Abstract
Die Exposition gegenüber chemischen Stoffen (einschließlich alkylierende chemische Kampfstoffe wie Schwefel und Stickstoffsenf) führen eine Fülle von klinischen Symptomen wie Wundheilungsstörung. Der physiologische Prozess der Wundheilung ist sehr komplex. Die Bildung von Granulationsgewebe ist ein wichtiger Schritt in diesem Prozess, was zu einer vorläufigen Wundverschluss und die Bereitstellung eines Netzes von neuen kapillaren Blutgefäßen - entweder durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (sprießen bestehender Schiffe). Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern funktionale, gerichtete Wanderung von Endothelzellen. Somit ist Untersuchung von frühen Endothelzellen (EWG) Migration wichtig, die Pathophysiologie der chemischen induzierten Wundheilungsstörungen zu verstehen und möglicherweise zu identifizieren neue Strategien für die therapeutische Intervention.
Wir beurteilen Wundheilungsstörungen nach Alkylierungsmittel Belichtung und getestet potenziellen Kandidatenverbindungen für treatment. Wir haben eine Reihe von Techniken, die in diesem Protokoll beschrieben. A modifizierten Boyden-Kammer, um quantitativ zu untersuchen Chemokinese der EWG beschrieben. Darüber hinaus wird die Verwendung der Wundheilungs Assay in Verbindung mit Gleis Analyse qualitativ beurteilen Migration dargestellt. Schließlich zeigen wir die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs TMRM zur Erforschung des mitochondrialen Membranpotentials zu Grunde liegenden Mechanismen der gestörten Zellmigration zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt grundlegende Techniken, die für die Untersuchung der EWG adaptiert wurden.
Introduction
Zellmigration ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, einschließlich der Entwicklung, verschiedene Krankheiten, und die Wundheilung nach Verletzungen der Haut wichtig.
Folgende Hautverletzung, Entzündung beseitigt beschädigte oder nekrotische Gewebe und Granulierung Antriebe vorläufigen Wundverschluß und ermöglicht die Bildung eines Netzwerks von Kapillaren durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (Sprießen von vorhandenen Bläschen) 1-3. Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern Migration von Endothelzellen. Die wachsende Netzwerk von Blutgefäßen ist wichtig, um Sauerstoff und Nährstoffe zu proliferierenden Keratinozyten, die letztlich Verhornung unterziehen zu transportieren, bilden eine neue Epithel und bieten Wundverschluss.
Beeinträchtigt Migration von Endothelzellen ist eine zugrunde liegende Ursache der Wundheilungsstörung 4,5. Somit Methoden zur Messung der Migration der frühen Endothelzellen sind erforderlich, um die pathophysiol erforschenlogie der Zellmigration Störungen und neue Strategien für die therapeutische Intervention zu identifizieren.
Hautexposition Alkylierungsmittel (beispielsweise Schwefel und Stickstoffsenfgas) verursacht Wundheilungsstörung 6. Solche Verbindungen wurden als chemische Kampfstoffe in mehrere Konflikte im 20. Jahrhundert Grund für große Besorgnis wegen der bestehenden Lagerbestände in politisch instabilen Regionen und die relativ einfache Synthese verwendet werden und zu bleiben. Obwohl Senfgas wurde zum ersten Mal im Jahre 1822 synthetisiert wird die molekularen und klinischen Pathologie der SM Exposition nicht im Detail verstanden und kein Gegenmittel für SM Exposition festgestellt wurde.
