Protocol
1.準備材料
- 10mMのHEPES緩衝液を準備します。 RTでpHを7.0に調整し、0.9％に塩化ナトリウムを加えます。
- 1.1で調製したHEPES緩衝生理食塩水を混合することにより、5％アルギン酸塩溶液および10mM EDTA溶液を準備します。 RTでpHを7.0に調整します。
- 121℃で20分間、試薬（1.1、1.2）をオートクレーブ。
- 90、10％ES-修飾FBSおよびマイトマイシンC10μg/ mlのを含むDMEM内でインキュベートすることにより、フィーダー細胞として処理され、2.0×10 6マウス胚性線維芽細胞（MEF）細胞、 - 1.2層状ゼラチンコーティングされた60ミリメートルの料理を準備します - 120分。
- マウス人工多能性幹（iPS）皿上の細胞を5mlの存在ES修飾FBS、2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、50μM、および抗生物質（20％を含むDMEM高グルコース中のフィーダー細胞を維持しますペニシリンGナトリウム、硫酸ストレプトマイシンを100μg/ mlと100単位/ ml、およびamphoteriの250 ng / mlでCINのB）。
- シード4×10 5ゼラチンコーティングされた60ミリメートル皿にiPS細胞と37℃、5％CO 2でそれらをインキュベートします。インキュベーション中に、毎日培地を変更します。 3の後- 4日間培養し、37℃で0.02％EDTA、5％CO 2を含む0.05％トリプシンの500μlの1分間細胞をトリプシン処理。その後、培養皿を10回タップすることで細胞を剥離。
- （3回千μlをマイクロピペットでピペッティングにより単一細胞に解離マウスiPS細胞を以下）ES-修飾FBSおよび抗生物質の10％を含むDMEM 2.5 mlを加え3分間160×gで遠心分離細胞懸濁液、上清を除去し、細胞をカウント。細胞計数の後、ゼラチンコートディッシュに回収した細胞を再シードし、MEF細胞からiPS細胞を単離するために30分間インキュベートします。細胞の計数した後（通常は1 - 3×10 6細胞/皿を収集することができます）、上の4×10 5 iPS細胞を再シード皿。
アルギン酸ハイドロゲルカプセルに2細胞のカプセル化
- 1.5および1.6に記載の方法と同様の方法により細胞を収集します。 3分間160×gで遠心分離した後、三回HEPES緩衝生理食塩水でのiPS細胞ペレットを洗浄します。 HEPES緩衝化生理食塩水で細胞を再懸濁した後、それ以外の場合はノズルを詰まらせる可能性が大きな凝集体を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過します。
- HEPES緩衝生理食塩水内の細胞懸濁液2mlを、5％ALG-ナトリウム溶液3mlを混合します。最後に、3％のALG-Na溶液中で細胞懸濁液5mlを得られます。細胞密度は、望ましくは10以上6細胞/ mlです。
- 5ミリリットルシリンジに細胞懸濁液を収集した後、注射器に同軸ノズル（ 図1A、B）をインストールし、シリンジポンプに設定してください。同軸ノズルの外針を通してN 2ガ ス流量（リットル/分より低い）を放出し、内側ノズルを通して細胞懸濁液を追い出します。
- 0.5％のCaCl 2溶液250ml中に液滴を収集し、10を待つ- 60〜90 rpmで攪拌しながら、ゲル化のために20分。
アルギン酸カプセルの3処理（オプション）
- 0.05％、37℃で5分間、5％CO 2（w / v）のポリ-L-リジン（PLL）溶液をALG-カルシウムカプセルをインキュベートします。
- HEPES緩衝生理食塩水でカプセルを洗浄した後、それらの表面上の電荷を中和するために10％FBSを含むDMEM中でそれらを培養します。コーティングされたカプセル（ 図1C）として、それらを利用しています。
- 5分間、10mMのEDTAを含むHEPES緩衝生理食塩水でカプセルをインキュベートします。 EDTA処理したカプセルは、中空カプセル（ 図1C）として利用されます。
4.文化アルギン酸カプセルの細胞を収集
- 37℃および5％CO 2で振とうしながら75 rpmでカプセル化された細胞をインキュベート10日間。
- 収集し、10分間CO 2を 37℃で、10mMのEDTAでカプセルをインキュベートし、5％。 3分間1,000×gで遠心分離することにより、PLL処理なしのアルギン酸カプセルから細胞を収集します。
- 5分間5,000×gで - アルギン酸塩カプセルはPLLで処理している場合は、シリンジに取り付けられた1000でそれを遠心針で上下にピペッティング10回の周りによってALG-PLL膜を破ります。針の直径は、カプセルサイズ25 G（260μm）の針が、この実験で使用されているよりも低くなければならない（600ミクロン）
- あなたは、細胞からのmRNAのサンプルを収集したい場合は、遠心分離した後、壊れたALG-PLL膜から厳密に細胞ペレットを収集します。残りのALG-PLL膜は、おそらくmRNA精製を防ぎます。
