Introduction
La culture cellulaire de cardiomyocytes est un outil essentiel dans la recherche cardiaque moderne. Cardiomyocytes de rats nouveau-nés (NRCMS) sont couramment utilisés depuis l'isolement et de la culture est plus facile que celle de cardiomyocytes de rats adultes 1. Procédé CNRM a encore plusieurs limites, notamment une procédure d'isolement de long et la prolifération cellulaire limitée dans le plat. Il existe de nombreux protocoles pour l'isolement de NRCMS avec nécessitant le plus généralement 4-48 heures de travail 2-6. En outre, les cellules sont souvent isolées à partir de ratons de 1 jour à 2 vieux rats 2,4-7; le moment de la naissance peut être imprévisible et les conflits avec d'autres travaux dans le laboratoire. Les isolats peuvent être inefficace et inutile si seulement une petite quantité de cellules sont nécessaires pour les expériences. La plupart des efforts sur l'amélioration de la mise au point de flux de travail sur la réduction du temps de l'isolement, mais cela ne résout pas les problèmes de synchronisation la naissance des chiots.
Comme alternatives, de nombreux laboratoires utilisentcardiomyocytes dérivés de cellules souches embryonnaires (CSE) ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP). Cependant, le processus de reprogrammation et / ou la différenciation peut être très long et coûteux aussi bien. Il peut y avoir d'autres problèmes lors de l'utilisation de ces cellules comme des modèles in vitro des myocytes. Les deux cardiomyocytes dérivés ESC- et iPSC- ont été montré pour présenter des différences en électrophysiologie de cardiomyocytes primaires 8-10.
NRCMS dissociées sont capables d'être stockés pendant plusieurs jours en utilisant la réfrigération 11, mais cela ne permettent le stockage à long terme. L'azote liquide est typiquement utilisé pour maintenir les cellules à une plus grande période de temps, mais nécessite un cryoprotecteur tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO). Des recherches antérieures ont montré que la concentration idéale entre 5-10% de DMSO dans les médias congélation permet pour la cryoconservation des NRCMS, mais même alors, la viabilité reste faible 12. Bien que le DMSO permet de protéger les cellules pendant gratuitementzing, il peut être toxique pour les cellules à des concentrations supérieures à 1,5% 13. Des études antérieures ont montré que la suppression de DMSO lentement à partir des cellules, peut améliorer la viabilité des cellules 14.
Nous avons cherché à améliorer l'efficacité du CNRM tests cellulaires par la cryoconservation des cellules après isolement. Ceci permet aux cellules d'être décongelés et utilisés lorsque cela est nécessaire, ce qui réduit la fréquence des isolements et de la consommation des animaux. En utilisant cette méthode, on montre qu'il est possible de cryoconservation et décongélation NRCMS pour une utilisation à un moment ultérieur. Après décongélation, les cellules conservent une viabilité acceptable et produisent des cultures CNRM qui sont positifs pour les α-actinine sarcomère (α-SA) et de se contracter spontanément.
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Protocol
Le protocole suivant est conçu pour l'isolement des cardiomyocytes d'une portée de chiots de rats nouveau-nés (10-14 PUP). Si la taille des portées est sensiblement différente, la procédure peut devoir être réduite pour compenser. Les chiots doivent être âgés d'environ 48 ± 6 heures. Toutes les procédures ci-dessus ont été approuvés par la North Carolina State University institutionnel Comité de protection des animaux et d'utilisation (IACUC).
1. Isolement cellulaire Préparation
REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes le jour avant l'isolement.
- Autoclave les suivants: grands ciseaux, petits ciseaux, petites pinces pointues, de grandes pinces. Utilisez un cycle de gravité pendant 60 minutes à un minimum de 121 ° C et un temps de séchage de 30 min.
- Placer 40 ml de solution de trypsine à 0,1% dans le réfrigérateur pour décongeler O / N. Sels équilibrés Solution de Réfrigérer Hank (HBSS) si ce ne est déjà froid. Préparer un sérum fœtal bovin (FBS) solution mère de médias de 20%.