Es wurden mehrere Studien durchgeführt, um zu verstehen und zu einer Beeinträchtigung der Wundheilung nach SM Expositionsmodell und für potenzielle Kandidatenverbindungen, die die Reservierung diese Wirkung zu testen. Schmidt et al. (2009) untersucht die Wirkung von Chlorambucil, einem alkylierenden Verbindung mit ähnlich SM in mou Eigenschaftense Embryoidkörper Modelle und fand eine dramatische, manchmal mehr als 99% ige Reduktion der Gefäßbildung 7. Dieser nachteilige Effekt war besonders im Stadium der Entwicklung, die unter physiologischen Bedingungen durch die Proliferation und Migration der vaskulären endothelialen Vorläuferzellen dominiert ausgeprägt. Somit wurden diese Zellen identifiziert besonders empfindlich Alkylierungsmittel sein. Steinritz et al. (2010) getestet Fänger von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), insbesondere N-Acetylcystein (NAC) und Alpha-Linolensäure (ALA) auf ihre Fähigkeit zur SM-Toxizität in der Maus Embryoidkörper Modelle und insbesondere zu verringern, Wiederherstellung Gefäßbildung 8. Temporäre Schutzwirkungen wurden nicht beobachtet, was darauf hinweist, dass die übermäßige Bildung von ROS wahrscheinlich war, um die negativen Auswirkungen der SM auf die Wundheilung bei. Diese Effekte waren nicht dauerhaft und die zwei Kandidatenverbindungen nicht wiederherstellen kann Gefäßbildung und Wundheilung langfristig 8 sein. However wurden diese Experimente in einem komplexen 3D-Modell, das ermöglicht Untersuchung der Zellmigration haben durchgeführt. So haben wir anschließend getestet NAC und ALA für eine wohltuende Wirkung auf die Zellmigration der EWG, die eine Schlüsselrolle im Prozess der Gefäßbildung 9 haben.
Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass die Zellpolarität ist für Zellmigration erforderlich. Mitochondriale Dysfunktion, die zu ROS-Bildung wurde gezeigt, dass Zellpolarität beeinträchtigen und somit nachteilig auf die Zellmigration. Daher wurde lebenden Zellen im Hinblick auf die mitochondriale Funktion durchgeführt, und die Wirkungen von ROS-Fänger wurden untersucht. Das folgende Protokoll beschreibt die allgemeinen Anforderungen für den Anbau von EWG, der Boyden-Kammer-Assay, der Wundheilungsassay einschließlich Zell Tracking-Analyse und den Einsatz von TMRM zur Beurteilung der Funktion der Mitochondrien im Detail. Wichtige Aspekte der Versuchsprotokolle für EWG Anbau und Migration werden hervorgehoben.
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Protocol
Das folgende Protokoll beschreibt Techniken für die Untersuchung der frühen Endothelzellmigration. Die richtige Pflege der vaskulären Endothelzellen erfordert pre-Beschichtung von Zellkulturflaschen mit Gelatine, um die ordnungsgemäße Verbreitung und Aufrechterhaltung eines endothelialen Phänotyp zu gewährleisten.
1. Pre-Beschichtung von Zellkulturflaschen
- Auflösen Gelatine in 0,1 M PBS auf eine Endkonzentration von 0,1%.
- Autoklavieren Sie die Lösung mit Parametern für flüssige Autoklavieren (Details siehe Anleitung der spezifischen Autoklav).
- Gebe ausreichend Volumen des autoklavierten Gelatinelösung in eine sterile Zellkulturflasche (beispielsweise zumindest 5 ml einer T25 Zellkulturflasche).
- Übertragen Sie die Flaschen in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 nicht erforderlich, aber nicht stört) für mindestens 30 min.
- Entfernen Sie die verbleibende Gelatine-Lösung. Verwenden Sie die vorbeschichtete Kolben anschließend (siehe Zellkultivierung) oder sriß unter sterilen Bedingungen bis zur Verwendung.
2. Zellkultur der frühen Endothelzellen
Hinweis: embryonalen Stammzellen abgeleitet frühen Endothelzellen (EWG) wurden von differenzierten murine embryonale Körper durch magnetische Zellsortierung der PECAM-1-positive Zellfraktion, wie zuvor beschrieben, erhalten 10,11.
- Kultur EWG Gelatine beschichtete Zellkulturschalen in DMEM, ergänzt mit 15% FCS, 50 U / ml Penicillin, 50 U / ml Streptomycin, 200 & mgr; M L-Glutamin, 100 & mgr; M ß-Mercaptoethanol und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren. Griff Zellen unter sterilen Bedingungen. Kultivieren der Zellen mit 5% CO 2 bei 37 ° C und 95% Feuchtigkeit bis Subkonfluenz (max. 80%).
- Bei Subkonfluenz, teilen Sie die Zellen bei einer 1: 5-Verhältnis. Anmerkung: Ablösung der Endothelzellen ist ein kritischer Schritt.