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Representative Results
プロトコル2.5で、排出されたアルギン酸塩溶液は直ちに放出（ - H図2A）の後に球状をなします。懸濁液を1L / minより低いN 2流量で排出された場合、液滴の大きさが均一（ 図2I）です。 N 2流量は、1L /分よりも大きい場合には、液滴（ 図2G、白矢印）を分解し、液滴の大きさは、不均一（ 図2J）となります。これを考えると、この方法を使用して500ミクロン未満の液滴を調製することは困難です。
ALG-NA（3％以上）の濃度が十分に（ 図3E-H、K、I）であればゲル化工程（プロトコル2.4）では、ALG-Naが塩化カルシウム溶液中の球状ALG-カルシウムカプセルを形成される液滴。しかし、ALG-ナトリウム（3％未満）の低濃度は、非球面せ、カプセルの非滑らかな形状（ 図3A-D、I）、そのコーティングプロセスで問題があります。 ALG-Na濃度が十分でない場合でも、球状カプセルは、 塩化カルシウム濃度（ 図3J）を増加させることによって形成することができます。のCaCl 2の高すぎる濃度は、細胞増殖および生存率を低下させるしかし、CaCl 2を50mMの周りに（データは示していない）カプセル化に適しています。 塩化カルシウム溶液中に滴下した後、必要に応じて、あなたは、ゲル化のために、数分待つことができるが、 塩化カルシウムで長すぎるインキュベーションは時々細胞の成長に影響を与えるので、我々は、 塩化カルシウム溶液からカプセルを拾ってお勧めします。時には、濃度が十分であっても、非球面形状のカプセルを得ます。携帯ペレットを洗浄すると、ALG-Na溶液中に細胞を再懸濁する前に、十分ではないためと考えられます。血清などの残留試薬は、おそらくゲル化を防止します。
カプセル化された細胞は、カプセルが、携帯漏れで成長することができます（ 図に矢印図4（a））は、ALG-PLLコーティング（ 図4A）なしでカプセルの中に発生する可能性があります。細胞が互いに凝集し、各中空カプセル（ 図4C）で単一の球状凝集体を形成するのに対し、マウスiPS細胞の場合、細胞は、各ALG-カルシウムカプセル（ 図4B）で円盤状の凝集体を形成します。初期細胞密度は、カプセルが、低い細胞密度（10 5細胞/ mlゲル）中の凝集体の大きさに影響する（データは示さず）まで成長する障害が発生していません。従って、10 6細胞/ mlゲルを封入することが望ましいです。
ALG-PLLコーティングは、酵素または化学薬品で溶解することは困難であるが、カプセルから細胞を採取するには、ALG-カルシウムハイドロゲルは、アルギン酸リアーゼまたはキレート試薬で溶解させることができます。 ALG-PLLは、したがって、物理的に、例えば、ピペット操作で破壊されるべきです。壊れた膜は、遠心分離によって細胞から分離することができます。
カプセル化システムとカプセルの図1の画像。（A）クリーンベンチ上のALG-カルシウムのカプセル化のためのカプセル化システムのイメージ。 （B）カプセル化のための同軸ノズルの概略画像。 （C）本報告書で得られたカプセルの3つの異なるタイプ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
N 2中の同軸ノズルから、3％ALG-Na溶液の液滴形成の様子（I、J） -図2カプセルの形態でN 2フローの効果の連続画像（H A）。1 L /分で流れる（A - D、I）及び2リットル/分（E - H、J）。連続画像は、ハイスピードカメラで撮影しました。ハイドロゲルカプセルは、0.5％のCaCl 2に形成されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ALG-Naを図3.効果とのCaCl 2濃度カプセルの形態での連続画像（A - H）。外観- ALG-Naを（I L）は、 塩化カルシウム溶液中にゲル化液滴。 、 - （H E）の50mMのCaCl 2溶液中でゲル化されている- （D A）および3％の連続画像では、ALG-ナトリウム、2％の異なる濃度を有する液滴。連続画像はハイテクによって捕捉されます-speedカメラ。外観画像は、ALG-ナトリウム、2％（L、J）と3％（K、L）とのCaCl 2、50mMの（L、K）および500 mMの異なる濃度により形成されたALG-カルシウムカプセルの形態学的差異を示します（J、L）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
カプセルにカプセル化マウスiPS細胞凝集体の図4形態 4、6、8、10日間培養したiPS細胞凝集体の顕微鏡写真画像（1 - 4それぞれ）のカプセルの3種類で：（A）裸（ B）コーティングされ、および（C）中空カプセル。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