- Dans 400 ml de Iscles médias de Dulbecco modifié par Ove (de IMDM) Ajouter 100 ml de FBS, 5 ml de L-glutamine (200 mM), 2,5 ml de gentamicine (10 mg ml -1), et 0,9 ml de 2-mercaptoéthanol. Stériliser en utilisant un filtre à vide. médias Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à trois semaines et ce est évolutive pour les volumes plus petits ou plus grands. Diluer 20% de FBS stocks médias 1: 1 avec IMDM à produire 10% de FBS CNRM médias. Seulement faire en petits lots pour empêcher le chauffage et le refroidissement des médias répétée.
Isolement cellulaire 2. Jour 1
- Effectuer les travaux suivants dans une hotte de culture pour empêcher la contamination des échantillons. Pour meilleur moment commencer ce travail dans l'après-midi car il est un O / N incubation.
- Préparer espace de travail dans une hotte de culture stérile. Placez pad de banc dans la culture capot. Remplissez deux béchers de 250 ml avec 70% d'éthanol et placer les outils chirurgicaux en eux. Placez petit seau de glace dans le capot. Assurez-vous que ce est assez grand pour contenir plusieurs tubes et un plat de 150 mm. UV stériliser le capot for 10 min. Placer 40 ml 0,1% de trypsine sur la glace.
- Récupérer ratons nouveau-nés de la mère. Pour garder les animaux au chaud jusqu'à l'utilisation, placez-les dans un contenant isolé comme un seau à glace enveloppée dans un tapis de banc pour les garder au chaud.
- Remplissez une boîte de culture de 150 mm avec 25 ml de HBSS et placer sur la glace. Déballer 2-3 Les tampons de gaze et dans une zone de travail. Tenir chiot par la peau sur le dos de la nuque, le vaporiser avec 70% d'éthanol et le placer dans la hotte. NOTE: Pour mieux maintenir la stérilité, ce est peut être fait par une autre personne qui met alors le chiot nettoyé dans la hotte.
- Tenez le chiot par la peau sur le dos du cou. Ensuite, en utilisant les grands ciseaux, dans un rapide, fort découpé euthanasier par décapitation. Éponger le sang avec de la gaze. NOTE: En raison des variations dans les exigences du IACUC, il peut être plus approprié pour nettoyer le chiot avec un mélange éthanol essuyez plutôt que pulvérisation. Soyez sûr de vérifier avec l'université IACUC à leurs lignes directrices pour cette étape.
- Continuer abattre face antérieure de chHNE travers la cage thoracique. Pressez la peau sur le cou pour aider à ouvrir la cage thoracique jusqu'à ce que le cœur est visible. En utilisant les petits ciseaux, retirez le cœur et dans la boîte de culture HBSS sur la glace. Répétez l'opération pour les autres chiots.
- Retirez tout tissu non-coeur à partir des échantillons et agiter l'HBSS doucement pour laver les cœurs. Transférer le tissu cardiaque à une autre boîte de culture contenant HBSS frais et laver davantage le tissu. Coupez le tissu encore jusqu'à ce que les morceaux sont 1-3 mm 3, puis transfert à la solution de trypsine. Placez solution de trypsine sur rocker 4 ° C réfrigérateur O / N.
Isolement cellulaire Jour 2
REMARQUE: Pendant l'aspiration dans les étapes suivantes, en utilisant une pipette plutôt que d'une ligne de vide. Le tissu se déplace facilement, et une ligne de vide va se boucher ou enlever les tissus contenant encore des cellules. Il est préférable d'utiliser une pipette pour l'aspiration à la place. Si le tissu entre la pipette, une pipette arrière pour l'enlever.
- Faites un TROIS aliquotes de 10% CNRM médias: une avec 25 ml et deux avec 15 ml. Placez un tube de 25 ml de médias dans 37 ° C bain d'eau. Ajouter 4 ml de HBSS à cinq différents 15 ml tubes coniques et placez le tout sur la glace. Étiqueter chaque tube de 15 ml # 1-5.
- Ajouter 40 ml de HBSS dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 10 ml de HBSS à la collagénase, une pipette de suspendre, et combinent les solutions pour créer 50 ml de 1 mg ml -1 solution collagénase. Stériliser à l'aide de 0,22 um filtre à vide, et stocker à température ambiante.
