Abstract
I virveldyr, er hematopoiesen regulert av induktive microenvironments (nisjer). Likeledes, i virvelløse modellorganisme Drosophila melanogaster, induktive microenvironments kjent som larve Hematopoetiske Pockets (HPS) har blitt identifisert som anatomiske områder for utvikling og regulering av blodceller (hemocytes), spesielt av den selvfornyende makrofag avstamning. HPS er segmentvis gjentas lommer mellom epidermis og muskellagene av larven, som også består av sensoriske neuroner i det perifere nervesystem. I larve, er bosatt (fastsittende) hemocytes eksponert for anti-apoptotiske, klebende og proliferative signaler fra disse sensoriske nevroner og eventuelt andre komponenter i HPS, som for eksempel foring muskel og epitel-sjikt. Under normal utvikling, gradvis frigjøring av fastboende hemocytes fra HPS brensel befolkningen i sirkulerende hemocytes, som kulminerer i utgivelsen av most av de fastboende hemocytes i begynnelsen av metamorfose. Immun overgrep, fysisk skade eller mekanisk forstyrrelse utløse tidlig frigjøring av fastboende hemocytes i sirkulasjon. Bryteren av larver hemocytes mellom fastboende steder og sirkulasjonen øker behovet for en felles standard / prosedyre for å selektivt isolere og kvantifisere disse to populasjoner av blodceller fra enkelt Drosophila larver. Følgelig beskriver denne protokollen en automatisert metode for å frigjøre og kvantifisere bosatt og sirkulerende hemocytes fra enkelt larver. Fremgangsmåten muliggjør ex vivo metoder, og kan være tilpasset til å tjene en rekke utviklingsstadier av Drosophila og andre virvelløse organismer.
Introduction
Forskning i virvelløse modellen Drosophila melanogaster har drevet oppdagelsen av medfødt immunitet 1, og har lagt til rette forståelsen av ulike aspekter av blodcellenes utvikling 2-4. Drosophila hematopoiesen kan deles inn avstamning av embryonale / larve hemocytes, som stammer i embryo og ekspandere i larven, og avstamning av lymfekjertel hemocytes 4,5. Her presenterer vi en protokoll som fokuserer på linjen av embryonale / larve hemocytes, som i Drosophila larve består hovedsakelig plasmatocytes (makrofager) og få krystallceller 4. I larven, hemocytes av embryoet vedvarer og kolonisere segmentvis gjentatte og terminal Hematopoetiske Pockets (HPS) som ligger mellom epidermis og muskel lag av larvekroppen veggen 5,6. Basert på deres natur som selvfornyende makrofager 6, deres dominerende bolig i lokale vev microenvironments 6, 7, og deres slektslinje fra de tidligste blodcellene vekstutvikling under 6,8, denne blodcellepopulasjonen anses lik virveldyr selv-fornyende vevsmakrofager, en uavhengig myeloide cellelinjen nylig identifisert i en rekke arter 4,9,10. Men i Drosophila, noen eller alle av disse residente celler fra viser også plastisitet for å gi opphav til andre blodcelletyper som for eksempel krystallcellene 11,12.
Larve hemocytes er hovedsakelig bosatt (fastsittende), men er i en dynamisk steady-state mellom ulike HPS. De blir gradvis frigjort i sirkulasjonen, spesielt som 3. instar larver nærmer pupariation 5-7. Immun utfordringer, skade eller mekanisk forstyrrelse føre til en for tidlig, i sistnevnte tilfelle reversible, mobilisering av bosatt hemocytes inn hemolymph 4,6,13.
Tidligere studier har antydet at beboeren og sirkulerendelarve hemocytes er av samme avstamning, men varierer i sine klebende eller homing egenskaper 6,7,13,14. Selektiv isolering av sirkulerende versus bosatt hemocytes avslørt forhøyede nivåer av spredning i de fastboende hemocyte befolkningen, noe som tyder på deres eksponering for induktive signaler fra HPs 6. Drosophila larve HPs er omgitt av epidermis og muskellagene og videre havnen sensoriske nervecellen klynger av det perifere nervesystemet (PNS) og leverfunksjonen likner oenocytes 6. Funksjonelt, har mutant og genetiske celle ablasjon eksperimenter viste at sensoriske nevroner stede i HPs støtte trofisk overlevelse og lokalisering av larver hemocytes 6.