- Ernten Sie die Zellen, die mit RT Accutase. Entfernen Sie die Medien, Spülen mit PBS und 1 ml Accutase pro 25 cm
- Der Kolben wird bei RT inkubieren 2-10 min, bis die Zellen abgelöst. Dispergieren der Zellen und sie auf die gewünschte Anwendung. Anmerkung: Eine chemische Neutralisation des Accutase ist nicht erforderlich, wie es stattfindet, wenn die angesiedelten Zellen werden im Brutschrank bei 37 ° C gelagert. Jedoch kann Accutase Aktivität auch durch Zugabe DMEM FCS verringert werden.
- Ernten Sie die Zellen, die mit RT Accutase. Entfernen Sie die Medien, Spülen mit PBS und 1 ml Accutase pro 25 cm
3. Boyden Chamber
Hinweis: Boyden-Kammer-Tests werden unter Verwendung von lichtundurchlässigen Polyethylenterephthalat Einsatzsystemen mit 8 & mgr; m Porengröße durchgeführt.
- Precoat- die Filtereinsätze (dh passen in Zellkulturvertiefungen wodurch eine Boyden-Kammer), die durch Zugabe von 500 ul 0,1% Gelatine in 0,1 M PBS für mindestens 30 min.
- Wenn Zellen mit toxischen Chemikalien ausgesetzt werden sollen, ausgesetzt werden entsprechend der speziellen Versuchsdesign vor der Zellernte. Anmerkung: Die Zellen wurden auf 12,5 ug Chlorambucil / ml DMEM ausgesetzt24 h. Im Hinblick auf die spezifische experimentelle Design können Befehle variieren.
- Ernte EWG und bestimmen die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer. Hinweis: Die automatische Zählgeräte verwendet werden, sollte aber mit Vorsicht verwendet werden: manuelle Zellzählung ist genauer und ist sehr zu empfehlen.
- Gib 500 & mgr; l Zellkulturmedium in die untere Kammer Raum des Boyden Chamber.
- In genau 10 4 EWG in 500 ul Zellkulturmedium pro Filtereinsatz in der oberen Kammer Fach. Beseitigen Sie Luftblasen.
- Inkubieren Sie die Filtereinsätze in den Inkubator für genau 8 Stunden.
- Spülen mit PBS einmal und ersetzen Sie das Medium mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in beiden Fächern für 25 min für die Zellfixierung. Das Filter ausgiebig waschen, aber mindestens 3-mal mit 0,1 M PBS.
- Verbrauchsteuern, die Membranen mit einem Skalpell.
- Montieren Sie die Membran zwischen zwei Glasplättchen mit Eindeckmedium enthält DAPI zur Kern staining. Achten Sie auf die Ausrichtung. Sicherzustellen, dass nur Zellen, die in Richtung der unteren Kammer der Membran gewandert sind, gezählt.
- Zählen von Zellen, die in Richtung der unteren Abteilseite der Membran mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 400-facher Vergrößerung gewandert sind. Nicht zu verwechseln Membranporen mit migrierten Zellen (1A, 1B). Untersuchen Sie eine angemessene Anzahl von biologischen Replikaten (mindestens 3 biologischen Wiederholungen pro Bedingung).
4. Wundheilung Assay
- In Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung, sorgfältig auswählen, die Zellkulturschalen oder Platten: Bei der Verwendung von DIC-Mikroskopie, zu vermeiden Kunststoffoberfläche basierend Kulturschalen oder Well-Platten, sondern verwenden Glas basierten Geräten statt.
Hinweis: Bei Verwendung Phasenkontrastmikroskopie, können Kunststoffgerichten verwendet werden. - Kultivieren EWG in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (zB 4 cm Glasboden Petrischale für Live Cell Imaging), Bis 80% Zusammenfluss. Wichtig: nicht kultivieren die Zellen bis zur Konfluenz abzuschließen.
- Rubbeln Sie an der Monoschichten mit 10 ul sterile Pipettenspitzen. Schieben Sie die Spitze vorsichtig ohne zu viel Druck auf der Geschirroberfläche und verschieben Sie sie in einer geraden Linie sanft von einer Seite auf die other.Wash die Zellen zweimal mit 0,1 M PBS, um abgelösten Zellen zu entfernen.
- Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Mediums in die Kulturschale. Falls zutreffend, fügen Sie Verbindungen, die untersucht werden sollten.