- Récupérer coeur tube de tissu / de la trypsine. Veiller à ce que la trypsine est clair, et le tissu semble moelleux. Laisser le tissu à se installer au coin du tube et aspirer autant de liquide que possible.
- Ajouter 25 ml chaude à 10% de FBS CNRM médias pour le tube et agiter la main. Cap et tourner dans 37 ° C bain d'eau pendant 2 min. Aspirer à nouveau liquide. Le tissu doit flotter à cette étape; dans l'affirmative, aspirer à partir du fond du tube.
- Ajouter 10 ml de la collagénase. Tourner dans le bain d'eau pendant 2 min ou jusqu'à ce que la solution est trouble. Quickly aspirer le liquide. Ajouter 10 ml collagénase frais au tube contenant le tissu et faire tourner au bain-marie pendant 2 min. Pipette pour mélanger, solution de transfert au tube n ° 1, et le placer sur la glace. Il peut ne pas être possible d'enlever tout le liquide. Répétez les étapes 03.02 à 03.06 pour les trois autres tubes 15 ml coniques. Transférer tout liquide restant dans le tube n ° 5.
- Centrifugeuse tubes de 15 ml à 410 rcf pendant 8 min. Alors que la centrifugation, placer 15 ml 10% de FBS CNRM tube de médias dans un bain d'eau. Placer 40 um cellule tamis au-dessus d'un tube conique de 50 ml et humide avec 2 ml de HBSS froid.
- Aspirer le surnageant à partir de cellules centrifugé. Ajouter HBSS 6 ml froid dans chaque tube et remettre en suspension. Des suspensions de cellules de la pipette à travers le filtre dans 50 ml conique pour éliminer tout tissu. Rincer côtés de chaque tube de 15 ml avec 3 ml froide HBSS et ajouter à la crépine. Centrifuger les cellules à 410 rcf pendant 10 min. Aspirer surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml 10% des médias et le transfert FBS CNRM à T-75 flacon. Rincer conique avec les médias 5ml et ajouter à fldemander à.
- Incuber pendant 1 h à 37 ° C et 5% de CO 2. Placez dernière 15 ml 10% de FBS CNRM tube de support dans un bain d'eau. Transférer le contenu du T-75 dans un nouveau flacon T-175, T-75 rinçage avec 15 ml de milieu et ajouter à T-175. Incuber pendant 1 heure.
4. Cryoconservation
- Placez des milieux de congélation sur la glace. Transfert milieu cellulaire de T-175-50 ml tube conique, et de recueillir 10 pi de suspension cellulaire pour la cellule de comptage utilisant bleu Trypan. Centrifuger à 410 rcf pendant 5 min. Alors que la centrifugation, compter les cellules en utilisant un compteur de cellules.
- Aspirer les médias, la culture et remettre les cellules dans des milieux de congélation à une concentration de 2-4 millions de cellules par ml. Placer 1 ml de suspension cellulaire en flacon cryogénique, puis placer les cuvettes une vitesse contrôlée de refroidissement gel contenant, et le placer dans le congélateur à -80 ° C O / N. Dans 1-2 jours, transférer flacons dans l'azote liquide.
5. Cellules de décongélation
- plat de Coat dans la fibronectine en dissolvant 250 pi60; de la fibronectine (stocks concentration 1 mg ml -1) dans 9,75 ml d'eau (concentration finale 0,025 mg ml -1). Ajouter suffisamment de solution pour couvrir plaque de culture et incuber à 37 o C pendant au moins 30 min.
- Dans quatre tubes de 15 ml coniques, faire les mélanges DMSO / médias comme suit en ajoutant du DMSO à 20% Media. Ajouter (5%) 9,5 ml de milieu avec 500 ul de DMSO. Ajouter (2,5%) 9,75 ml de milieu avec 250 pi de DMSO. Ajouter 10 ml de milieu (faire deux de ces éléments).
- Chauffer les mélanges mentionnés ci-dessus dans des médias 37 ° C bain d'eau. Éliminer les cellules de l'azote liquide et placer sur de la glace sèche. Lorsque des mélanges des médias sont chaleureux, dégeler cellules dans 37 ° C bain d'eau jusqu'à ce que juste décongelés. Ne laissez pas les cellules dans un bain d'eau pendant trop longtemps car cela peut causer des dommages aux cellules.
