Introduction
Hjerteklap sygdom er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed i den vestlige verden; dens udbredelse stiger med alderen, og det påvirker mere end 10% af befolkningen 75 år og derover 1. Ventilerne af den systemiske del af hjertet, aorta og mitralklapper, er for det meste påvirket. Hjerteklap sygdom er karakteriseret ved tabet af den meget organiseret struktur af ventilerne, hvilket resulterer i ændring af de mekaniske egenskaber 2. Den strukturelle integritet er derfor afgørende for funktionen af ventilen.
De foldere af ventilen består af skallerne interstitielle celler (VIC), valvulær endotelceller (VEC) og ekstracellulær matrix, som er meget organiseret i en lagdelt mønster 3,4. De VIC'erne er ansvarlige for ECM syntese, nedbrydning og organisation. Faktorer der udgår fra blodbanen, EC'er eller bopæl i ECM handle på VIC'erne orkestrere sin funktion. Desuden,mekaniske kræfter virker på indlægssedlen i hjertecyklussen resulterer i laminar eller oscillerende forskydningsspænding, sammentrykkende eller trækspændinger påvirker adfærd VIC'erne 5.
For at forstå, hvordan strukturen af ventilen reguleres, skal det først forstået VIC'erne reagere på forskellige sæt af stimuli oplevet under hjertecyklussen. In vitro-undersøgelser har været meget informativ om karakteristika og evner valvulær celler. Svaret af disse celler in vitro, kan dog ikke altid nøjagtigt efterligne in vivo responset 6; for eksempel reaktion på stimuli VIC er afhængig af tilstedeværelsen af EC'er og ECM præparat 5. Desuden svaret af valvulær celler til stimuli, afhænger af deres specifikke placering i pjecen 7. Ud over biokemiske stimuli, er opførslen af valvulær celler bestemmes ved hjælp af mekaniske kræfter, der virker on ventilen 8. Hver region af ventilen udsættes for sin egen specifikke sæt af hæmodynamiske spændinger. Selvom de nuværende ex vivo-modeller har vist, at mekaniske kræfter er vigtige determinanter for valvulær struktur 5, de associerede mekanismer er stadig uklart. Mens in vivo-modeller har givet indsigt i de molekylære mekanismer bag valvulær udvikling 9,10, indsigt i voksen valvulær biologi er stadig undvigende.
Derfor er en ex vivo flow model blev udviklet, hvor hjerteklapper kan dyrkes i deres naturlige stilling i hjertet i en længere periode 11. Dette har den fordel, at ventilerne forbliver i deres naturlige konfiguration og VIC'erne opleve det samme miljø som in vivo, hvilket gør VIC svar på stimuli så naturligt som muligt. Hertil kommer, at kulturen af ventilerne i deres naturlige stilling i hjertet letter underkaste hvervalvulær regionen til de relevante hæmodynamiske spændinger. I denne ex vivo-model, dvs. Miniature Tissue Culture System (MTCS), kan ventilerne udsættes for forskellige biokemiske og hæmodynamiske stimuli til efterforskning af deres rolle i hjerteklap remodeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger LUMC retningslinjer af dyret videnskabsetisk komité.
1. Fremstilling af instrumenter, Kultur Medium, og MTCS
Bemærk: Udfør alle forberedelser i laminar flow hætte. Den MTCS perfusionskammer, boble fælde og stativ er beskrevet i Lieber et al. 2010 11.
- Desinficere pincet og mikro saks med 70% ethanol. Forbered en 5 ml sprøjte med 21G kanyle med sterilt Tyrodes Buffer (130 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 6,0 mM Hepes, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM glucose, 1,5 mM CaCl2 .2H 2 O, pH = 7,2). Forbered en 5 ml sprøjte med 21G kanyle med sterilt KCl-opløsning (100 mM).
- Forbered 65 ml medium pr hjertet: DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum, antibiotika / antimykotika (A / A, 100 enheder penicillin, 100 ug streptomycin og 0,25 ug amphotericin B / ml), insulin-Transferrin-Selen (ITS; 10 ug / ml insulin, 5,5 ug / ml transferrin, 6,7 ng / ml natriumselenit) og Filtersteriliser.