Anmerkung: 1.5 ml Medium, enthaltend 15 ng / ml Alpha-Linolensäure zugegeben. - Montieren Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop in der Lage, Live Cell Imaging. Sicherzustellen, 5% CO 2, 37 ° C und feuchter Atmosphäre.
Anmerkung: Die Befeuchtung ist besonders wichtig, mittlere Verdunstung zu vermeiden. - Erwerben Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden bei 10 min-Takt. Plan für große Dateigrößen. Hinweis: Eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln ist in der Regel ausreichend; Wir empfehlen jedoch die Verwendung von Bildern von mindestens 1.024 x 1,024.
- Messen Sie die Spaltbreite bei t = 0 h und bei t = 24 h unter Verwendung des Werkzeuglänge der Software mit dem Mikroskop geliefert oder verwenden Sie Open-Source-Software (zB ImageJ). Anmerkung: In der Regel spezifische Bilderfassung und -analyse-Software wird durch den Hersteller zur Verfügung gestellt. Daher ist für technische Details in Bezug auf die Verwendung der Software finden Sie in der Bedienungsanleitung.
5. Zelltracking
- In Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung, sorgfältig auswählen, die Zellkulturschalen oder Platten: Bei der Verwendung von DIC-Mikroskopie, zu vermeiden Kunststoffoberfläche basierend Kulturschalen oder Well-Platten, sondern verwenden Glas basierten Geräten statt.
Hinweis: Bei Verwendung Phasenkontrastmikroskopie, können Kunststoffgerichten verwendet werden. - Seed 5 × 10 4 EWG in DMEM ergänzt in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (beispielsweise 24-Multiwell-Platte) und pflegen Sie die Zellen mit 5% CO 2 bei 37 ° C und 95% Luftfeuchtigkeit für 1-2 Tage.
- Wenn Zellen wurden bis zu einer 80 gewachsen% Konfluenz, entfernen Sie die Medien und Kultur der Zellen mit neuen Medien in Anwesenheit der jeweiligen Testsubstanzen (zB 12,5 ug Chlorambucil / ml DMEM). Immer auch die Kontrollzellen (mit dem Lösungsmittel, zum Beispiel Ethanol behandelt) bei 37 ° C für eine bestimmte Zeitdauer (24 Stunden, abhängig von der individuellen Assay-System).
- Montieren Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop in der Lage, Live Cell Imaging (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit). Erwerben Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden in vordefinierten Intervallen. Erwerben Sie Bilder in 10-Minuten-Intervallen.
- Führen Sie manuell die Verfolgung der EWG durch den Einsatz der ImageJ Plugin MTrackJ. Wählen Sie 10-Zellen nach dem Zufallsprinzip aus dem Sichtfeld und verfolgen ihre Bewegungen, indem Sie einen Datenpunkt pro Punkt in der Zeit mit dem Befehl von MTrackJ "Hinzufügen".
Hinweis: MTrackJ ist kostenlos abrufbar und ImageJ ist availab [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le bei [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Ein ausführliches Handbuch über die MTrackJ Plugin auf "http://www.imagescience.org" zur Verfügung.
6. Live Cell Imaging / Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials
- Kultivieren EWG in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (zB 4 cm Glasboden Petrischale für Live Cell Imaging) bis zu einer 80% Zusammenfluss.
Wichtig: kultivieren Sie die Zellen bis zur Konfluenz abzuschließen. - Falls zutreffend, setzen die Zellen gegenüber Chemikalien. Anmerkung: Die Zellen wurden zu 12,5 & mgr; g / ml Chlorambucil 24 h ausgesetzt. Im Hinblick auf die spezifische experimentelle Design können Befehle variieren.
- Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Tetramethylrhodamin (TMRM) in DMSO. Vor Licht schützen. Hinweis: Die Stammlösung kann bei -20 ° C gelagert werden.
- Von der Stammlösung in Zellkulturmedium zu einer Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 uM (1: 1000 Verdünnung). Vor Licht schützenund die Verwendung als schnell wie möglich. Hinweis: Die Arbeitslösung kann bei Raumtemperatur für einige Zeit (> 1 h) gehalten werden, jedoch Zubereitung eines frischen Arbeitslösung ist sehr zu empfehlen.