Her beskriver vi en fremgangsmåte for spesifikk isolering og kvantifisering av beboer og sirkulerende hemocytes fra enkelt Drosophila larver, og en protokoll for mekanisk hemocyte mobilisering. Metodene som kan anvendes for ex vivo-Studiet av hemocytes, og kan videre tilpasses andre Drosophila utviklingsstadier som puppe og voksen, og andre virvelløse systemer. Siden tidligere studier ikke skiller mellom beboer og sirkulerende hemocytes, gir denne protokollen en felles standard for studier av fastboende blodceller, og vil bidra til å øke konsistensen av virvelløse blodceller forskning.
Først beskriver Hemocyte Bleed / Skrap analysen differensial isolasjon og automatisert kvantifisering av fluorescerende protein-merket bosatt og sirkulerende hemocyte populasjoner fra enkelt Drosophila larver; protokollen gir to alternativer for regelmessige og flis skanne utstyrte mikroskoper (figur 1). Som et resultat, er den prosentandel av sirkulerende hemocytes og det totale antall hemocytes per larve oppnådd. Metoden baserer seg på transgene Drosophila larver som uttrykker fluorescerende protein blant sine blodlegemerbefolkning. Valget av hemocyte driver eller reporter avgjør utfallet, dvs. som populasjon av blodceller er visualisert og kvantifisert. Å merke hovedsak makrofager (plasmatocytes), som utgjør det store flertallet av de fastboende og sirkulerende hemocyte befolkningen i Drosophila larve 6, egnede transgener inkluderer HML Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, Pxn -GAL4 16, Crq-GAL4 (ved H. Agaisse 16), eller eater-GAL4 17; for merking av relativt liten bestand av krystall celler, egnede linjer er BcF6-CFP og -GFP 18, eller LZ-GAL4 (av J. Pollock 19), for merking lamellocytes, en spesialisert celletype i hovedsak forårsaket av immun utfordringer og skader 13, f.eks kan MSNF9mo-mCherry brukes 17. Noen transgene driverne er uttrykt i en rekke differensiert blodceller og stamfedre, som han - GAL4 20, som etiketter ca 80% av alle larveblodceller 20. Vær oppmerksom på at i alle tilfeller der GAL4 driverne er brukt, sammen med UAS-GFP eller annen fluorescerende protein UAS-transgenet er nødvendig. I Resultater seksjonen, blir denne metoden brukt til å overvåke blodcelletall og sirkulasjon oppførsel i løpet av larveutviklingen.
For det andre beskriver Hemocyte Forstyrrelse analysen et foregående trinn laget for å løsne fastboende hemocytes av ekstern manipulasjon, som senere gjør evalueringen av evne til hemocytes å re-holde og hjem til HPs innenfor en begrenset tidsramme (30 - 60 min) 6. Vanligvis er denne analysen er etterfulgt av Lufte / Skrap-analysen for å bestemme prosentandelen av sirkulerende hemocytes per larve. Vi presenterer en forenklet protokoll for denne analysen (figur 1D), som bruker forstyrrelse ved virvling with glassperler, snarere enn manipulering av enkelt larve med en pensel som tidligere beskrevet seks. I Resultater seksjonen, blir denne analysen anvendes for å demonstrere at forbigående frittliggende hemocytes flyter i hemolymph og kan utvinnes i fraksjonen av sirkulerende hemocytes. Analysen er også nyttig å kvantifisere forskjeller i hemocytes i deres homing / vedheft til bosatt områder, sammenligner for eksempel ulike genetiske bakgrunn eller stimulerings forhold. Vær oppmerksom på at dette mekanisk manipulasjon reflekterer en reversibel prosess og er forskjellig fra infection- eller skade-indusert bosatt hemocyte mobilisering, noe som vanligvis ikke er reversible i et kort tidsperspektiv 4,13.