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Discussion
カプセル化培養物を直接懸濁培養物と比較することができます。浮遊培養は、カプセル化方法よりも多能性幹細胞を大量に得るための簡単な方法です。しかし、懸濁培養中の細胞の凝集を制御することは依然として困難です。カプセル化方法において、細胞凝集は、カプセル内に限定されるので、十分に制御することができます。以前の刊行物は、大きな細胞塊が自由懸濁培養7で登場し、一方カプセル化された細胞は、均一な大きさの凝集体を形成することを示しました。さらに、以前の報告は、強力な攪拌がPS細胞の直接懸濁培養における細胞死を引き起こすことを実証しました。このように制限された撹拌速度を必要とします。対照的に、カプセル化もサスペンション条件下で剪断応力から細胞を保護することができます。懸濁液中の細胞を成長させる際のカプセル化方法は、したがって、運転条件の自由度を可能にします。
「ove_content>はカプセル化は、量産プロセスの変更だけでなく、幹細胞研究の両方のための有用なツールである。幹細胞のカプセル化は、細胞外マトリックスおよび増殖因子を含む、幹細胞のニッチを研究するのに有用である。いくつかの研究者がいることを実証しましたVEGF共役アガロースヒドロゲルにマウスES細胞のカプセル化は、血液前駆細胞8への細胞の分化を促進しました。この記事では、同軸ノズルとN 2の流れを利用して簡単にサイズ制御ALG-カルシウムカプセルにマウスiPS細胞をカプセル化する方法を示しています。このような蠕動ポンプ9と電気電圧10等の様々なツールを使用して、いくつかのカプセル化プロセスがあるが、N 2フローを使用してカプセル化は、他の方法よりも簡単で安全な方法です。さらに、この方法は、（約600ミクロンよりも大きい）蠕動ポンプを用いる方法よりも小さなカプセルを形成することができます（約3mmより大きい）。大きなカプセルは完全にゲル化のために長い時間がかかるとのCaCl 2での長時間のインキュベーションは、おそらく細胞特性に影響を与えます。また、大きなカプセルはまた、おそらく、グルコースや酸素などの栄養素や廃棄物の物質移動の問題を抱えています。したがって、N 2流量（600 -1000ミクロン）によって形成されたカプセルの大きさは、内部の細胞培養に理想的なサイズです。
この方法は、小さなカプセルを準備し、正確にサイズを制御するのに適していません。そのため、液滴の分解のため、この方法は、500ミクロンよりも小さいカプセルを製造するのに適していません。また、カプセルの大きさを決定することができる唯一の視覚的観察は、従って、この方法により、カプセルの大きさを制御することは困難です。この場合、マイクロ流体デバイスの使用は、おそらく、これらの問題を解決することができる11。 ALG-のNaゲルはCaCl 2をsolutを満たした直後しかし、時には目詰まりがマイクロデバイスで発生しますイオン。
アルギン酸塩は、その高粘度の化学的修飾には適していないが、PEGのように、カプセル化のために使用することも困難であり、ヒドロゲルを有するハイブリッドカプセルを形成することができます。以前の刊行物は、RGDペプチドコンジュゲートPEG-ALGハイブリッドヒドロゲルカプセルでマウスiPS細胞のカプセル化は、細胞増殖を12向上したことを示しました。化学修飾なしで、単にハイドロゲルカプセルへの細胞のカプセル化は、分泌因子を保持することにより、幹細胞のニッチを修正することが予想されます。実際、以前の研究はmicrobioreactorに保持分泌成長因子は、幹細胞の運命13,14を制御するのに有効であったことを実証しました。
カプセルからの細胞の収集は依然として多能性幹細胞の大量生産へのカプセル化方法の適用に関する未解決の問題です。以前の報告は、PLLコーティングがkに必要であることを示しました7内部のEEPマウスiPS細胞。 ALG-カルシウムハイドロゲルカプセルはよくこのようなPLL（プロトコル3.1から3.2）のようなポリカチオンでコーティングされている場合は、いずれかの酵素またはキレート試薬によってカプセルを破壊することが困難になります。この場合、針でピペッティングなどの機械的な方法は、（プロトコル4.3）が必要です。遠心分離は、おそらく高いG力に細胞生存率に影響を与える可能性があるが、回収された細胞は、より多い5,000×gで遠心分離で破断膜から単離することができます。このように、静かに細胞から破片を除去するだけでなく、カプセルを破壊する技術は、カプセル化技術を開発する上で重要です。いくつかのさらなる発展を細胞の大量生産にこの方法を適用するために必要ですが、カプセル化は、大量生産や幹細胞研究の両方のための有望な技術です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
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