Energy Dispersive X-ray Tomography for 3D Elemental Kortlægning af Individuelle Nanopartikler

Introduction

Formålet med denne fremgangsmåde er at tilvejebringe nøjagtig bestemmelse af den tredimensionale fordeling af elementer inden enlige nanopartikler. Dette udføres ved anvendelse af energi Dispersive X-ray (EDX) spektroskopi i forbindelse med en tomografisk rekonstruktion udføres i scanning transmission elektron mikroskop (STEM).

Energy Dispersive X-ray spektroskopi har længe været anvendt som en teknik til at kvantificere og rumlig kortlægning af elementer i transmissionselektronmikroskopi prøver. Med fremkomsten af høj vinkel ringformet mørk felt (HAADF) STEM tomografi for den tredimensionelle billeddannelse af krystallinske materialer ^1, blev energy dispersive røntgentomografi også foreslået som en metode til at tillade bestemmelse af elementært distributioner i tre dimensioner ^2. De tidlige undersøgelser var begrænset på grund af udformningen af ​​X-ray detektorer inden transmission elektronmikroskop. Specielt disse traditionelle dedetektor motiver havde virkningsgrader relativt lave indsamlings- og måles noget signal på et stort udvalg af hældningsvinkler skyldes shadowing fra prøveholderen ^2,3. Indførelsen af nye geometriske designs af X-ray detektorer i (scanning) transmissions elektron mikroskop har gjort energi dispersive røntgentomografi en levedygtig teknik og har ført til en række nylige undersøgelser ^4-6.

HAADF STEM imaging er en meget anvendt elektron tomografi imaging mode og er i stand til at levere kompositoriske oplysninger i specifikke situationer baseret på atomnummeret følsomheden af ​​HAADF signal intensitet. F.eks HAADF tomografi er velegnet til studiet af nanopartikler med diskrete elementært regioner, f.eks, veldefineret kerne-skal-morfologier ^7, men kan ikke bruges, når elementer har en mere kompliceret distribution. Electron energitab spektroskopi (EELS) giver en komplementær tilgang til bestemmelse af tredimensionelle elemental fordelinger i STEM ^8. I denne teknik tabene fra den indfaldende elektronstråle energi anvendes til at bestemme sammensætningen af prøven, og dette har den fordel højere signal-til-støj-forhold, end der ofte opnås ved EDX spektroskopi ^9. Ulempen af ​​ål er, at multipel spredning overvejelser pålægge strenge begrænsninger på prøven tykkelse, og i flere situationer analyse kompliceres af tilstedeværelsen af ​​forsinket start kanter eller overlappende spektrale træk. Således er EDX spektroskopi ofte bedre egnet til at studere tunge grundstoffer, såsom dem ofte forbundet med katalytiske eller plasmoniske nanopartikel systemer ^9. Derudover, som et fuldt spektrum billede opsamles i EDX spektroskopi er det ligetil at efterfølgende identificere uventede elementer, som er vanskeligere i energi filtreret transmissionselektronmikroskopi (EFTEM) og EELS grund af deres hyppighed af elementært information overlappende eller være udenforspektralområdet af datasættet.

Den ideelle prøve geometri for EDX tomografi består af en nål formet prøve suspenderet i et vakuum og orienteret langs tomografiske tilt akse ^4. Denne situation sikrer, at der ikke er nogen skygger af EDX detektorer til enhver hældningsvinkel ved enten prøven eller indehaveren af ​​prøven. Men samlingen af de krævede nåleformede prøver til nanopartikler systemer er udfordrende ¹⁰ og prøveforberedelse normalt består af blot at overføre nanopartikler på en tynd carbon film TEM support gitter. Disse gitre anvendes med en tomografi prøveholder specielt udformet, så den kan vippes til store vinkler (≈ ± 75 °), men shadowing af EDX detektorer inden for dette område af prøven hældningsvinkler er uundgåelig og kunne forringe kvaliteten af ​​den resulterende tomografisk rekonstruktion. Denne shadowing er karakteristisk for en bestemt mikroskop-detektor-holder opsætning og kan derfor afskrækkeudvindes ved måling af en korrekt kalibrering prøve før købet ^11. Enkelt sfæriske nanopartikler er en ideel kalibrering prøven som intensiteten af ​​X-ray tæller fra disse prøver bør være konstant i alle tilt vinkler. Detektoren shadowing kan derefter kompenseres ved enten at variere købet tid på hver vinkel eller ved multiplikation med korrektionsfaktor efter dataopsamling. anvendes den tidligere fremgangsmåde for at minimere elektron dosis samtidig maksimere signal-støj-forhold.