Protocol
1. Hemocyte Bleed / Skrap Assay
- Utarbeidelse av lysbilder:
- Alternativ 1 for mikroskoper uten flis skannefunksjon: For hver larve som skal analyseres, fremstille en glass-slide med ca 5 Pap-pen brønner på 2 mm ruter hver svarende til feltet visningsområdet av mikroskopet; fyll omtrent 5 - 10 pl av S2-media til hverandre (figur 1 A). Hold lysbilder i fuktig kammer for å forhindre brønner tørker ut.
- Alternativ 2 for mikroskoper med flis skanning funksjon: For hver larve som skal analyseres, forberede ett glass lysbilde med 3 til 4 Pap-penn brønner på ~ med 3 - 4 mm ruter hver; fyll omtrent 15 - 20 pl av S2 media til hver brønn (figur 1B). Hold lysbilder i fuktig kammer for å forhindre brønner tørker ut.
MERK: Ovennevnte anbefales antall brønner er tilstrekkelig for summer på opp til 3000 hemocytes per larve (sent 2. stadium larver, ~ 2,5 til 3 mm lengde, transgen merking flertallet av Larval blodceller). Ved vurdering av større blodcelletall, kanskje flere brønner være nødvendig for å unngå over-crowding.
- Innsamling av larver:
- Sprute vann inn i en flue hetteglass som inneholder larver og flush larver i en petriskål, eller scoop litt mat som inneholder larver i en petriskål og fortynnet med vann ved hjelp av en skvett flaske.
- Forsiktig plukke larver ut av petriskålen ved hjelp av en pensel og legg dem i vann i et hulrom tallerken eller på et lysbilde på en kald blokk.
MERK: Larvene kan holdes i en begrenset tid i vann eller på en kald blokk; bruke prøvene innen 45 min eller mindre for å unngå larve død eller uønskede effekter på hemocytes.
- Disseksjon:
- Velg larver under et fluorescensmikroskop på en kald metallblokk. Måle størrelser og bilde larver hvis ønskelig.
- Isolering av sirkulerende hemocytes ("Bleed"):
- Når larvene er valgt, plasserer en larve i første Pap-pennen godt (figur 1C,2A).
- Bruk 2 rene nåler eller dissekere saks og pinsett til å gjøre et snitt på både bakre og fremre ender av larven. For å unngå å forstyrre bosatt hemocytes, er det best å gjøre disse snittene på ventral side av larven. For konsistente resultater, gjøre snitt i de samme stedene for hver larve. For en st stadium larver, er nok en snitt (i ventral anterior).
- Tillat larve å blø i noen sekunder uten noe press eller fysisk agitasjon (Figur 2A).
MERK: Hvis du arbeider på flere larver det er bedre å gjøre disse snittene for hver enkelt før du går videre til neste trinn for å unngå å holde larver på is for lenge som kan påvirke prøvene integritet. - Løft forsiktig larven med nåler eller pinsett og dypp den i den andre brønnen å skylle eventuelle gjenværende sirkulerende hemocytes. Etter det følger med utgivelsen av fastboende hemocytes.
- Forsiktig overføre larven til neste brønn (Figur 2C).
- Identifiser lymfekjertel av larven, som typisk ligger omtrent 1/3 fra den fremre enden av larven, og som kan fluorescere dorsalt gjennom larvekroppsveggen. Unngå lymfekjertel mens slippe bosatt hemocytes ved låsing ned larven med en nål så nær som mulig til lymfekjertel å unngå punktering (figur 2C).
MERK: Under normal utvikling modningen av lymfekjertel hemocytes er forsinket i forhold til larver hemocytes, og fluorescerende reportere av differensierte hemocytes kan ikke vise et signal i lymfekjertel unge larver. I slike tilfeller må betales til lymfe kjertel som ingen forurensning av differensierte fluoresceinmerkede larve hemocytes av lymfe kjertel hemocytes forventes mindre oppmerksomhet. - Slipp bosatt blodlegemer i en dissectipå prosessen med skraping og / eller jabbing. Bruk en needlepoint å effektivt peke ut larven nær lymfekjertel (se ovenfor) eller andre områder på kroppen etter behov. Bruk en annen nål til å stikke på klynger av hemocytes som er synlige gjennom larvekroppen veggen (figur 2C, E), med formål å skille hemocytes. Hemocytes kan også bli utgitt i en skrapende bevegelse. Men rive epidermis tidlig kan frigjøre store klynger av blodceller, som kan gjøre automatisert telling mer utfordrende.
