Protocol
1. المواد إعداد
- إعداد 10 ملي HEPES العازلة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في RT وإضافة كلوريد الصوديوم إلى 0.9٪.
- تحضير 5٪ محلول الجينات وحل 10 ملي EDTA عن طريق خلط المياه المالحة HEPES مخزنة أعد في 1.1. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في RT.
- الأوتوكلاف الكواشف (1.1، 1.2) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
- إعداد 60 ملم أطباق الجيلاتين المغلفة الطبقات مع 1،2-2،0 × 10 6 الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEF) الخلايا، والتي يتم التعامل معها على أنها الخلايا المغذية التي كتبها حضانة داخل DMEM تحتوي على 10٪ FBS ES-المؤهلة و 10 ميكروغرام / مل من ميتوميسين مئوية لمدة 90 - 120 دقيقة.
- الحفاظ على الماوس الناجم الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا على الطبق مع الخلايا المغذية في وجود 5 مل DMEM الجلوكوز المرتفعة تحتوي على 20٪ من ES-مؤهل FBS، 50 ميكرومتر من 2 المركابتويثانول، الأحماض الأمينية غير الأساسية، والمضادات الحيوية ( 100 وحدة / مل من البنسلين G الصوديوم، و 100 ميكروغرام / مل من كبريتات الستربتومايسين، و 250 نانوغرام / مل من amphoteriCIN B).
- البذور 4 × 10 5 خلايا الجذع على 60 مم طبق الجيلاتين المغلفة واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تغيير ثقافة المتوسط كل يوم أثناء الحضانة. بعد 3-4 أيام من الثقافة، ويعرض للتريبسين الخلايا لمدة 1 دقيقة مع 500 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين التي تحتوي على 0.02٪ EDTA عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. بعد ذلك، فصل الخلايا عن طريق التنصت على طبق ثقافة عشر مرات.
- إضافة 2.5 مل من DMEM مع 10٪ من FBS والمضادات الحيوية ES-مؤهل (بعد تفكك خلايا الجذع الماوس إلى الخلايا واحد من قبل pipetting مع 1000 ميكرولتر micropipette ثلاث مرات) تعليق خلية الطرد المركزي في 160 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة طاف وعدد الخلايا . بعد عد الخلايا، RESEED الخلايا التي جمعت على طبق الجيلاتين المغلفة واحتضان لمدة 30 دقيقة لعزل خلايا الجذع من الخلايا MEF. بعد فرز الخلايا (عادة 1-3 × 10 6 خلية / طبق يمكن جمعها)، RESEED 4 × 10 5 الجذع الخلايا علىالصحن.
2. تغليف الخلية إلى الجيني هيدروجيل كبسولات
- جمع الخلايا عن طريق نفس الإجراء الموضح في 1.5 و 1.6. بعد الطرد المركزي في 160 × ز لمدة 3 دقائق، ويغسل بيليه خلية الجذع مع المياه المالحة HEPES مخزنة ثلاث مرات. بعد إعادة تعليق-الخلايا في المياه المالحة HEPES مخزنة، تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر من أجل إزالة الركام الكبيرة، التي يمكن أن تسد إلا فوهة.
- خلط 2 مل من تعليق خلية داخل المالحة HEPES مخزنة و3 مل من 5٪ ALG-نا الحل. أخيرا 5 مل من تعليق خلية داخل 3٪ ALG-نا الحل يتم الحصول. كثافة الخلية يستحسن أكثر من 10 6 خلية / مل.
- بعد جمع تعليق خلية في حقنة 5 مل، تثبيت المشارك المحوري فوهة (الشكل 1A، B) على حقنة وتضعها على ضخ حقنة. تنبعث N 2 تدفق الغاز (أقل من 1L / دقيقة) من خلال إبرة الخارجية للفوهة المشارك المحوري وطرد تعليق الخلية من خلال فوهة الداخلية.
- جمع قطرات إلى 250 مل من 0.5٪ CaCl 2 الحل والانتظار 10-20 دقيقة للدبق مع التحريك في 60-90 دورة في الدقيقة.
3. علاج الجيني كبسولات (اختياري)
- احتضان كبسولات ALG-كا في 0.05٪ (وزن / حجم) بولي-L-ليسين (PLL) حل لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- بعد غسل كبسولات مع المياه المالحة HEPES مخزنة، احتضان لهم في DMEM تحتوي على 10٪ FBS من أجل تحييد الشحنات الكهربائية على سطحها. الاستفادة منها في كبسولات مغلفة (الشكل 1C).