Protocol

1. Nanopartikel Synthesis

1. Opløs 10 g polyvinylpyrrolidon (PVP) (MW = 10.000 g / mol) i 75 ml ethylenglycol ved stuetemperatur. Der tilsættes 400 mg af _AgNO3 til denne opløsning.
2. Stir opløsning indtil _AgNO3 er fuldstændigt opløst, og derefter opvarmes på varmeplade til 100 ° C ved en konstant hastighed på 1 ° C ^min-1. Lad reaktion forløbe ved 100 ° C i 1,5 timer.
3. Tilsættes 175 ml destilleret vand og afkøles til stuetemperatur. Der centrifugeres ved 8.000 xg, fjern supernatanten og redispergere nanopartikler i 50 ml destilleret vand. Gentag tre gange.
4. Opløs 500 mg PVP (55.000 g / mol) i 500 ml ethylenglycol ved stuetemperatur. Tilføj denne opløsning og 27,8 ml af Ag nanopartikel suspensionen fra det foregående trin til en 1.000 ml rundbundet kolbe. Kolben opvarmes ved 100 ° C i 10 min.
5. Tilføj hydrogen tetrachloroaurate trihydrat til 1.000 ml vand til dannelse af en 0,2 mM opløsning af AuCl ₄ ^- _(aq) 4 ^- _(aq) dråbevis til opløsningen opnået i det foregående trin til opnåelse AgAu nanopartikler af gennemsnitlige sammensætning Ag93Au7 (Ag 93 ved% Au 7 ved%), Ag82Au18 ( Ag 82 på% Au 18at%), Ag78Au22 (Ag 78 ved% Au 22 ved%) og Ag66Au34 (Ag 66 ved% Au 18 ved%) hhv.
6. Der afkøles til stuetemperatur og derefter vaske med destilleret vand tre gange ved successive runder af centrifugering ved 8000 x g, fjernelse af supernatanten og redispergering i 50 ml destilleret vand. Tilsættes 0,05 ml af nanopartikel opløsning til 10 ml DI-vand.

2. TEM Prøvefremstilling

1. Pipette ca 0,05 ml af nanopartikel løsning på en vandudtryk / fortsat carbon TEM gitter. Brug en metalunderstøtning anvendes til TEM gitre af beryllium at begrænse falske røntgenstråler, selv om en Cu eller Au gitter vil være tilstrækkeligt, hvis der er nogen overlappende toppe af interesse med Cu eller Au i prøvens EDX-spektret. Brug større migsh størrelser (fx 200 mesh) for at minimere muligheden for shadowing fra nettet.
2. Efter nanopartikel opløsningen er tørret, rense TEM net ved vask gitrene i ren methanol eller ethanol. Pipette 10-20 dråber over TEM gitter, mens den holdes ved hjælp af anti-kapillær crossover pincet. Fjern overskydende væske efter hver dråbe fra nettet ved hjælp af filtrerpapir rørt forsigtigt på kanten af ​​nettet.
3. Anneal gitter på omkring 80 ° C (helst i vakuum) for at reducere forureningen under elektronstrålen ved at fjerne eller immobilisere resterende forurening.