MERK: Avhengig av alder og genotype av larven, vil det totale antallet hemocytes variere. Distribuere utgivelsen prosessen beskrevet ovenfor over flere brønner for å unngå overbefolkning av noen brønner med blodceller, som kan gjøre enkelt celle bildeanalyse vanskeligere. - Hvis noen hemocytes forblir i den endelige carcass, teller disse hemocytes ved observasjon gjennom et mikroskop og bruk av en manuell opptelling teller (figur 2E). For å lette telling, psnøre skrotten på et rent område med samme lysbildet og spre den så tynt som mulig for å redusere antallet optiske plan.
- Når disseksjon er fullført, vente på mellom 5 - 10 min for å få cellene til å slå seg (men ikke nødvendigvis over) før avbilde brønnene. Inkuber lysbilde i en fuktig kammeret for å unngå uttørking, og unngå hardhendt behandling av skinnene, noe som kan forstyrre de bosatte hemocytes.
MERK: Når du bestemmer hemocyte teller, er utgitt cellene ikke løst, og cellene må bli fotografert kort tid etter disseksjon, helst innen 30 min etter løslatelse fra larven. Avhengig av volumet av medium og celleegenskaper, vil de aller fleste celler har slått seg ned innen 5 - 10 min, noe som bør bekreftes ved fokusering gjennom optisk plan av mediet i brønnen. Imidlertid vil bare en brøkdel av blodceller har levd opp til raset overflaten på denne tiden, noe som må vurderes hvis du endrer denne protokollen for celle fiksering baserte approaches.
- Ta bilder av de bosatte hemocytes under et fluorescerende mikroskop (figur 2B, D, F). Følg med kvantifisering av hemocytes bruker ImageJ programvare.
- Forbered bilde for ImageJ celle telling algoritme:
- Åpne bilde av brønn med ImageJ: Fil → Åpne → (finne filen og velg).
- Sørg for at bilde (r) er 8-bit eller 16-bit. Justere terskelen for bildet ved å velge Bilde klikk deretter Juster og velg Threshold. Observer "Threshold vinduet" (figur 3A).
- Sjekk "Mørk bakgrunn" alternativet. Velg "Red" og øke lavere terskel nivå (se svart pil) til hver celle i bildet er merket med en rød prikk (celler som ikke blir dekket vil bli sett i gråtoner, figur 3B). Som lavere terskeløkes noen celler vil bli merket. Dette kan være indikator for hvor langt for å sette lavere terskel.
MERK: Av og til klynger av celler kan ikke løses og vil bli regnet som en av partikkelteller. I slike tilfeller kan antallet celler i en klynge bli estimert ved å undersøke bildet (zoome inn om nødvendig), og manuell telling ved hjelp av et telleapparat teller. Alternativt kan den nedre terskel økes for å løse klynger av celler; eventuelle umerkede celler som følge av denne manipulasjonen kan så telles ved hjelp av et telleapparat teller.
- Analyser celle nummer hjelp ImageJ:
- Start Particle Analyzer å telle celler (Figur 3C). Velg Analyser og klikk på Analyser Particle. Eventuelt velg "Overlay Outlines" for å se partiklene algoritmen count (Figur 3D). Alternativt sette en grense for størrelsen eller pikselområde av en enhet (f.eks., Celle, klump av celler, etc.) for algoritmen til å telle.
- Klikk på OK. Observere en sammendragsvindu med greven (Figur 3E).
2. Hemocyte Forstyrrelse analysen
- Å forstyrre hemocytes, velger larver og plassere dem i en 2 ml mikrosentrifugerør med ca 0,5 g glassperler (212 - 600 nm) og tilsett 0,5 ml vann.
- Vortex tube, for hånd, ved hastighet 10 i 1 min.
- Hente larvene fra glassperler ved å søle innholdet i mikrosentrifugerør i en petriskål og plukke ut larvene med en pensel.