- احتضان الكبسولات في المياه المالحة HEPES مخزنة التي تحتوي على 10 ملي EDTA لمدة 5 دقائق. وتستخدم الكبسولات المعالجة EDTA في كبسولات جوفاء (الشكل 1C).
4. الثقافة وجمع الخلايا في الجينات كبسولات
- احتضان خلايا مغلفة في 75 دورة في الدقيقة مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2لمدة 10 يوما.
- جمع واحتضان الكبسولات في 10 ملي EDTA عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة. جمع الخلايا من كبسولات الجينات من دون علاج PLL بواسطة الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 3 دقائق.
- إذا تعامل كبسولات الجينات مع PLL، وكسر الغشاء ALG-PLL من قبل pipetting صعودا وهبوطا نحو عشرة مرات مع إبرة تعلق على حقنة وأجهزة الطرد المركزي أنه في 1000 - 5000 × ز لمدة 5 دقائق. يجب أن تكون إبرة قطرها أقل من حجم كبسولة و 25 G تستخدم (260 ميكرون) الإبر في هذه التجربة (600 ميكرون)
- بعد الطرد المركزي، وجمع بيليه الخلية بدقة من كسر الأغشية ALG-PLL إذا كنت ترغب في جمع عينات مرنا من الخلايا. تبقى الأغشية ALG-PLL ربما يمنع تنقية مرنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في بروتوكول 2.5، حل الجينات طرد يشكل كروية الشكل على الفور بعد طرد (الشكل 2A - H). إذا تم طرد تعليق مع معدل تدفق N 2 أقل من 1L / دقيقة، وحجم قطرات موحد (الشكل 2I). ومع ذلك، إذا كان تدفق N 2 أعلى من 1L / دقيقة، الحبرية ينهار (الشكل 2G، arrowed الأبيض) وحجم قطرات يصبح غير متجانسة (الشكل 2J). ونظرا لهذا، فإنه من الصعب إعداد قطرات أصغر من 500 ميكرون باستخدام هذا الأسلوب.
في عملية التبلور (بروتوكول 2.4)، قطيرات ALG-نا شكلت شكل كروي كبسولات ALG-كا في CaCl 2 الحل إذا تركيز ALG-نا (أكثر من 3٪) يكفي (الشكل 3E-H، K، I). تركيز لكن انخفاض ALG-نا (أقل من 3٪) أسباب غير كروية الشكل وغير سلس كبسولات (الشكل 3A-D، I)، التيلديك مشكلة في عملية الطلاء. حتى لو كان تركيز ALG-نا لا يكفي، وكبسولات كروية يمكن تشكيلها عن طريق زيادة CaCl 2 تركيز (الشكل 3J). ومع ذلك، حوالي 50 ملم من CaCl 2 هو المناسب لتغليف بسبب تركيز عال جدا من CaCl 2 يقلل نمو الخلايا وقدرتها على البقاء (لا يظهر بيانات). بعد انخفاضه إلى CaCl 2 الحل اختياريا يمكنك الانتظار لبضع دقائق لالتبلور ولكن من المستحسن التقاط كبسولات من CaCl 2 الحل لحضانة طويلة جدا في CaCl 2 يؤثر في بعض الأحيان نمو الخلايا. في بعض الأحيان الحصول على كبسولات الشكل غير كروية حتى إذا كانت تركيزات كافية. وربما هذا هو لأن غسل بيليه الخلوي ليس كافيا قبل إعادة التعليق الخلايا في حل ALG-نا. الكواشف المتبقية مثل مصل ربما منع التبلور.
خلايا مغلفة يمكن أن تنمو في كبسولات ولكن تسرب الخلوي (arrowed في الشكل 4A) يمكن أن يحدث في كبسولات دون ALG-PLL طلاء (الشكل 4A). في حالة الماوس خلايا الجذع، والخلايا تشكل الحصى على شكل قرص في كل كبسولة ALG-كا (الشكل 4B)، في حين أن الخلايا تتجمع وتشكل الحصى كروية واحدة في كل كبسولة جوفاء (الشكل 4C). كثافة الخلية الأولية لا يؤثر على حجم الركام في كبسولات ولكن كثافة الخلية منخفضة (10 5 خلية / مل جل) يتسبب في عدم يكبر (لا تظهر البيانات). وبالتالي، 10 6 خلية / مل جل أمر مرغوب فيه لتغليف.