3. Karakterisering af Detektor Shadowing

1. Load nanopartikler på TEM support gitter i tomografi holder og derefter indsætte holderen i TEM.
2. Vent på, at mikroskopet vakuum for at nå en passende stabil værdi (under ca. 1,8 x 10 ^-7 Torr). Åbne kolonne ventiler og sikre elektronstrålen kan ses på mikroskoper fluorescerende scReen.
3. Juster STEM.
   Bemærk: Her linjeføringer for en Titan G2 sonde-side aberration korrigeret STEM instrument betjent ved 200 kV sammen med en 2020 tomografi holder beskrives. Optimale justering procedurer for andre mikroskoper kan variere en smule fra de beskrevne.
   1. I STEM diffraktion tilstand, skal du bruge en ud-af-fokus skyggebillede at bringe prøven til eucentric højde. For at gøre dette, vippe scenen mellem ± 15 ° ved at trykke på knappen Alpha Wobbler i fanen Søg og minimere enhver flytning af funktioner i prøven ved at justere z-højde.
   2. Flyt prøven således at bjælken er over et hul i prøven og sikre, at den passende kondensator blænde er korrekt justeret ved at centrere skyggen af ​​åbningen i en under fokuseret billede af sonden. Wobble intensiteten og sikre en målrettet sonde ikke bevæger at tjekke for stråle tilt forskydning.
   3. Flyt prøven, således at et område af amorf carbon er i betragtning og fokusere væreer i diffraktion tilstand for at få Ronchigram. Wobble fokus at observere afvigelser i Ronchigram, og korrigere for disse (f.eks bygningsfejl og aksial koma) om nødvendigt.
4. Trace omridset af gitter firkantet (en tæt på centrum af nettet) ved at vælge "Vis Tracks" i fanen 'Search' og efter omridset af gitter firkantet mens billeddannelse. Dette gør det nemt at sikre efterfølgende målinger udføres for nanopartikler, der er i midten af ​​gitteret firkant for at reducere sandsynligheden for shadowing fra bæreren nettet. Såfremt købet udføres på en partikel tæt på et gitter bar et par af detektorer vil blive skygget over et meget større udvalg af prøven tilt vinkler.
5. Find en repræsentativ partikel i den midterste del af gitter firkantet. Tilt til maksimal hældning vifte af holderen (sædvanligvis ± 70 °), mens imaging at sikre, at nanopartikler ikke sløres af GRId bjælker i store holder vipper.
6. Anskaf HAADF og EDX spektrum billeder ved hjælp af en konstant erhvervelse tid (fx 5 min) over hele spektret af hældningsvinkler (normalt ± 70 °) ved hjælp af kantede trin på mellem 5-10 °. Først erhverve et overblik HAADF billede ved at klikke Acquire i ruden billeddannelse. Vælg en kortlægning vindue omkring nanopartikel ved at trække boksen i billedet, og tryk på Hent.
7. Uddrag karakteristiske X-ray tæller fra EDX spektrum billeder til at bestemme tidsintervaller for dataindsamling ved at åbne de spektrale datacubes i billedbehandling software (som RAW-filer). Derefter opsummere intensiteten af ​​skiver af datacube der svarer til de kanaler af energien af ​​toppene af interesse ved at bruge funktionerne slice2D og sum, scripts indgår som supplerende kode 1-3.

4. EDX Tomography Acquisition

1. Gentag trin 3,1-3,5 for nanopartikler eksemplar af interesse.
2. Anskaf HAADF ennd EDX spektrum billeder med tidsintervallerne bestemt fra detektoren shadowing karakterisering af det foregående afsnit for en række eksemplar tilt vinkler (normalt ± 70 °), på samme måde som trin 3.6.

5. Genopbygning og visualisering

1. Udarbejde tilt serie HAADF billeder i MRC filformat via en af ​​følgende måder:
   1. Brug MRC forfatter i billedet visualisering software ¹² (Filer> Gem som> MRC forfatter) efter import HAADF TIF som en »Billede Sequence '.
   2. Alternativt kan du bruge tif_to_mrc funktion i tomografi softwarepakken ^13.
2. Cross-korrelat HAADF billeder i den valgte software for at få et groft tilpasning af tilt-serien. Gem tilpasningen data som enten en .sft fil eller som fil xcorr.txt. I tomografi software oprette et filter i Setup Filter vindue, der giver det skarpeste top i korset rude Korrelation. <ol>
3. Efterfølgende tryk sker i Beregn Alignment Skifter vindue til at udføre cross korrelation for hele tilt-serien. Gentag justeringen, indtil lokale skift er under 1 pixel, hvilket sikrer at gemme alle skift filer på hvert trin som tekst.
   Bemærk: Omhyggelig opsætning af filteret bruges, når du udfører krydskorrelation er nogle gange nødvendigt at sikre en god tilpasning af tilt-serien data.