- In 2 ul der Arbeitslösung zu 1 ml frisches Zellkulturmedium (Beladungslösung).
- Laden der Zellen durch Austausch des Zellkulturmedium mit der Auftragslösung. Proben für 15 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und befeuchteter Atmosphäre (Brutschrank). Achtung: Fast alle Fluoreszenzindikatoren werden von lebenden Zellen mit der Zeit ausgeführt werden; Daher vermeiden längerer Belastung oder verzögerten Analyse.
- Ohne Waschen, die Schale unter einem geeignet für Live Cell Imaging Mikroskop. Wichtig: Fluoreszenzindikatoren sind sehr lichtempfindlich, daher unnötige Lichtexposition.
- Bilder zu erwerben, ohne die Erfassungsparameter, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Bilder zu gewährleisten.
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Representative Results
Dermale Exposition Alkylierungsmittel provoziert Rötung, Blasenbildung und Hautgeschwürbildung, die mit einer Wundheilungsstörung assoziiert ist. Wundheilung erfordert Angio- und Vaskulogenese, die auf die Migration von Endothelzellen beruhen. Quantitative Migration kann durch die Verwendung des Boyden-Kammer-Assays bewertet werden. Wie in 1C Belichtung EWG zum eingesetzten Alkylierungsmittel Chlorambucil gezeigt führte zu einer signifikanten Abnahme der Zellmigration 9. Neben der ROS-Scavenger Alpha-Linolensäure (ALA) direkt nach der Exposition gegen Chlorambucil 24 h diesen Phänotyp signifikant gerettet, fast bis Steuerungsebenen.
Die Boyden-Kammer-Assay ist ein geeignetes Instrument, um die Anzahl (Quantität) der migrierten Zellen zu beurteilen. Allerdings ist der Test nicht geben Auskunft über die Migrationsverhalten der Zellen. Abbildung 2 zeigt, dass unbelichteten EWG sind in der Lage, die Lücke in der Wund- und Heil ass schließenay innerhalb von 24 Stunden 9. Im Gegensatz dazu waren EWG zu dem Alkylierungsmittel Chlorambucil ausgesetzt unfähig, die Lücke in der Wundheilungsassay 9 zu schließen. Außerdem Zellverfolgung einzelner EWG ergab, dass unter dem Einfluss von Chlorambucil gerichteten Bewegung wurde nicht beobachtet 9. Die Behandlung der EWG mit ROS-Fänger konnte gerichtete Zellwanderung 9 wiederherzustellen.
Mitochondriale ROS-Bildung mit Beeinträchtigung der Zellmigration 12 in Verbindung gebracht. Wie in Abbildung 3 Exposition EWG zu Chlorambucil gezeigt zu einem Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials 9. Die Behandlung der EWG mit ROS-Scavenger verhindert mitochondriale Schädigungen und behielt die mitochondrialen Membranpotentials.
Zusammenfassend werden alle im Protokoll Abschnitt beschriebenen Verfahren sind geeignete Werkzeuge zur Zellmigration zu beurteilen. Erkenntnisse über den Verlust oder die Erhaltung des mitochondrialen Membranpotentials kann v liefernaluable Hinweise in Bezug auf die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Zellmigration beeinträchtigt.