في جمع الخلايا من كبسولات، يمكن حله ALG-كا هيدروجيل مع الجينات ياز أو مخلبية الكواشف، على الرغم من أن طلاء ALG-PLL من الصعب حل مع الانزيمات أو المواد الكيميائية. ولذلك ينبغي ALG-PLL يمكن كسرها جسديا مع pipetting ل، على سبيل المثال. الأغشية المكسورة يمكن فصلها عن الخلايا بواسطة الطرد المركزي.
> 
الشكل 1. صور من نظام تغليف وكبسولات. (A) صورة من نظام التغليف لALG-كا التغليف على مقاعد البدلاء النظيفة. (ب) صورة تخطيطية للفوهة المشارك المحوري لتغليف. (C) وثلاثة أنواع مختلفة من الكبسولات التي تم الحصول عليها في هذا التقرير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تأثير N 2 التدفق على التشكل من كبسولات الصور المستمر (A - H). والمظهر (I، J) من تشكيل قطرة من 3٪ ALG-نا حل من فوهة المشارك محوري في N 2التدفق في 1 لتر / دقيقة (A - D، I) و 2 لتر / دقيقة (E - H، J). تم القبض على الصور مستمرة من قبل الكاميرا الفائقة السرعة. تتشكل كبسولات هيدروجيل في 0.5٪ CaCl 2. اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تأثير ALG-نا وCaCl 2 التركيز على الصرف من كبسولات الصور المستمر (A - H). والمظهر (I - L) من ALG-نا قطيرات التبلور في CaCl 2 الحل. في الصور مستمرة، قطرات وجود تراكيز مختلفة من ALG-نا، 2٪ (A - D) و 3٪ (E - H)، والتبلور في 50 ملي CaCl 2 الحل. يتم التقاط الصور المتلاحقة التي مرحبا-كاميرا السرعة. تظهر الصور ظهور الفرق الصرفي كبسولات ALG-كا شكلتها تركيزات مختلفة من ALG-نا، 2٪ (L، J) و 3٪ (K، L)، وCaCl 2، 50 ملم (L، K) و 500 ملي (J، L). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 4. مورفولوجية مغلف ماوس الجذع المجاميع خلية في كبسولات الصور صورة مجهرية من الجذع خلية المجاميع وتربيتها لمدة 4 و 6 و 8 و 10 أيام (1-4 على التوالي) في ثلاثة أنواع مختلفة من الكبسولات: (A) المجردة، ( B) المغلفة، و (C) كبسولات جوفاء. يرجى النقرهنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن مقارنة الثقافة التغليف مع الثقافات تعليق المباشرة. ثقافة تعليق هو أبسط طريقة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا الجذعية المحفزة من أساليب التغليف. ومع ذلك، والسيطرة على تجميع الخلايا في الثقافة تعليق لا تزال صعبة. في طريقة التغليف، والتجميع الخلوية محدودة في كبسولات، وبالتالي يمكن أن تسيطر عليها بشكل جيد. وأظهر المنشور السابق أن الخلايا مغلفة شكلت مجاميع من حجم موحد، في حين ظهرت كتل زنزانة كبيرة في ثقافة خالية من التعليق 7. وعلاوة على ذلك، أظهر تقرير سابق أن الانفعالات القوية يسبب الموت الخلوي في الثقافات تعليق مباشرة من خلايا PS؛ مما يستلزم معدل الإثارة محدودة. في المقابل، التغليف غير قادرة على حماية الخلايا من إجهاد القص حتى في ظل ظروف الإيقاف. وبالتالي فإن طريقة التغليف يسمح مستوى من المرونة في ظروف التشغيل عند تزايد الخلايا في التعليق.