I billedbehandling software, indlæse de erhvervede spektrale datacubes og udtrække kort, der er de summerede skiver af energi kanaler svarer til de elementer af interesse ved hjælp af slice3d og sum scripting funktioner, scripts indgår som supplerende kode 4 og 5.

Anvend de alignments bestemt fra HAADF billeder til de udpakkede EDX elementært kort. Udfør denne i tomografi rekonstruktion software i fanen Anvend Justering ved at vælge "Brug Skifter fra Alignment datavisning".

Hvis det er nødvendigt, udføre tilt justering akse itomografi genopbygning software på HAADF billedet serien og gælder for både HAADF billeder og kort EDX ved at kontrollere "Brug Rettelser fra Tilt Axis Justering Task" i 'Anvend Justering' fane.

Rekonstruere tomografisk datasæt for hver af de ekstraherede EDX elementært signaler under anvendelse en samtidig iterativ rekonstruktion teknik (SIRT) algoritme gennemføres inden for en tomografi softwarepakke, der sikrer, at dimensionerne af genopbygningen er de samme for alle elementer. I tomografi genopbygning software, oprettet parametrene i Volume vinduet Genskab (størrelse volumen, 20 iterationer, etc.), og tryk på Fortsæt. Sørg for, at genopbygningen parametre er de samme for hvert element.

Uddrag orthoslices af de separate elementært rekonstruktioner ved at vælge Billede> Stakke> ortogonale i billedet visualisering software ^12.

Konstruere og visualisere yderligere orthoslices, volumen og overflade renderings fra rekonstruktioner ved hjælp af visualisering software. Læg alle elementære rekonstruktioner og sikre, at skalaen er indstillet korrekt, da dette ofte ikke overføres fra .rec filer.

1. Vælg genopbygning objekt i objektet pool og højreklik og vælg orthoslice modul til at udtrække en orthoslice. Højreklik på genopbygning og vælg volumen rendering til at udtrække et volumen rendering. Uddrag en isosurface ved at højreklikke på genopbygning og vælge isosurface.
   Bemærk: Automatisk segmentering gennem tærskling er en mere robust metode, men hvor signal-støj-forholdet er dårlig manuel segmentering kan være nødvendigt at fjerne støjende voxels udefra nanopartikel volumen for isosurface visualisering.

Representative Results

Karakteriseringen af detektor shadowing for en 2020 tomografi holder i en Titan G2 ChemiSTEM vises i figur 1A. Detektorerne her benyttede er den for Super-X detektor, hvori fire detektorer er ansat på lige azimutale vinkler på 90 ° rundt om optiske akse, hvilket resulterer i en detektor rumvinkel på større end 0,6 sR ^14. Karakterisering af detektorerne tillod bestemmelse af betalt tomografiske erhvervelsestider vist i figur 1B. Efter anvendelse af disse indfangningstider tællingerne ved hver hældningsvinkel bør forblive stort set konstant for enkelte nanopartikler, som vist i figur 1C.

Bimetal AgAu nanopartikler, syntetiseret af den galvaniske udskiftning reaktionen, blev undersøgt ved anvendelse af EDX tomografi i stilken. I denne reaktion, en opløsning af AuCl ₄ ^- ertilsat til Ag nanopartikel frø. Au reduceres på overfladen af ​​nanopartiklerne som Ag oxideres, hvilket resulterer i en bimetallisk sammensætning og udhuling af den oprindelige frø. Tidligere mente man, at Ag og Au dannet en homogen legering i hele denne proces, og at variationer i katalytiske og optiske egenskaber var simpelthen på grund af udhuling og bulk kompositoriske variationer. Men tredimensionelle elementært kortlægning udført under anvendelse EDX tomografi viste overflade adskillelse inden for AgAu nanopartikler syntetiseret ved den galvaniske reaktion (figur 2). Ved sammensætninger af lav Au, nanopartiklerne vise klar Au overflade adskillelse. Men som Au indhold stiger denne overflade adskillelse skifter så til de højeste Au indhold der er en klar Ag overflade adskillelse (figur 3). Denne kobling af overfladen adskillelse korrelerer med ændringer i udbyttet af propargylamines i en tre-komponent koblingsreaktion syntetiseret af forskelligskellige sammensætninger af disse AgAu nanopartikler.