- For restitusjonsfasen, legger larver i tidligere utarbeidet petriskåler med små mengder fly mat. Tillat larvene for å re-etablere sin hemocyte mønster i en periode på 45 minutter eller etter behov.
MERK: Kast alle larver som har sluttet i bevegelse, som de har dødd i prosessen. Men vi vanligvis ser little skader etter en min av virvling (se nedenfor og Opplysning figur 1). - Etter hvileperiode, fortsetter du med Bleed / Skrap analysen som beskrevet ovenfor i punkt 1.
Representative Results
For å illustrere typiske utfall av de beskrevne metoder, vi brukte først Hemocyte Bleed / Skrap analysen å skissere utviklingen av larver hemocyte tall og deres bolig i løpet av larveutvikling (figur 4). Resident og sirkulerende larve hemocyte populasjoner ble isolert fra enkelt larver (HML Δ-GAL4, UAS-GFP; He-GAL4 å merke det store flertallet av larver hemocytes) og kvantifisert ved hjelp ImageJ. Kohorter av larver størrelse 1,2 mm (~ 48 hr AEL eller en st stadium), 2,5 mm (~ 80 hr AEL eller sent 2. stadium), og 3,5 mm (~ 96 timer AEL eller 3. stadium) ble undersøkt (figur 4) . Hemocyte tall utvidet i løpet av larveutvikling, samkjøre med og overgå tidligere estimater basert på lysmikroskopi av fargestoff farget larver 7 og live telling av fluorescerende protein merket hemocytes gjennom larve cuticle 6. 1 m instjære larver nesten alle hemocytes var hjemmehørende, samtidig som den fraksjon av sirkulerende hemocytes gradvis øket i løpet av larveutviklingen (figur 4B, C), i samsvar med tidligere publikasjoner 6,7.
Neste vi undersøkt om metoden overvåker trofast overgangen av hemocytes mellom de fastboende og sirkulerende populasjoner. Å dra nytte av fenomenet som bosatt hemocytes kan forbigående enebolig ved mekanisk forstyrrelse og de re-overholde sine bosatt områder spontant 6, vi spredt bosatt hemocytes ved å virvle med glassperler som er beskrevet i Hemocyte Forstyrrelse analysen. Faktisk, mekanisk forstyrrelse av larver ført til en dramatisk økning i bestanden av sirkulerende hemocytes på bekostning av fastboende hemocytes (figur 5). Etter en hvileperiode på 45 min, hadde hemocytes stor grad tilbake til sin tilhenger tilstand, både ved visuell inspeksjon og ved somvurderte artene andel av sirkulerende celler (figur 5D, E). Som forventet, forble totalt hemocyte tallene stabile over tid, til tross for skifte av hemocytes mellom de sirkulerende og bosatt populasjoner.
Flere andre hensyn ble tatt hensyn til. For å bekrefte at virvling ikke forårsake vesentlig vevskade, virvling med glassperler ble utført i nærvær av trypan blått (Sigma) i forskjellige tidsperioder (1, 5, 20 min). Både 1 og 5 min virvling ikke forårsake noen åpenbar vev avbrudd, mens 20 min virvling resulterte i små områder av skade, likner skader forårsaket av nål masker brukt som positiv kontroll (Opplysning figur 1). Mens indre skader av epidermis eller annet vev uten hårstråene skaden ikke kan utelukkes, synes dette scenariet heller usannsynlig som hemocytes av 1 min og 5 min behandlet larver re-levd i den forventede mønster og tidsramme, noe som tyder på larve integritet var ikke kompromissd (Opplysning figur 1). I motsetning til dette, larver vortex-blandet i 20 min lidd av mangel på re-adhesjon, og ikke engang viser festing av sirkulerende hemocytes til epidermale sår områder, slik det er blitt beskrevet tidligere 14.
Til slutt, for å demonstrere reproduserbarhet av fremgangsmåten, sammenlignet vi biologiske replikater av 2,5 mm larver fra de to ovennevnte eksperimenter, som ble utført av forskjellige forskere. Som illustrert i Supplemental figur 2, begge kullene viste sammenlignbare totale antallet hemocytes per larve, og prosentandelen av sirkulerende hemocytes. Student t test viste ingen statistisk signifikante forskjeller, noe som tyder på at fremgangsmåten er reproduserbar og bredt anvendelig.
