Introduction
Malattia della valvola cardiaca è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale; la sua prevalenza aumenta con l'età e colpisce oltre il 10% della popolazione di 75 anni e più 1. Le valvole della parte sistemica del cuore, le valvole aortica e mitrale, sono per lo più colpite. Malattia della valvola cardiaca è caratterizzata dalla perdita della struttura altamente organizzata delle valvole, che provoca l'alterazione delle proprietà meccaniche 2. L'integrità strutturale è quindi cruciale per il funzionamento della valvola.
Le foglioline della valvola sono costituiti da cellule interstiziali valvolari (VIC), cellule endoteliali valvolari (VEC) e matrice extracellulare, che è altamente organizzato in un modello a strati 3,4. I VIC sono responsabili della sintesi ECM, degradazione e organizzazione. Fattori che emana dal flusso sanguigno, EC o residenti in atto ECM sulle VIC orchestrare la sua funzione. In aggiunta,forze meccaniche del foglio durante il ciclo cardiaco conseguente laminare o sollecitazione di taglio oscillatoria, sollecitazioni di compressione o di trazione che influenzano il comportamento di VIC 5.
Per comprendere come è regolata la struttura della valvola, deve prima essere compreso come VIC rispondere alle diverse serie di stimoli sperimentati durante il ciclo cardiaco. Studi in vitro sono stati molto informato circa le caratteristiche e le abilità delle cellule valvolari. La risposta di queste cellule in vitro, tuttavia, non sempre simulare accuratamente la risposta in vivo 6; per esempio, la risposta agli stimoli VIC dipende dalla presenza di cellule endoteliali e la composizione ECM 5. Inoltre, la risposta delle cellule valvolari agli stimoli dipende dalla loro posizione specifica nel foglietto 7. Oltre agli stimoli biochimici, il comportamento delle cellule valvolari è determinata da forze meccaniche o agisconon la valvola 8. Ogni regione della valvola è sottoposto a un insieme specifico di sollecitazioni emodinamiche. Sebbene attuali ex vivo i modelli hanno dimostrato che le forze meccaniche sono importanti determinanti della struttura valvolare 5, i meccanismi associati sono ancora poco chiari. Mentre i modelli in vivo hanno fornito informazioni sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo valvolare 9,10, intuizioni adulto valvolare biologia è ancora sfuggente.
Pertanto, un modello in vivo ex flusso è stato sviluppato in cui le valvole cardiache possono essere coltivati nella loro posizione naturale nel cuore per un periodo di tempo prolungato 11. Questo ha il vantaggio che le valvole rimangono nella loro configurazione naturale e le VIC sperimentano lo stesso ambiente in vivo, rendendo le risposte VICS a stimoli più naturale possibile. Inoltre, la cultura delle valvole nella loro posizione naturale nel cuore facilita sottoponendo ogniregione valvolare alle relative sollecitazioni emodinamiche. In questo modello ex vivo, cioè, il Sistema Miniature Tissue Culture (MTC), le valvole possono essere sottoposto a diversi stimoli biochimici ed emodinamici permettendo l'indagine del loro ruolo nel rimodellamento della valvola cardiaca.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida LUMC dell'animale comitato etico della ricerca.
1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e MTC
Nota: eseguire tutti i preparativi in cappa a flusso laminare. La MTC camera di perfusione, trappola per bolle e supporto sono descritti in Lieber et al., 2010 11.
- Disinfettare le pinze e forbici micro con il 70% di etanolo. Preparare una siringa da 5 ml con 21G ago con tampone (130 NaCl sterile Tyrode mM, 5,4 mM KCl, 6.0 mM Hepes, 1.2 MgSO mm 4, 1,2 mm KH 2 PO 4, 20 Glucosio mM, 1,5 mM CaCl 2 .2H 2 O, pH = 7.2). Preparare una siringa da 5 ml con ago 21G con la soluzione KCl sterile (100 mm).
- Preparare 65 ml di terreno per cuore: DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino, antibiotici / antimicotici (A / A; 100 unità di penicillina, 100 mg di streptomicina, e 0,25 ug di amfotericina B / ml), insulino-Transferrin-Selenio (ITS; 10 mg / ml di insulina, 5.5 mg / ml transferrina, 6.7 ng / ml selenito di sodio) e filtro sterilizzare.
