一种利用电穿透图（EPG）获取和测量韧皮部筛管元件电信号的新应用

摘要

电穿透图谱（EPG）是一种研究具口针昆虫取食行为的成熟技术。本文展示了EPG作为一种非侵入性工具的新应用，用于获取植物韧皮部筛管元件（SEs）的细胞内电生理记录，筛管元件是构成植物韧皮部维管组织的细胞。

摘要

细胞的电生理特性常被研究 体外，从其原始环境中分离后。然而，要研究生物体内远距离细胞之间的电传递，则需要 体内，无伪迹地记录嵌在天然环境中的细胞。植物受伤区域向未受伤区域传递电信号的现象长期以来一直引起植物学家的兴趣。韧皮部是遍布植物体内的活体维管组织，被认为在植物电信号传导中起主要作用。然而，由于缺乏合适的电生理学方法，研究韧皮部细胞的电学特性面临诸多挑战。 体内. 本文介绍了一种利用活体蚜虫或其他韧皮部取食型半翅目昆虫整合到电穿透图谱（EPG）电路中，用于筛管分子（SEs）细胞内电生理研究的新方法。该方法具有多功能性、稳定性和高精确度，使得能够详细记录和研究模式植物主脉筛管分子中由伤口诱导产生的电信号 拟南芥¹在此，我们展示了EPG电极可轻松用于边缘叶脉中筛管分子（SEs）的细胞内电生理记录，并可用于研究SEs对多种外界刺激产生电信号反应的能力。将EPG技术应用于SEs的细胞内电生理学研究，可广泛适用于多种植物物种、大量的植物-昆虫组合以及多种研究目的。

引言

产生远距离电信号的能力是一种多细胞生物的有利性状，可使其对外部刺激产生高效反应。这一性状在植物和动物中独立演化，因此属于趋同演化的案例。鉴于动物中的电信号与神经传导和肌肉收缩等重要功能密切相关，动物中由刺激诱导的电信号的分子基础、传递机制及其功能已成为深入研究的课题。相比之下，植物中由刺激诱导的电信号研究较少。尽管植物没有神经或肌肉，但已有足够证据表明，植物中由刺激诱导的电信号在其对环境因素的响应中起着关键作用。

韧皮部作为植物维管组织的活体组成部分，被认为是在受刺激/受损区域与未受刺激/未受损区域之间传递刺激诱导电信号的主要媒介²韧皮部中的主要细胞是筛管分子（SEs），这类细胞结构相对简单，呈长形。SEs的末端与其他SEs相连，形成贯穿整个植物体的连续低阻抗筛管系统。然而，针对这些高度特化细胞的电学特性研究甚少。在以往的研究中，研究人员使用玻璃微电极进入SEs³ 或使用与蚜虫口针相连的玻璃电极，在进行口针切除（切割）后插入植物⁴玻璃微电极由玻璃毛细管制成，通过加热将一端拉制成尖端直径小于 1 µm 直径，然后用KCl溶液填充。将一根Ag/AgCl电极或铂丝插入充满KCl溶液的玻璃电极中，并连接至放大器输入端，参考电极则插入包围目标细胞的浴液中，以形成完整电路。该装置用于记录细胞外参考电极与细胞内测量电极之间的电位差。 即， 细胞的膜电位⁵利用该方法，Umrath 首次对....

方案

1. 蚜虫饲养

注意：EPG 记录所用植物和蚜虫种类的选择取决于研究目的。对于拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究，选用菜豆蚜（Brevicoryne brassicae）是合适的。

1. 在温室中以Brassica oleracea饲养B. brassicae蚜虫。将用于饲养蚜虫的植株置于防虫网罩中，以避免污染其他植株。将蚜虫饲养植株与实验用植株（本实验中为B. oleracea和A. thaliana）分别放置于不同房间，以防止实验植株被蚜虫污染。
2. 大约每两周将蚜虫转移至新鲜植株一次，以避免造成显著的植株损伤或种群过度繁殖。每次转移10–20只成年蚜虫至新的饲养植株，以建立新的种群。
3. 定期检查饲养植株，防止其他蚜虫种类、昆虫植食者、蚜虫寄生蜂以及可能影响蚜虫种群健康的真菌污染。
4. 用于EPG记录的蚜虫应为最后一次蜕皮后一周内的成年无翅型个体。
5. 实验结束后，将未使用的实验植株放回生长室，因为这些植株上通常已产生部分后代，若不妥善处理可能意外污染其他植株。

2. 用于EPG记录的昆虫接线

1. 制作昆虫电极时，需准备黄铜连接针（钉子，Ø 1.2 mm）、细铜线（Ø 0.....