Abbildung 1. Boyden-Kammer-Test. (A) EWG wurden am Boyden-Kammer-Filtereinsätzen ausgesät, für 8 Stunden inkubiert, fixiert und mit DAPI gefärbt. Sternchen zeigen migriert EWG. In der vorgestellten Bild insgesamt 19 Zellen gezählt werden können (Abbildung 1B). Red Pfeilspitzen zeigen Zellen, die nicht über den Einsatz vollständig migriert haben oder und so, dass es nicht vollständig in dem Sichtfeld wurden von Zellzählung ausgeschlossen. (B) Die sich bei der Verwendung von langen Belichtungszeiten für die Bildaufnahme sichtbaren Poren (8 & mgr; m) in der Membran. Sie mit migrierten Zellen nicht zu verwechseln. (C) unter KontrolleBedingungen durchschnittlich 212 Zellen durch die Membran gewandert. Chlorambucil Exposition führte zu nur 128 gewanderten Zellen. Die Behandlung der Chlorambucil-exponierten EWG mit der ROS-Scavenger-Alpha-Linolensäure (ALA) deutlich gerettet Zellmigration. Symbole stehen für Einzelergebnisse von einem Filtereinsatz. Schwarze horizontale Balken zeigen Mittel (n = 4), Fehlerbalken zeigen SD und Sternchen zeigen signifikante Unterschiede. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Wundheilungsassay / Zellverfolgung. EWG waren scheinbehandelten (Austausch von Medium) bzw. auf 12,5 ug / ml Chlorambucil ausgesetzt. Nach Kratzen, Zellen were sucht über 24 Stunden. (A) EWG konnten die Lücke in der Wundheilungs Test innerhalb von 24 Stunden in der Erwägung, Chlorambucil ausgesetzt EWG schließen konnte, um die Lücke zu schließen. Behandlung mit ALA zu einer signifikanten Verbesserung der Zellmigration. (B) Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten mit jeweils 5 technische Replikate pro Gruppe (n = 15 pro Gruppe) werden angezeigt. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen und Sterne zeigen statistisch signifikante Unterschiede (One-way ANOVA, p <0,05). Geändert von Steinritz et al. (2014) 9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials. EWG waren scheinbehandelten, zu Chlorambucil (12,5 ug / ml) oder chloramb ausgesetztUCIL belichtet und ALA (15 ng / ml) behandelt. 24 Stunden nach der Exposition wurden die Zellen mit TMRM 15 min sofort geladen und bebildert. (A) unbelichtete EWG ergaben eine deutliche Signal nach TMRM Kennzeichnung was auf eine unbeeinträchtigte mitochondrialen Membranpotentials. (B) Chlorambucil Exposition führte zu einer signifikanten Abnahme der TMRM Signals. (C) Die Behandlung der Chlorambucil-exponierten EWG mit der ROS-Scavenger-Alpha-Linolensäure wieder die mitochondrialen Membranpotentials. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dermale Exposition gegenüber giftigen Chemikalien führt oft zu schweren Wundheilungsstörung. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der aus verschiedenen Phasen (Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung) besteht. Zellmigration in jeder Phase, wie auch immer, ist es von größter Bedeutung für die Bildung von Granulationsgewebe. Hier werden neue Blutgefäße entweder durch Angio- oder Vaskulogenese gebildet.
Beide Verfahren erfordern unberührt Migration von Vorläufer und frühen Endothelzellen. Beurteilung der Zellmigration und die Klärung der zugrunde liegenden Mechanismen für gestörte Zellmigration ist äußerst relevant, um neue therapeutische Strategien gegen Giftstoff induzierten Wundheilungsstörungen zu entwickeln.
Die Zellmigration kann durch verschiedene Ansätze beurteilt. Eine allgemein verwendete Technik ist die Boyden-Kammer-Assay, die ursprünglich eingeführt wurde, um Antikörper zu analysieren antigen verursacht Chemotaxis auf Leukozyten 13. Dieser Assay ist ein quantitativer Assay, der die Endpunkt Invasion Kapazität von Zellen aus dem oberen Abteil eines Transwell-Einsatzes mit dem unteren Fach in Reaktion auf eine chemoattraktive widerspiegelt. In der hierin beschriebenen Technik, wurde keine chemoattractant in die untere Kammer gegeben. So Chemokinese (random Migration ohne eine spezifische chemische Lockstoffe) der EWG unter Kontrolle Zustand oder als Reaktion auf Chlorambucil untersucht.
Der Einsatz besteht aus einer porösen Membran, die dreidimensionale Zellmigration durch die Poren der Membran ermöglicht. Die Porengröße der Membran, um in Bezug auf die Zellengröße ausgewählt werden: Poren, die zu klein wird Zellwanderung vollständig verhindert werden, die Poren, die zu groß werden ungehinderte Vorbeigehen aller Zellen ermöglichen, sind. Für Früh Endothelzellen wird eine Porengrße von 8 & mgr; m empfohlen. Die Benutzung eines ungeeigneten Porengröße wird in nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen. In order, um das Protokoll, um Zellen mit unterschiedlichen Eigenschaften als EWG anzupassen, empfehlen wir, mit einer Porengröße größer als die Kerne ab und erhöhen die Porengröße Schritt-für-Schritt, falls erforderlich. Beispielsweise ist für kleine Zellen wie Leukozyten einer Porengrße von 3 um wird empfohlen.