- Sterilizzare la camera di perfusione e gorgogliatore spruzzando con il 70% di etanolo e asciugare con carta assorbente. Assemblare la MTC (Figura 1D), tuttavia, inizialmente senza la camera di perfusione. Posizionare la trappola bolla sul cavalletto. Utilizzare una pompa peristaltica a rulli con testate pompa facile carico.
- Utilizzando tubo in silicone effettuare le connessioni tra il serbatoio (tubo da 50 ml) e la pompa, la pompa e il gorgogliatore, il gorgogliatore e serbatoio (Figura 1D). Rendere il tubo all'interno dell'incubatrice abbastanza lungo da permettere medio raggiungimento dell'equilibrio gas con il gas nell'incubatrice attraverso il tubo di gas permeabile silicio (1 m) e il tubo all'esterno dell'incubatrice più breve possibile.
- Riempire il tubo da 50 ml con il 70% di etanolo, accendere la pompa (velocità del flusso intorno a 1 ml / min per consentire la corretta circolazione) e lasciare che il CIR etanolocolare per 30 min per sterilizzare tutti i tubi. Rimuovere l'etanolo svuotando il serbatoio e pompando l'etanolo dal sistema.
- Riempire il tubo da 50 ml di acqua distillata sterile, accendere la pompa e lasciare circolare l'acqua per 30 minuti per sbarazzarsi di etanolo residuo. Rimuovere l'acqua svuotando il serbatoio e pompare l'acqua dal sistema.
- Riempire il tubo da 50 ml con 45 ml di terreno, mettere lo stand nell'incubatrice. Accendere il (velocità di flusso di circa 1 ml / min) e pompa circolare il mezzo di riempire tutti i tubi, rimuovere tutte le bolle d'aria e permettere il mezzo di adattarsi alla composizione del gas nell'incubatrice per almeno 1 ora. Mantenere l'incubatore a condizioni di coltura tissutale-standard (5% di CO 2 e 37 ° C). Assicurarsi che non siano presenti bolle nel tubo.
2. Isolamento di Cuore mouse
- Iniettare il mouse con 500 unità di eparina. Ciò impedirà la coagulazione del sangue e consente la rimozione di blood dal cuore. Dopo 10 min, anestetizzare il mouse in una camera di induzione con 4% isoflurano utilizzando un vaporizzatore di precisione. L'anestesia è sufficiente quando il mouse non risponde a pizzico piedi.
- Trasferire il mouse per una tavola di dissezione e mantenere l'anestesia mediante una maschera facciale collegato ad un circuito coassiale. Disinfettare la pelliccia del mouse con il 70% di alcol. Utilizzando le forbici aprire la cavità addominale per esporre la vena cava e il diaframma.
- Per esporre il cuore, fare incisioni laterali a partire dall'ultimo al primo costole e riflettono la gabbia toracica sopra la testa di topo. Arrestare il anestesia come mouse non respira più. Osservare il battito del cuore.
- Inserire l'ago 21G attaccato ad una siringa da 5 ml contenente tampone sterile Tyrode nella vena cava inferiore dalla addominale nella cavità toracica (attraverso diaframma). Assicurarsi che il sangue possa uscire dalla vena cava caudale dall'inserzione dell'ago. Profumato °Buffer e Tyrode delicatamente e con pressione costante nella vena cava fino a quando il cuore perde in parte il suo colore rosso. Nota: Il cuore rimane battere permettendo la rimozione del sangue dal cuore.
- Sostituire l'ago con l'ago 21G attaccato ad una siringa da 5 ml contenente soluzione KCl sterile. Profumato delicatamente la soluzione KCl nella vena cava fino a quando il cuore smette di battere e rimuovere l'ago. Nota: La soluzione KCl preserva cuore nella fase diastolica rilassata, che consentirà più facile inserimento degli aghi e perfusione perfusione del sistema coronarico.
- Sollevare leggermente il cuore con pinze curve e con le forbici sezionano il cuore libero dal tessuto circostante, ma lasciano arterie e le vene prossimali al cuore intatto e collegato al cuore. Trasferire il cuore ad una provetta da 15 ml contenente PBS ghiacciato integrato con antibiotici / antimicotici (A / A). Conservare il cuore in PBS freddo per un massimo di 3 ore.
3. Cannulation dei Cuori mouse nella camera di perfusione
- Eseguire tutte le procedure di cappa a flusso laminare. Trasferire il cuore isolato dal tubo 15 ml per un piatto di 10 centimetri di Petri e aggiungere PBS integrato con A / A.
- Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare il micro forbice e pinze per rimuovere tutto il tessuto non cardiaca ma preservare l'aorta ascendente almeno alla biforcazione con l'arteria anonima e le vene polmonari, 2 mm prossimale al cuore. Tagliare la punta della punta del cuore per creare l'accesso al lume del ventricolo sinistro (tipicamente 2 mm). Posizionare la camera di perfusione nella cappa a flusso sotto il microscopio da dissezione.
- Attaccare una siringa da 5 ml con il mezzo all'ago inserto utilizzando il tubo in silicone. Riempire la camera di perfusione con 20 ml di mezzo e mettere il cuore sul palco di rotazione tra i 2 aghi smussati nella camera di perfusione (Figura 1). Regolare l'altezza della fase di rotazione in modo che il cuore è posizionato di fronte allaaghi.
4. legatura per la coltura della valvola mitrale (vedi Figura 1)
- Legare l'aorta con sutura (seta 7.0). Legare l'appendice atriale sinistra con sutura. Inserire l'ago (nr. 1 in figura 1) attraverso la vena polmonare in atrio sinistro e legare con sutura prossimale alla sua entrata nell'atrio sinistro. Assicurarsi che l'ago non è troppo lontano in atrio sinistro in quanto ciò danneggerebbe la valvola mitrale.
- Inserire l'ago (nr.2 in figura 1) con moto lineare nel ventricolo sinistro. Trasferire il terreno dalla camera di perfusione in una provetta da 50 ml. Sigillare l'ago al miocardio con colla biocompatibile.
- Dopo che la colla si è asciugata, iniettare attentamente medio nel cuore collegando una siringa riempita di medio all'ago nr.1 e verificare se vi siano perdite. Garantire che le uscite medie di ago nr.2 e l'ultimo sangue rimanente viene perfuso dal cuore.
5. Ligazione per la coltura della valvola aortica (vedi Figura 1)
- Inserire l'ago (nr.1 in figura 1) nell'aorta e legare con suture. Assicurarsi che l'ago non è troppo lontano in aorta poiché ciò danneggiare la valvola aortica. Inserire l'ago (nr.2 in figura 1) con moto lineare nel ventricolo sinistro. Trasferire il terreno dalla camera di perfusione in una provetta da 50 ml. Sigillare l'ago al miocardio con colla biocompatibile.
- Dopo che la colla si è asciugata, iniettare attentamente medio nel cuore collegando una siringa riempita di medio all'ago nr.2 e verificare se vi siano perdite. Garantire che le uscite medie di ago nr.1 e l'ultimo sangue rimanente viene perfuso dal cuore.
6. Mettere Perfusion Camera Stand
- Riempire camera di perfusione con i 20 ml trasferiti medio. Mettere guarnizione e coperchio sulla camera e stringere con rondella e viti.
- Rimuovere i MTC assemblati dal incubazionetor. Fissare la camera di perfusione sul cavalletto. Collegare il tubo (vedi Figura 1D). Posizionare il supporto in incubatrice (5% di CO 2 e 37 ° C). Collegare il tubo alla pompa. Accendere la pompa con velocità del flusso circa 600 ml / min.
- Assicurarsi che nel serbatoio e / o il gorgogliatore il livello del fluido consente le visualizzazioni della presenza del flusso dalla caduta delle gocce medie in entrata. Dopo coltura, il cuore viene rimosso dal sistema, fissi ed elaborati per l'esame istologico.
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Representative Results
La valvola aortica (Figura 2) o valvola mitrale 11 possono essere coltivate per almeno 3 giorni. Coltivando in posizione aperta (che rappresenta la posizione sistolico della valvola aortica e la posizione diastolica per la valvola mitrale), cellule valvolari rimangono vitali. Nessuna morte cellulare è osservato come determinato dall'assenza di TUNEL-positive cellule (Figura 2H, I) o spaccati caspasi-3 espressione (non mostrato e Lieber et al., 2010 11). La distribuzione collagene (come visualizzato dalla colorazione tricromica di Masson) è simile alla condizione originaria quando coltivate in 1% di siero (Figura 2D, E). Le valvole sono sensibili ai cambiamenti delle condizioni di coltura. Aumentando la quantità di siero a 10% provoca volantini spessi (Figura 2C). Inoltre, una regione priva di collagene chiaro si osserva al lato ventricolare del foglietto vicino al fissaggio alla parete aortica (freccia in Figura 2F
Figura 1. Il sistema Tissue Culture Miniature. (A) In camera di perfusione cuore è che sul palco di rotazione e legatura con gli aghi smussati indicati con n ° 1 e n ° 2. (B) perfusione camera è montata sul supporto. (C) Schema del cuore quando la coltura la valvola mitrale (sinistra) o valvola aortica (a destra). (D) Schema della configurazione del sistema ex vivo di flusso per la cultura della valvola aortica. Questo dato è stato in parte modificato dal precedente studio 11. Clicca qui per vedere una versione più grande of questa figura.