ove_content "> تغليف هو أداة مفيدة لكلا أبحاث الخلايا الجذعية وكذلك التعديل من عملية الإنتاج الضخم. وتغليف الخلايا الجذعية مفيد في البحث عن مكانة الخلايا الجذعية، بما في ذلك مصفوفة والنمو عوامل خارج الخلية. وقد أثبتت بعض الباحثين أن تغليف الماوس خلايا ES-VEGF في مترافق الهلاميات المائية الاغاروز الترويج لتمايز الخلايا إلى خلايا الدم السلف 8.يوضح هذا المقال كيفية تغليف خلايا الجذع الماوس إلى الخاضعة لسيطرة حجم ALG-كا كبسولات بسهولة باستخدام المشارك المحوري فوهة وN 2 التدفق. على الرغم من أن هناك بعض عملية التغليف مع أدوات مختلفة مثل مضخة تحوي 9 و الجهد الكهربائي 10، والتغليف باستخدام N 2 تدفق هي طريقة أبسط وأكثر أمانا من الطرق الأخرى. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة هي قادرة على تشكيل أصغر (حوالي أكبر من 600 ميكرون) كبسولات من طريقة مع مضخة تحوي(نحو أكبر من 3 ملم). كبسولات كبيرة يستغرق وقتا أطول لالتبلور تماما وقتا طويلا حضانة في CaCl 2 ربما يؤثر على الخصائص الخلوية. وعلاوة على ذلك، كبسولات كبيرة أيضا ربما لديهم مشكلة نقل الجماعي للالمغذيات أو النفايات مثل الجلوكوز والأكسجين. وبالتالي فإن حجم الكبسولات التي شكلتها N 2 تدفق (600 -1000 ميكرون) هو الحجم المثالي لزراعة الخلايا في الداخل.
هذه الطريقة ليست مناسبة لإعداد كبسولات صغيرة والتحكم في حجم بالضبط. بسبب انهيار قطرات، وهذه الطريقة ليست مناسبة لإعداد كبسولات أقل من 500 ميكرون. وعلاوة على ذلك، الملاحظة البصرية فقط يمكن تحديد حجم كبسولات، وبالتالي فإنه من الصعب التحكم في حجم كبسولة بواسطة هذه الطريقة. في هذه الحالة، واستخدام أجهزة ميكروفلويديك ربما يمكن أن تحل هذه المشاكل (11). ومع ذلك، يحدث أحيانا انسداد في microdevice لأن المواد الهلامية ALG-نا فورا بعد اجتماع CaCl 2 solutأيون.
على الرغم من أن الجينات ليست مناسبة لتعديل كيميائي بسبب اللزوجة العالية، وأنها قادرة على تشكيل كبسولات مختلطة مع هيدروجيل، التي، مثل PEG، هو أيضا من الصعب استخدامها لتغليف. وأظهر المنشور السابق أن التغليف من خلايا فأر الجذع في RGD الببتيد مترافق PEG-ALG الهجين هيدروجيل كبسولة تحسن النمو الخلوي 12. دون تعديل كيميائي، ومن المتوقع أن تعديل المتخصصة الخلايا الجذعية عن طريق الاحتفاظ العوامل يفرز تغليف الخلايا في كبسولات فقط هيدروجيل. في الواقع، أظهرت الأبحاث السابقة أن عوامل النمو يفرز، احتفظ في microbioreactor، كانت فعالة في السيطرة على مصير الخلايا الجذعية 13،14.
جمع الخلايا من كبسولات لا تزال قضية لم تحل بشأن تطبيق طريقة التغليف لانتاج كميات كبيرة من الخلايا الجذعية المحفزة. وأظهر التقرير السابق أن هذا الطلاء PLL ضروري إلى kخلايا الجذع الآثار البيئية الماوس داخل 7. إذا والمغلفة جيدا ALG-كا كبسولات هيدروجيل مع polycation مثل PLL (بروتوكول 3،1-3،2)، فإنه سيكون من الصعب كسر الكبسولات إما عن طريق إنزيم أو مخلبية الكواشف. في هذه الحالة، وهي طريقة الميكانيكية مثل pipetting لمن قبل إبرة مطلوب (بروتوكول 4.3). الخلايا التي تم جمعها يمكن عزله عن الأغشية كسر في الطرد المركزي أكبر من 5000 × ز، على الرغم من الطرد المركزي قد تؤثر ربما على بقاء الخلية بسبب ارتفاع G-القوة. وهكذا، وهي تقنية لإزالة بلطف الحطام من الخلايا وكذلك كسر كبسولات مهمة في تطوير تكنولوجيا التغليف. على الرغم من أن تحتاج إلى مزيد من التطوير لبعض تطبيق هذه الطريقة لانتاج كميات كبيرة من الخلايا، التغليف هي تقنية واعدة لكل من الإنتاج الضخم وأبحاث الخلايا الجذعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