- Sterilisere perfusionskammeret og boble fælde ved sprøjtning med 70% ethanol og tørre med køkkenrulle. Saml MTCS (figur 1D), dog i første omgang uden perfusionskammeret. Placer boblen fælden på standen. Brug en peristaltisk valsepumpe med let belastning pumpehoveder.
- Brug af silikoneslange skabe forbindelser mellem reservoiret (50 ml rør) og pumpen, pumpen og boblerør, et boblerør og reservoiret (se figur 1D). Gør slangen inde i inkubatoren længe nok til at tillade medium at nå gas ligevægt med gassen i inkubatoren gennem det gaspermeable silikoneslange (1 m) og slangen uden for inkubatoren så kort som muligt.
- Fyld 50 ml rør med 70% ethanol, tænde for pumpen (flow hastighed omkring 1 ml / min for at muliggøre korrekt omsætning), og lad ethanol circulate i 30 minutter for at sterilisere alle rør. Fjernes ethanolen ved tømning reservoiret og udpumpning ethanol fra systemet.
- Fyld 50 ml rør med sterilt destilleret vand, tænde for pumpen og lad vandet cirkulere i 30 minutter for at slippe af resterende ethanol. Fjerne vandet ved at tømme reservoiret og pumpe vandet ud fra systemet.
- Fyld 50 ml rør med 45 ml medium, satte foden i inkubatoren. Tænd for pumpen (flow hastighed omkring 1 ml / min) og cirkulere mediet til at fylde alle rør, fjerne alle luftbobler og tillade mediet at tilpasse sig gassammensætning i inkubatoren i mindst 1 time. Oprethold inkubatoren ved standard væv-dyrkningsbetingelser (5% CO 2 og 37 ° C). Sikre, at ingen bobler i slangen.
2. Isolering af Mouse Hjerte
- Injicere mus med 500 enheder af heparin. Dette vil forhindre blodet i at størkne og tillader fjernelse af blood fra hjertet. Efter 10 min, bedøver musen i en induktion kammer med 4% isofluran ved hjælp af en præcision vaporizer. Anæstesi er tilstrækkelig, når musen ikke reagerer til tå knivspids.
- Overfør musen til en dissektion bord og opretholde anæstesi ved hjælp af en ansigtsmaske forbundet til en koaksial kredsløb. Desinficere pelsen af musen med 70% alkohol. Med en saks åbne bughulen for at blotlægge vena cava og mellemgulv.
- At eksponere hjertet, gør laterale snit startende fra den sidste til den første ribben og afspejler den thorax bur løbet mus hoved. Stop anæstesi som musen ikke trækker vejret længere. Overhold hjerte slå.
- Sæt 21G nål fastgjort til en 5 ml sprøjte indeholdende steril Tyrode puffer i vena cava inferior fra den abdominale i brysthulen (gennem membranen). Sørg for, at blodet kan forlade vena cava caudale fra nålen indsættelse. Perfundere the Tyrodes puffer forsigtigt og med konstant tryk i vena cava, indtil hjertet mister delvis sin røde farve. Bemærk: Hjertet forbliver slå tillader fjernelse af blod fra hjertet.
- Udskift nålen med 21G nål fastgjort til en 5 ml sprøjte indeholdende steril KCl-opløsning. Forsigtigt perfundere den KCl-opløsning ind i vena cava, indtil hjertet stopper slå og fjern nålen. Bemærk: Den KCl-opløsning bevarer hjertet i den afslappede diastoliske fase, hvilket vil gøre det lettere indsættelse af perfusionen nåle og perfusion af koronar-systemet.
- Lidt løfte hjertet ved hjælp af buede pincet og med en saks dissekere hjertet fri for omgivende væv, men efterlade arterier og vener proximale til hjertet intakt og fastgjort til hjertet. Overfør hjertet til et 15 ml rør indeholdende iskold PBS suppleret med antibiotika / antimykotika (A / A). Opbevar hjertet i iskoldt PBS i op til 3 timer.
3. Cannulation af musen Hjerter i perfusionskammeret
- Udfør alle procedurer i laminar flow hætte. Overfør isoleret hjerte fra 15 ml rør til et 10 cm petriskål, og der tilsættes PBS suppleret med A / A.