Figura 2. istologica analisi delle valvole in coltura di 2 mesi topi. (AC) heamatoxylin ed eosina (H & E) tricromica colorazione e GI (DF) di Masson) TUNEL di una valvola aortica non coltivate (A, D, G), una valvola aortica coltivate in presenza di 1% di siero (B, E , H) o il 10% di siero (C, F, I) per 3 giorni nel MTC. La valvola in coltura con siero 1% appare simile alla valvola di non-coltura, mentre la valvola di coltura con 10% di siero è più spessa (C) ed ha un modello alterato ECM (F). Nessuna apoptosi si osserva nelle valvole (GI). Barra di scala è di 100 um. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Fasi critiche coltivando le valvole cardiache di topo comprendono rendendo il tempo tra escissione del cuore dal mouse e la legatura nella camera di perfusione più breve possibile per la sussistenza e legatura degli aghi perpendicolare alle valvole per assicurare la corretta direzione del flusso . Inoltre, il controllo della portata dopo legatura nella camera di perfusione senza prodotto garantisce il corretto inserimento e legatura di aghi. È fondamentale mantenere una cultura sterile, di evitare bolle d'aria nel tubo, che potrebbero rimanere intrappolati nel cuore ostruendo il flusso.
Il volume totale del mezzo utilizzato per la perfusione del cuore è di 45 ml (si noti che il mezzo che viene perfuso attraverso il cuore non è in contatto con i 20 ml di terreno nella camera di perfusione). Per l'aggiunta di virus per esempio un volume più piccolo può essere preferito. Temporaneamente il serbatoio (e parte del tubo) può essere rimosso dal circuito lon partenza 5-7 ml nel sistema per permettere l'infezione della valvola.
L'assenza di battito del cuore potrebbe essere considerato una limitazione. Tuttavia, consente di creare una condizione sperimentale in cui tutti gli stimoli che lavorano sul prospetto possono essere mantenute costanti. Questo dà l'opportunità unica di studiare l'effetto di una singola modifica. Quando sono richieste valvole in movimento, è possibile creare un flusso pulsatile.
Per studiare la biologia valvolare e il ruolo degli stimoli molecolari, cellulari e meccaniche sulla valvola, modifiche possono essere facilmente apportate al sistema di coltura. Modifica molecolare può essere ottenuto mediante l'aggiunta di fattori di crescita, composti chimici e virus che mediano gene delivery 11 al mezzo di perfusione. Uno o più tipi di cellule possono essere somministrati al mezzo di perfusione per esaminare l'influenza di queste cellule in biologia valvolare o loro contributo alla valvola. L'influenza di stress ossidativo o ipossia può esserestudiata alterando l'ossigeno pressione nel mezzo di coltura. Le sollecitazioni emodinamiche sulla valvola possono essere variate cambiando la velocità di flusso, la direzione del flusso, flusso pulsatilità e la viscosità. La morfologia generale può essere esaminato (Figura 2B, C) da H & E, colorazione istochimica e immunofluorescenza. Inoltre, l'organizzazione e la composizione della ECM, il fenotipo, la proliferazione e la vitalità delle cellule valvolari e l'attivazione di vie di segnalazione forniscono informazioni sugli effetti di varia queste condizioni. Topi geneticamente modificati possono essere utilizzati per monitorare le cellule endoteliali, utilizzando topi reporter endoteliali (utilizzando il Tie2-Cre e floxed giornalista topi) che indica la presenza di endoteliale-to-mesenchimale trasformazione o topi con perdita o guadagno di funzione di vie di segnalazione specifici. Nel complesso, il sistema qui presentato è uno strumento utile per lo studio cardiaco valvolare biologia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
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