Figur 1. Hemocyte Bleed / Skrap og Forstyrrelse analysen s etup og skjematisk. (A) Enkeltbilde Slide Setup: fem 2mm rutene for avbildning med en 5X objektiv (B) Tile Scan Slide Setup. Fire 3 mm rutene for bildebehandling bleed / skraper av ≤2.5 mm larver med en flis skanning mikroskop. Anbefalte mål for bildebehandling er 5X eller 10X. (C) Luft / Skrap Analyseskjematiske og følge quantifications bruker ImageJ. (D) I Forstyrrelse analysen, er hemocyte mønster mekanisk forstyrret ved å virvle larver med glassperler. Larver får lov til å komme seg i løpet av en periode på 45 minutter i løpet av hvilken hemocytes gjenholde de Hematopoetiske lommer. Klebende egenskaper hemocytes kan vurderes ved denne metoden, kvantifisere andelen hemocytes i omløp etter forstyrrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bleed / Skrap analysen å frigjøre sirkulerende og bosatt hemocytes. (A) For å blø en larve, er ventral snitt på bakre og fremre ender av larven gjort (saks symbol). (B) Hemocytes i omløp vil strømme ut av snittene og bosette seg på overflaten av raset. (C) lymfe kjertel (LG) er plassert og festet nede, uten å punktere den. Resident hemocytes er utgitt av jabbing og / eller skraping larven med en nål. (D) bosatt hemocytes på lysbildet. (E, F) The Skrap prosessen gjentas til alle fastboende hemocytes er utgitt. Larve kadaver inneholder intakt lymfekjertel er igjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Automatisert kvantifisering av hemocytes bruker ImageJ. (A, B) Etter å ha åpnet en hemocyte bildefil i ImageJ, Nedre terskelnivået er justert for å ta hensyn til alle cellene i bildet. (C, D) Analyser Partikler krever sette størrelse cellen pixel, sirkularitet, og resultatet avlesning format (f.eks Overlay Outlines). (E) Summary vindu som viser antall hemocytes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Representant Resultater (1). Hemocyte nummer og bosatt staten over løpet av larveutvikling. (A) Oversikt over larvestadier som brukes; 1 st stadium (48 hr AEL; ~ 1,2 mm lengde); 2. stadium (80 hr AEL; 2,5 mm lengde); 3. stadium (96 hr AEL; ~ 3,5 mm lengde). Genotype er HML Δ-GAL4, UAS-GFP; He-GAL4. Stages ble bekreftet ved å vurdere larve mouthhooks. (B) Bar diagram av sirkulerende og bosatt hemocyte tall på de respektive larvestadier. (C) Prosent av sirkulerende hemocytes. Merk at brøkdel av sirkulerende hemocytes øker uforholdsmessig løpet av larveutviklingen. (D) Totalt hemocytes, som følge av summen av sirkulerende og bosatt hemocytes per larve. Hemocytes ble kvantifisert ved hjelp av Bleed / Skrap metoden; n ≥ 6 larver / tilstand, feilSøylene viser standardavvik, funn bekreftet i 3 uavhengige replikere eksperimenter.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representant Resultater (2). Effekter av mekanisk forstyrrelse på hemocyte boligen. (AC) Eksempel på en larve før og etter virvling med glassperler, fulgt av 45 min, data (A) Ingen forstyrrelse kontroll.; hemocytes er lokalisert i Hematopoetiske Pockets (B) Forstyrret hemocyte mønster på 0 min etter å virvle larver i en suspensjon av glassperler og vann (C) Hemocyte mønster på 45 min for utvinning post-forstyrrelse..; mange hemocytes har flyttet til Hematopoetiske Lommer; merk forstørret rygg-fartøy tilhørende klynger og rygg striper som er dominerende områder av tidlig post-forstyrrelse opphopning (piler). Genotype er HML Δ-GAL4, UAS-GFP; He-GAL4 x yw. (D) Prosent av sirkulerende hemocytes kvantifisert ved Bleed / Skrap metoden. (E) Sum hemocytes, som følge av summen av sirkulerende og bosatt hemocytes per larve. n ≥ 4 larver / tilstand, feilSøylene viser standardavvik, funn bekreftet i 3 uavhengige replikere eksperimenter. T-test for å bekrefte betydning, NS (ikke signifikant), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her beskriver vi den første metoden for å kvantitativt gjenopprette boende og sirkulerende blodceller fra enkelt Drosophila larver, og kvantifisere disse to hemocyte populasjoner. Protokollen omfatter sekvensiell