Ein kritischer Punkt ist die Bestimmung der Inkubationszeit bis zur Analyse. Mit der Zeit wird die Zellproliferation (zumindest in den Kontrollgruppen) stattfindet. Dies wiederum wird die Anzahl der Zellen, die durch die Membran durchdringen können, die möglicherweise die Empfindlichkeit des Verfahrens zu amplifizieren: selbst bei wenig beeinträchtigt Migrationsfähigkeiten können die Zellen in der Lage, über lange Zeiträume hinweg zu migrieren. Daher sind längere Zeit (zB 24 Stunden) nicht für Endothelzellen empfohlen. Andererseits, wenn die Inkubationszeit zu kurz nach dem Aussähen der Zellen, nur geringe Mengen von Zellen wird die Membran passiert haben. Ein 8-stündiger Inkubation wurde optimal gefunden. Nach der definierten Inkubationszeit von 8 Stunden, Zellen einneu fixiert, gefärbt und von Hand gezählt.
Es gibt drei mögliche Ansätze für die Analyse: (1) Zellen auf der Oberseite der Membran (die nicht gewandert sind) sind mit einem Tupfer entfernt. Dann werden die Zellen auf der Unterseite der Membran (gewanderten Zellen) gefärbt sind entweder mit einem zytologischen (zB Hämatoxylin) oder einem Fluoreszenzfarbstoff (z DAPI) und gezählt. (2) Alternativ Zellen auf der Unterseite mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff angefärbt werden und werden danach (beispielsweise durch die Verwendung von Trypsin) abgelöst. Die Fluoreszenz wird dann durch die Verwendung eines Fluoreszenz-Reader quantifiziert. (3) Wir empfehlen, dunkel gefärbte poröse Membranen, die Lichtdurchlässigkeit wodurch Differenzierung der nicht migrierten Zellen (Zellen auf der Oberseite der Membran) und migrierten Zellen (auf der Unterseite der Membran) zu blockieren. Nachdem die Fluoreszenzfärbung (zytologische Farbstoffe nicht verwendet werden können) Zellen auf der unteren Seite sind mit einem Fluoreszenzmikroskop gezählt. Es ist wichtig, nicht zu confound Membranorientierung. Verwendung eines undurchsichtigen Membran vermeidet die Notwendigkeit, nicht-gewanderten Zellen zu entfernen. Die Verwendung von opaken Membranen Fluoreszenzfärbung und manuelle Zellzählung überlegene zu den anderen Ansätzen abgewendet.
Im Allgemeinen ist der Boyden-Kammer-Assay ein Assay, das einfach zu handhaben ist und somit ist es eine häufig angewandte Methode zur Beurteilung der Zellmigration. Es gibt jedoch zwei Hauptnachteile auf: (1) Die Boyden-Kammer-Assay ist ein Endpunkt-Assay. Das heißt, wenn der Zeitpunkt der Analyse nicht korrekt ist, das Ergebnis kann irreführend sein. (2) Der Test ist nicht leicht zu automatisieren. Dennoch ist dieser Assay eine der wertvolle Werkzeuge zur Beurteilung der Zellmigration.
Im Gegensatz zum statischen Boydenkammer Assay der Wundheilungstest (auch als Spaltverschluß Assay oder Kratztest bezeichnet) ist ein dynamischer Test in Echtzeit. Es ist eine zweidimensionale Migrationstest ohne drei Zellinvasion Bewegungen dimensional. Nach "Verwundung" von Zellschichten mit einer Pipettenspitze, wandern Zellen in den Spalt. Der Test ist einfach durchzuführen und vermeidet die Probleme einer statischen Endpunktassay. Jedoch weist der Assay einige Prüfungen: (1) einem lebenden Zellen mikroskopisches System (37 ° C, 5% CO 2 mit befeuchteter Atmosphäre) erforderlich. Stellen Sie sicher, dass die Zellkulturschalen nicht austrocknen. (2) Zeitraffer-Bildaufnahme wird in große Dateien in Abhängigkeit der verwendeten Parameter (Auflösung, Intervall) zur Folge haben. (3) Scratching the Zellschicht mit einer Pipettenspitze ist nicht so einfach, wie es zunächst erscheinen mag. Zu viel Druck wird der Geschirroberfläche, die in Artefakten führen kann beschädigt werden. Darüber hinaus kann die Spaltbreite innerhalb der Kratz unterschiedlich sein und zwischen verschiedenen Forschern abweichen. Ein erfahrener Ermittler wird empfohlen. (4) Die Anzahl der Proben, die parallel ausgeführt werden können, wird durch das Gerät begrenzt. Dennoch ist der Wundheilungs Assay ein weiteres wertvolles Werkzeug für die quantitative und Qualitative Beurteilung der Zellmigration. Informationen über Wanderungsgeschwindigkeit, Laufstrecke, kann gerichtete Wanderung in einem Versuchsaufbau entnommen werden. Zellverfolgung in einem zweidimensionalen System ist nicht sehr schwierig und kann mit Open-Source-Software (zB ImageJ und MTrackJ) durchgeführt werden.