- Under et dissektionsmikroskop, bruge mikro saks og pincet til at fjerne alle ikke-hjertevæv, men bevare opadgående aorta til mindst forgreningen med brachiocephale arterie og lungevenerne, 2 mm proximalt til hjertet. Skær spidsen af hjertespidsen at skabe adgang til den venstre ventrikulære hulrum (typisk 2 mm). Placer perfusionskammeret i strømningshætte under dissektionsmikroskop.
- Vedhæft en 5 ml sprøjte med medium til indsatsen nål ved hjælp af silikoneslanger. Fyld perfusionskammeret med 20 ml medium og sætte hjerte på rotation fase i mellem 2 stumpe nåle i perfusionskammeret (figur 1). Justere højden af rotationen tidspunkt, således hjertet er placeret forannåle.
4. Ligation til dyrkning mitralklappen (se figur 1)
- Ligere aorta med sutur (silke 7,0). Ligere venstre forkammer vedhæng med sutur. Stik nålen (nr. 1 i figur 1) gennem pulmonal vene ind i venstre atrium og liger med sutur proksimalt for den træder i venstre atrium. Sørg for, at nålen ikke er for langt ind i venstre atrium, da dette ville skade mitralklappen.
- Stik nålen (nr.2 i figur 1) med lineær bevægelse ind i den venstre ventrikel. Overfør mediet fra perfusionskammeret til et 50 ml rør. Forsegl nålen til myokardiet med biokompatible lim.
- Efter limen er tørret, omhyggeligt injicere medium i hjertet ved at tilslutte et medium fyldt injektionssprøjte til p nr.1 og kontrollere, om der er nogen lækager. Sikre, at mellemstore udgange fra nål nr.2 og den sidste tilbageværende blod perfunderet ud af hjertet.
5. Ligelse til dyrkning aortaklappen (se figur 1)
- Stik nålen (nr.1 i figur 1) i aorta og liger med sutur. Sørg for, at nålen ikke er for langt ind i aorta, da dette ville skade aortaklappen. Stik nålen (nr.2 i figur 1) med lineær bevægelse ind i den venstre ventrikel. Overfør mediet fra perfusionskammeret til et 50 ml rør. Forsegl nålen til myokardiet med biokompatible lim.
- Efter limen er tørret, omhyggeligt injicere medium ind i hjertet ved at tilslutte et medium fyldt injektionssprøjte til p nr.2 og kontrollere, om der er nogen lækager. Sikre, at mellemstore udgange fra nål nr.1 og den sidste tilbageværende blod perfunderet ud af hjertet.
6. Placer perfusionskammeret på Stand
- Fyld perfusionskammer med de 20 ml overførte medium. Placer pakningen og låget på kammeret og spænd med vaskemaskine og skruer.
- Fjern de forsamlede MTCS fra INCUBAtor. Fastgør perfusionskammeret på standen. Tilslut slangen (se figur 1D). Placer stativet i inkubatoren (5% CO2 og 37 ° C). Tilslut slangen til pumpen. Tænd pumpen med strøm hastighed omkring 600 pl / min.
- Sørge for, at i reservoiret og / eller et boblerør niveauet af mediet tillader visualisering af tilstedeværelsen af strømmen af faldende af de indkommende medium dråber. Efter dyrkning er hjertet fjernet fra systemet, faste og forarbejdet til histologisk undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aortaklappen (figur 2) eller mitralklappen 11 kan dyrkes i mindst 3 dage. Ved dyrkning i åben stilling (som repræsenterer det systoliske position for aortaklappen og diastoliske position for mitralklappen), forbliver valvulær celler levedygtige. Der observeres ingen celledød som bestemt ved fravær af TUNEL-positive celler (figur 2H, I) eller spaltes caspase-3-ekspression (ikke vist og Lieber et al., 2010 11). Kollagen distribution (som visualiseret ved Massons trichromfarvning) ligner den native tilstand, når de dyrkes i 1% serum (figur 2D, E). Ventilerne er lydhøre over for skiftende dyrkningsbetingelser. Forøgelse af mængden af serum til 10% resulterer i tykkere foldere (figur 2C). Endvidere er en klar collagen-frie områder observeret ved den ventrikulære side af indlægssedlen nær tilknytning til aortavæggen (pil i figur 2F
Figur 1. Miniature vævskultursystem. (A) I perfusionskammeret hjertet om på rotation scenen og ligeret med stumpe nåle angivet med Nr.1 og nr.2. (B) perfusionskammer er monteret på stativ. (C) Skematisk tegning af hjertet når dyrkning af mitralklappen (venstre) eller aortaklappen (højre). (D) Skematisk tegning af opsætningen af ex vivo flow system til aortaklappen kultur. Dette tal er blevet delvist ændret fra tidligere undersøgelse 11. Klik her for at se en større version of denne figur.
