I. -M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
- Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
- Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
- Kurman, R. J., Shih, I. -M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
- Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
- Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
- Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
- Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
- King, M. -C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
- Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
- Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
- Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
- Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).