utgivelsen av sirkulerende og bosatt blodceller, etterfulgt av bildebehandling og automatisert celletelling. Larve bosatt hemocytes kan forbigående mobilisert i omløp ved mekanisk forstyrrelse, en prosess som er kjent for å være stor grad reversert i løpet av en 30 - 60 min utvinning perioden 6. Følgelig ble denne protokollen testet på to måter, (1) ved å vurdere den totale hemocyte antallet per larve og fraksjon av sirkulerende hemocytes i løpet av larveutvikling, og (2) ved eksperimentelt løsner hørende hemocytes ved hjelp av en automatisert metode, som bekreftet stramt korrelasjon av hemocyte lokalisering og hemocyte nummer i boende og sirkulerende populasjoner. I tillegg ble reproduserbarhet av fremgangsmåten vist ved komparing to datasett av biologiske replikater.
I det siste har laboratorier benyttet en rekke teknikker for å kvantifisere larve hemocytes 6,13,21. Denne protokollen etablerer en felles standard for å hente og kvantifisere boende og sirkulerende blodcellepopulasjoner fra Drosophila larver, noe som gir en lett tilpasningsdyktig plattform. Metoden er beskrevet er kritisk for studier som fokuserer på rollen som bosatt hemocytes og deres mikromiljøet, Lommer på Hematopoietiske 4-6, og er egnet til å studere fluorescerende protein transgene førende Drosophila stammer i villtype og genmodifiserte bakgrunn. Protokollen er også relevant for studier som fokuserer på hemocyte mobilisering etter immun utfordring eller skade, og genetisk eller miljømessig indusert signale som utløser mobilisering av fastboende hemocytes eller endringer i total hemocyte nummer (anmeldt i 4). Det bør bemerkes at, i tilfeller av for tidlig differentiation og frigjøring av hemocytes fra lymfekjertel, skille embryonale / larve versus lymfekjertel linjene kan være begrenset av uttrykket mønster av fluorescerende hemocyte reporter brukt.
Protokollen som presenteres her er avhengig av bildebehandling levende, fluorescently merkede hemocytes. I fremtiden kan det bli modifisert for å muliggjøre påvisning av frigjorte celler etter fiksering, for eksempel ved hjelp av immunocytokjemi. I dette tilfelle kan protokollen må tilpasses for å sikre fullstendig adhesjon av blodceller, for eksempel ved å øke adhesjonen inkubasjonstider, og tilsetning av klebeglidebelegg, slik som concanavalin A. Siden metoden tillater gjenfinning av hemocytes og deres manipulasjon ex vivo, vil det gagne et bredt spekter av utviklings, cellebiologiske og biokjemiske studier. Boende og sirkulerende blodceller blir funnet under alle postembryonic utviklingsstadier av Drosophila og andre virvelløse dyr 22, suggesting at tilpasning av denne metoden vil dra et bredt spekter av studier utover Drosophila larve blodkreft system.
Acknowledgments
Vi takker Jesper Kronhamn og Dan Hultmark, Michael Galko, og Bloomington Stock senter for flue aksjer. Spesiell takk til Courtney Onodera for råd med statistisk analyse. Vi takker Katrina Gold for kritisk lesing av manuskriptet, og Kalpana Makhijani, Katrina Gold, medlemmer av Derynck laboratoriet, og medlemmer av Nystul laboratorium for diskusjon og kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra UCSF Program for Gjennombrudd Biomedical Research (PBBR), Broad Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health 1R01GM112083-01 og 1R56HL118726-01A1 (til KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 cm/9 cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g., a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g., 2 mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| 2 x 1 ml syringes with needles (27 G ½") | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2 mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212 - 600 μm | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. | Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | ||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (e.g., Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M.
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