Figur 2. Histologisk analyse af dyrkede ventiler fra 2 måneder gamle mus. (AC) heamatoxylin og eosin (H & E) (DF) Massons trichromfarvning og GI) TUNEL-farvning af en ikke-dyrket aortaklappen (A, D, G), en aortaklappen dyrket i nærvær af 1% serum (B, E , H) eller 10% serum (C, F, I) i 3 dage i MTCS. Ventilen dyrket med 1% serum vises svarende til ikke-dyrkede ventil, hvorimod ventilen dyrket med 10% serum er tykkere (C) og har en ændret ECM mønster (F). Der observeres ingen apoptose i ventilerne (GI). Scale bar er 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i dyrkning af kardiale mus ventiler indbefatter gør tiden mellem udskæring af hjertet fra musen og ligering i perfusionskammeret så kort som muligt for at sikre levedygtighed og ligering af nåle vinkelret ventilerne for at sikre korrekt retning af strømmen . Derudover tjekker flowet efter ligering i perfusionskammeret uden medium sikrer korrekt isætning og ligering af nåle. Det er afgørende at opretholde en steril kultur og forhindre luftbobler i slangen, som potentielt kunne blive fanget i hjertet blokerer strømmen.
Den samlede mængde af medium, der anvendes til perfusion af et hjerte er 45 ml (bemærk, at det medium, der perfunderes gennem hjertet ikke er i kontakt med de 20 ml medium i perfusionskammeret). For tilsætning af for eksempel virus et mindre volumen kan være foretrukket. Tidsmæssigt reservoiret (og en del af røret) kan fjernes fra kredsløbet leaving 5-7 ml i systemet for at muliggøre infektion af ventilen.
Fraværet af hjerteslag kan betragtes som en begrænsning. Den tillader, at skabe en eksperimentel tilstand, hvor alle stimuli arbejder på indlægssedlen kan holdes konstant. Dette giver en enestående mulighed for at undersøge virkningen af en enkelt ændring. Når der kræves bevægelige ventiler, kan der skabes en pulserende flow.
At studere valvulær biologi og den rolle, molekylære, cellulære og mekaniske stimuli på ventilen, kan modifikationer nemt gøres til dyrkningssystemet. Molekylær modifikation kan opnås ved tilsætning af vækstfaktorer, kemiske forbindelser og vira medierer genlevering 11 til perfusionsmediet. En eller flere celletyper kan administreres til perfusionsmediet at undersøge indflydelsen af disse celler på valvulær biologi eller deres bidrag til ventilen. Indflydelsen af oxidativ stress eller hypoxi kan væreundersøgt ved at ændre oxygentryk i dyrkningsmediet. De hæmodynamiske spændinger på ventilen kan varieres ved at ændre strømningshastigheden, flowretning, flow Pulsatilitetsindeks og viskositeten. Den samlede morfologi kan undersøges (figur 2B, C) ved H & E, histokemisk og immunfluorescensfarvning. Derudover organisation og sammensætning af ECM, fænotypen, proliferation og levedygtighed valvulær celler og aktivering af signalveje give indsigt i virkningerne af varierende disse betingelser. Genetisk modificerede mus kan bruges til at spore endothelcellerne ved hjælp af endotelceller reporter mus (ved hjælp af Tie2-Cre og floxet reporter mus) indikerer tilstedeværelsen af endotel-til-mesenchymal omdannelse eller mus med tab eller gevinst på funktionen af specifikke signalveje. Samlet set systemet præsenteres her er et nyttigt redskab til at studere hjerte-valvulær biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N.
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