Beschichtung der Zellkulturschalen ist nicht nur für die Zellanheftung wichtig, aber hat einen wesentlichen Einfluss auf die Zellfunktion im Hinblick auf die Migration. Endothelzellen werden routinemßig auf 0,1% Gelatine beschichtete Oberflächen kultiviert. Verwendung von nicht-beschichteten Oberfläche für endotheliale Zellkultivierung zu einer verringerten Proliferation 14. Andere Beschichtungen (zB Fibronektin) erwiesen sich auch bei Kurzzeitkultivierung geeignet zeigte jedoch Gelatine Beschichtungen überlegene Leistung bei Langzeitkultivierung Experimenten 15.
Es gibt zahlreiche Fluoreszenzfarbstoffe auf dem Markt für Live Cell Imaging. Wir haben chosen TMRM auf das mitochondriale Membranpotential zu untersuchen. Viele andere Farbstoffe (zB JC-1, TMRE) weisen eine vergleichbare Leistung. Im Gegensatz zu monochromatischen Sonden (TMRM, TMRE), JC-1 Fluoreszenzverschiebungen von grün auf rot nach Akkumulation in den Mitochondrien. Dies ermöglicht eine ratiometrische semi-quantitative Analyse der mitochondrialen Polarisationszustand, sondern behindert Doppelfärbung Experimente 16 (zB mit tracker Farbstoffe Mitochondrien zu identifizieren). Nach unserer Erfahrung der Farbstoff selbst ist für das Experiment weniger kritisch, während die Versuchsanordnung, die Handhabung von Zellen und Übernahmen ist anspruchsvoll und erfordert viel mehr Aufmerksamkeit. Fast alle Fluoreszenzfarbstoffe sind lichtempfindlich. Daher sollte Zellenbelastung in der Dunkelheit durchgeführt werden. Zelle Lade benötigt 15-30 min. Eine verlängerte Ladezeiten nicht zu einer erhöhten Signalen führen und wird nicht empfohlen. Obwohl spezifische Signale konnte nach langen Ladezeiten festgestellt werden, kann der Farbstoff in subzellulären Fach ansammelnrungen oder sogar aus der Zelle entlassen werden. Infolgedessen sollten die Zellen unmittelbar vor der Analyse und nicht unbedingt am Anfang des Experiments geladen werden. Die Farbstoffbeladungskonzentration liegt üblicherweise im Bereich von 10 uM. Doch mit TMRM viel geringeren Konzentrationen (20 nM) wurden ausreichend zur Beschriftung gefunden und immer noch gab vernünftige Ergebnisse. Wie in Abbildung 3 Kennzeichnung 24 Stunden nach der Chlorambucil Exposition führte zu einem deutlichen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials. Behandlung von Chlorambucil ausgesetzt EWG mit ROS-Fänger konnte mitochondrialen Membranpotentials bei 24 Stunden nach der ersten Exposition zu halten.
Zusammenfassend Boyden-Kammer-Assay, Wundheilungs Assay in Kombination mit Einzelzellen-Track-Analyse sind wertvolle Werkzeuge, um das Migrationsverhalten im Hinblick auf die qualitativen und quantitativen Aspekte beurteilen. Kennzeichnung von mitochondrialen Potential mit TMRM kann helfen, zugrunde liegenden Mechanismen zu identifizieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H.
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B.
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