结果

在之前的一项研究中，我们采用了EPG电极技术，旨在表征毛虫攻击期间中脉筛管分子（SE）产生的电信号¹。中脉是传统玻璃电极以及玻璃微吸管电极的首选插入位点，因为该部位筛管分子密集且结构相对坚固，便于实施这些技术所需的固定操作。在此，我们利用EPG电极的灵活性，旨在获取更难接近的筛管分子的电生理信息，特别是叶片边缘叶脉中的筛管分子。图3展示了来自拟南芥（A. thaliana）植物边缘叶脉筛管分子的典型EPG记录，其中包含由远端创伤诱导的电信号。与主脉筛管分子不同，边缘叶脉中的筛管分子对远端损伤产生单一的、缓慢去极化波，该波可能对应于中央筛管分子中的缓慢去极化波。平均而言，叶片边缘筛管分子中这种远距离诱导的缓慢去极化波持续时间为61 ± 27秒，平均振幅为37 ± 2 mV（n = 3，均值 ± 标准误）。这些通过EPG电极易于获得的数据表明，创伤诱导的电信号可在未受伤叶片中从主维管束传播至细小叶脉的韧皮部。

我们还利用了EPG电极的稳定性，探究一个筛管分子（SE）是否能够响应在数分钟时间间隔内施加的多种损伤刺激.......

讨论

本文提供了一种进行电穿透图（Electrical Penetration Graph，EPG）记录的详细实验方案。EPG技术已得到广泛应用，全球约有100至200名活跃用户，并已被用于多个不同领域的研究，例如：a）寄主植物对蚜虫及其他具刺吸式口器昆虫的抗性研究¹³；b）植物病毒与病原体传播机制的研究¹⁴；c）杀虫剂作用机制（包括毒性和行为变化）的研究¹⁵；d）EPG甚至被用于证明蚜虫之间的争斗对获胜个体有利，因其可提高取食效率¹⁶。

学习如何为昆虫连接EPG记录导线并不困难，但需要耐心和实践经验才能掌握。从制作电极到最终完成昆虫接线，建议进行为期一至两周的练习。在此期间，研究人员将熟悉所选昆虫物种的操作方法，并能够顺利地完成所有步骤。关键步骤包括：正确进行焊接、在取用银胶前充分摇匀试剂瓶，以获得大小适中的胶滴（既不能太小也不能太大）、确保良好的电学和机械连接，以及将金丝准确放置于昆虫腹部的银胶滴内，同时避免限制昆虫的活动。若这些步骤操作不当，将导致电连接不良，从而产生质量差或无法接受的数据。当将.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黄铜连接针	EPG Systems/hardw.shop		Φ 1.2 mm
细铜丝	EPG Systems/hardw.shop		约 Φ 0.2 mm
细金丝	EPG Systems		Φ 18 µm
焊剂	五金店		与焊锡丝匹配
树脂芯焊锡丝	五金店
泡沫塑料板	任意品牌
水性银胶	EPG Systems		配方见：www.epgsystems.eu
纸巾	Kimberly-Clark	5511
焊接螺栓	任意品牌
体视显微镜	Hund Wetzlar		最低放大倍数为10倍
小型剪刀	Fine Science Tools	14088-10
手术刀	Fine Science Tools	10050-00
精细镊子	Fine Science Tools	11231-20
涡旋振荡器	A. Hartenstein	L46
水彩画笔	任意品牌		1号或2号
空气抽吸装置			参见说明：www.epgsystems.eu
昆虫针	任意品牌		1号或2号
稳固的实验台
法拉第笼			手工制作
计算机	Fujitsu Siemens
数据采集软件	EPG Systems		Stylet+d
Giga-4 (-8) 完整系统	EPG Systems
包含以下组件：
带USB输出的主控箱		Di155/Di710	12/14 位，采样率 100 Hz（软件固定）
EPG 探针 4（8）个			50倍直流前置放大器
杆上旋转夹具
直流电源适配器			双极性，230/115 VAC 转 -/+8 VDC
植物电极及连接线
额外的测试和接地电缆