Skiver ved rekonstruktion, der er vinkelret på retningen af ​​elektronstrålen tilvejebringe en sammenligning med standard todimensionale elementært kort. De første kort indeholder oplysninger om sammensætningen summeres langs retningen af ​​bjælken, og dette kan ofte være vanskelig at fortolke på grund af overlappende områder af forskellige sammensætninger eller, i tilfældet med den AgAu nanopartikler undersøgt her, på grund af optagelse af de øverste og nederste overflader i fremspring (Figur 3A-C). Idet skiver ved rekonstruktion tillader fjernelsen af intensiteten forbundet med de øverste og nederste overflader af partiklerne og resulterer derfor i en meget klarere visning af overfladen adskillelse i dette tilfælde (figur 3D-F).

Karakterisering af detektor shadowing anvendelse af en enkelt AgAu nanopartikel. (A) Tællingerne af Ag og Au røntgen toppe som funktion af hældningsvinklen fra en enkelt AgAu nanopartikel der ansættes en erhvervelse indstillede tid (5 min). (B) erhvervelse gange bestemmes ud fra (A) og efterfølgende anvendes til at erhverve tilt-serien. (C) De tællinger af Ag og Au røntgen toppe som en funktion af tilt vinkler fra en enkelt AgAu nanopartikel når beskæftiger erhvervelse gange fra (B). Tællingerne forbliver nogenlunde konstant i alle tilt vinkler. Fra Slater et al. ^15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Rekonstruktion af et lavt Au indhold AgAu nanopartikel. (A) Orthoslice ved rekonstruktion Au. (B) Orthoslice ved rekonstruktion Ag. (C) Linje profiler taget gennem orthoslices (A) og (B) viser den klare Au overflade adskillelse i denne nanopartikel. (D) Overflade visualisering af Ag og Au rekonstruktioner. Fra Slater et al. ^15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Rekonstruktion af et højt Au indhold AgAu nanopartikel. (A) 2D EDX kort over Au og (B) 2D EDX kort over Ag. (C) Linje profile taget gennem 2D EDX kort (A) og (B), der viser problemer med at bestemme overfladen adskillelse i denne nanopartikel fra 2D kort alene. (D) Orthoslice ved rekonstruktion Au. (E) Orthoslice ved rekonstruktion Ag. (F) Linie profiler taget gennem orthoslices (D) og (E) viser den klare Ag overflade adskillelse i denne nanopartikel. (G) Overflade visualisering af Ag og Au rekonstruktioner. Fra Slater et al. ^15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Protokollen præsenteres her tilvejebringer en fremgangsmåde til bestemmelse af elementært fordeling af enhver multi-element nanopartikel i tre dimensioner. I tilfælde af AgAu nanopartikler præsenteres her, er overfladen adskillelse af begge elementer tydeligt identificeret og er vist at være korreleret til katalytisk udbytte i en tre-komponent koblingsreaktionen. Dette viser klart anvendeligheden af ​​denne teknik i at hjælpe til at forklare de fysiske og kemiske egenskaber af nanopartikler systemer.

Som det altid er tilfældet i TEM, bør der udvises forsigtighed i prøveforberedelse at sikre de bedst mulige resultater. Grundig vask og annealing af gitrene efter deponering nanopartikel løsning er især vigtigt at undgå ophobning af forurening carbon gennem den store elektron dosis nødvendig for EDX tomografi. Den store dosis ansat kan også resultere i alvorlige skader på Holey carbon film, især hvis den tynde sektioner ofte mellem hulS, men siliciumnitrid support film kan favorisere oxidation af nanopartikler ^16.