- Transférer le contenu du flacon cryogénique à 5% le tube DMSO / médias. Centrifuger à 410 rcf pendant 8 min. Aspirer le surnageant laissant culot cellulaire. Ajouter le contenu du tube de 2,5% DMSO / multimédia à culot cellulaire et resuspend. Centrifuger à 410 rcf pendant 8 min. Aspirer le surnageant laissant culot cellulaire.
- Ajouter le contenu d'un tube de 0% DMSO / multimédia à culot cellulaire et remettre en suspension. Centrifuger à 410 rcf pendant 8 min. Aspirer le surnageant laissant culot cellulaire.
- Ajouter le contenu de la seconde 0% de DMSO / médias à culot cellulaire et remettre en suspension. Prenez petit échantillon pour le comptage cellulaire. Centrifuger à 410 rcf pendant 8 min. Alors que centrifugation cellules de comptage dans un hémocytomètre en utilisant bleu Trypan pour marquer les cellules mortes. Montant de la cellule d'enregistrement, ainsi que la viabilité.
- Aspirer le surnageant laissant culot cellulaire. Remettre en suspension dans 10% CNRM médias (en option: ajouter 100 uM bromodésoxyuridine (BrdU)) et cellules de la plaque sur les plats revêtues de fibronectine.
6. Culture Cellulaire
- cellules de la plaque à environ 100k cellules par cm 2. Ajuster la densité de placage sur la base de l'utilisation prévue de la culture. Préparer 2% CNRM médias par dilution 20% des médias en IMDM dans un rapport de 1:10. Ce qui suit est un aperçu d'une culture typique. </ Li>
- Au jour 1, rincer les cellules mortes loin avec IMDM tiède, ajouter 10% CNRM (en option 100 uM BrdU). Le jour 2, rincer les cellules mortes loin avec IMDM tiède, ajouter 10% CNRM. Jour 3 ajouter 2% CNRM. Le jour 4 ajouter 2% CNRM. Au jour 5 en sorte que les cellules soient confluentes et de battre. Maintenir les cellules en culture pendant une semaine environ. À ce moment fibroblastes peuvent commencer à dépasser significativement les NRCMS.
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Representative Results
Après l'isolement des cardiomyocytes de rats nouveau-nés, les cellules sont congelées à l'azote liquide, et peuvent être stockés pendant au moins plusieurs mois. Généralement lors de la décongélation, la viabilité déterminée par analyse bleu Trypan sera comprise entre 40-60%. Bien que ce soit plus faible que d'autres types de cellules, l'ensemencement et la culture appropriée les cellules prolifèrent (Figure 1). Afin de vérifier la contractilité, les cellules peuvent être imagés en utilisant une microscopie à contraste de phase. Les cellules devraient commencer à se contracter spontanément dans environ trois jours (figure 2). Par immunocytochimie (ICC) les dosages, les cellules ont été étalées dans des lames de culture quatre puits avec 200 000 cellules par puits. Afin de montrer que les cellules en culture sont NRCMS les cellules ont été marquées avec α-SA et imagées par microscopie à fluorescence. Il existe de nombreuses cellules positives α-SA indiquant NRCMS dans la culture (Figure 4). D'autres expériences ont été réalisées, y compris culNRCMS de Turing avec exosomes dérivés de cellules souches cardiaques humaines pour tester des propriétés régénératrices de exosomes (figure 5).
Figure 1. CNRM prolifération En image de microscopie de fluorescence du CNRM avec coloration pour α-SA (vert), Ki67 (rouge) Vitro., Et DAPI (bleu) pour les deux (A) NRCMS fraîchement isolés et (B) cryoconservés de NRCMS puis décongelés. Flèches indique cellules proliférantes (ki67-positif). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La contraction des cryoconservés et décongelés CNRM In Vitro. NRCMS spontanetraitance ment in vitro. Contrairement NRCMS fraîchement isolés, cela peut prendre quelques jours avant la contractilité est récupéré. Vidéo ont été enregistrés cinq jours après décongélation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Figure 3. La contraction du CNRM fraîchement isolés in vitro. Fraîchement isolé NRCMS contracter spontanément in vitro. Ces cellules vont commencer à présenter la contractilité beaucoup plus tôt. Vidéo ont été enregistrés trois jours après l'isolement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Figure 4. La pureté du CNRM Culture. </ Strong> Images de fluorescence au microscope de deux (A) NRCMS dans la culture et (B) cryoconservés décongelés et NRCMS fraîchement isolés après 5 jours de culture. NRCMS montrent une coloration positive pour les α-SA (vert), alors que les fibroblastes peuvent être vus où noyaux (bleu) ne sont pas entourés par α-SA. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Utilisation de dégelé CNRM pour Cell-Based Assay. Image de microscopie confocale de NRCMS, mis en évidence par α-SA (vert), incubées avec des exosomes Dil-marqués (rouge) à partir de cellules souches cardiaques. Les noyaux cellulaires marqués au DAPI (bleu). Afin de créer un modèle de stress oxydatif, NRCMS ont été traitées avec 100 uM de peroxyde d'hydrogène pendant 18 heures, avant d'être incubées avec exosomes pour 4 heures d'inverser les stress oxydatif. Les flèches indiquent les régions de concentrations élevées d'exosomes dans certaines cellules. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole permet de les NRCMS à être isolées, cryoconservées et décongelées. Décongélation des cellules est une partie cruciale de la procédure. Une série de dilutions de DMSO est utilisé pour éliminer le DMSO lentement à partir des cellules 14. Il est important que l'extraction de DMSO être effectuée rapidement que les cellules sont particulièrement sensibles à la mort immédiatement après la décongélation. Si des cellules plus ou moins sont nécessaires pour la décongélation, les volumes des solutions de DMSO peuvent être mises à l'échelle en fonction des besoins.
Un défi pour CNRM isolement et la culture est la prolifération rapide des fibroblastes. Ce protocole utilise prédépôt qui a été montré pour réduire le nombre de fibroblastes 15. Prédépôt œuvres en utilisant des flacons non couchés à laquelle les fibroblastes attachent beaucoup plus rapide que les cardiomyocytes. La séquence des changements de médias peut être modifiée pour réduire la croissance des fibroblastes. Les fibroblastes grandissent NRCMS à 10% CNRM médias, mais la croissance des fibroblastes est significativement plus lente chez 2% med CNRMia. Il ya d'autres méthodes telles que des gradients de Percoll pour supprimer fibroblastes avant le placage 16,17 ou l'ajout de BrdU à ralentir la croissance des fibroblastes 3. Croissance des fibroblastes excessive peut être difficile à détecter en utilisant la microscopie de phase, mais il est facilement démontré en utilisant CNRM de coloration spécifique tels que α-SA (Figure 3). Se il reste croissance des fibroblastes excessive, le montant de FBS dans les médias peut être réduite à 2% de FBS le jour 2. Si nécessaire, le placage peut être fait en 5% de FBS, si cela peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire.
Cette procédure est limitée et ne est plus bénéfique si vous utilisez des cultures de cellules qui nécessitent de grandes quantités de cellules 18,19. Dans les cas où la quantité de cellules nécessaires approche de la moitié quantité de cellules possibles à récolter à partir d'une litière, cette procédure nécessitera plus d'animaux depuis environ la moitié des cellules sont perdues en raison de la cryoconservation. Les avantages de cryoconservation sont plus importants lorsque utilisant moins cells pour des dosages tels que immunocoloration.
Ce protocole illustre les méthodes pour l'isolement, la cryoconservation, et suivants du NRCMS. Il existe peu d'alternatives, telles que l'achat cellules congelées de fournisseurs, à l'utilisation de cette méthode, mais les cellules d'achat peuvent être prohibitif pour certains laboratoires. Nos méthodes ne nécessitent des matériaux et des réactifs couramment utilisés dans la culture cellulaire. En outre, l'utilisation de ces méthodes peut augmenter considérablement l'efficacité et la flexibilité du travail en laboratoire tout en réduisant l'utilisation des animaux de laboratoire. Les procédés décrits produisent des cultures viables qui peuvent être utilisées pour la suite des études in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
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