Korrektion af detektor shadowing effekter er vigtigt at producere en præcis rekonstruktion, især hvis teknikken skal anvendes til kvantitativ kortlægning af elementære udlodninger i fremtiden. Dette kan opnås gennem nøjagtig karakterisering af detektoren skygning og efterfølgende at variere elektron dosis for nanopartikel. Alternativt kan shadowing kompenseres ved at gange spektrum billeder med en korrektionsfaktor efter overtagelsen. Men anvendelsen af ​​denne teknik til at give kvantitative oplysninger i tre dimensioner er endnu ikke muligt på grund elektronstråle skader af nanopartikler, der begrænser X-ray tæller opnåelige i hvert spektrum billede.

Kalibrering er nødvendig for at kompensere for EDX detektor shadowing som funktion af hældningsvinklen for en bestemt mikroskop-detektor-holder kombination. shadowing bør i første omgang bestemmes ved hjælp af en prøve, der giver ingen variation i X-ray tæller for forskellige eksemplar tilt vinkler og individuelle sfæriske nanopartikler forventes at opfylde dette kriterium, når deres sammensætning er stabilt under elektronstrålen over tid, det tager at erhverve tilt serie. Hertil kommer, for krystallinske nanopartikler, enhver hældningsvinkler hvor elektronstrålen er orienteret langs en større zone-akse nanopartikel bør fjernes og nanopartikel skal være lille nok til at undgå betydelig X-ray absorption. Derfor, når EDX spektrum billeder af en enkelt nanopartikel erhverves over hele spektret af mulige eksemplar hældningsvinkler ved hjælp af en konstant erhvervelse tid, vil eventuelle variationer i den målte karakteristisk røntgen intensitet skyldes detektoren shadowing alene. De indfangningstider og dermed dosen, derpå varieret i efterfølgende erhvervelser at kompensere for den skyggedannelse hvilket betyder, at de totale signal tæller er ca. conkonstant for alle spektrum billeder erhvervet i tilt-serien.

I forhold til HAADF eller ål billedbehandlingstilstande, EDX erhvervelse tomografiske data er stadig i sin meget tidlige stadier. Trods indførelsen af ​​X-ray detektorer med højere faste vinkler den største begrænsning af EDX-tomografi, som det ofte er tilfældet for todimensional EDX billeddannelse, er den lave signal. På trods af dette, en fordel, at EDX spektroskopi kan rumme over ÅL for nogle nanopartikler systemer til bestemmelse af små mængder af tunge grundstoffer i ret store nanopartikler. Større flerkomponent nanopartikler (> 100 nm) er ofte velegnet til EDX undersøgelser, da de giver flere tæller, og der er færre problemer med deconvolving spektrale overlapninger, men der bør udvises forsigtighed for at bruge høj energi X-ray toppe, der gennemgår lidt absorption.

Samlet set EDX tomografi er en fremragende metode til bestemmelse af elementært uddelingerne i nanopartikler i tre dimensioner, although begrænset til nanopartikler, der kan modstå en relativ høj elektron dosis uden betydelig skade. Yderligere stigninger i de faste vinkler i X-ray detektorer inden for STEM og yderligere optimering af tomografiske eksemplar indehavere vil give denne teknik til at rykke endnu længere og blive en vigtig metode i karakterisering af individuelle nanopartikler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Titan G2 80-200 STEM	FEI		With Super-X detector
2020 tomography holder	Fischione
Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160
EDX Acquisition software	Bruker		Esprit
Tomographic alignment and reconstruction software	FEI		Inspect3D, alternatives available
Tomographic alignment and reconstruction software package	University of Colorado		IMOD, alternatives available
Visualisation software	FEI		Avizo, alternatives available
Image processing software	Gatan		Digital Micrograph, alternatives available
Image visualisation software	Open Source		Fiji, alternatives available
Polyvinyl-pyrrolidone	Sigma-Aldrich	856568
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	V900208
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	209139
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75007200
Round bottom flask	Sigma-Aldrich	Z41,452-2	1,000 ml
Hydrogen tetrachloroaurate trihydrate	Sigma-Aldrich	520918