Protocol
1. Klar Materials
- Forbered 10 mm HEPES buffer. Juster pH til 7,0 ved romtemperatur og tilsett NaCl til 0,9%.
- Forbered 5% alginatoppløsning og 10 mM EDTA-løsning ved å blande HEPES-bufret saltvann fremstilt i 1.1. Juster pH til 7,0 ved romtemperatur.
- Autoklav reagensene (1.1, 1.2) i 20 minutter ved 121 ° C.
- Forbered gelatinbelagte 60 mm skåler lagvis med 1,2 til 2,0 × 10 6 mus embryonale fibroblast (MEF) celler, som blir behandlet som mater celler ved inkubasjon innen DMEM inneholder 10% ES-kvalifiserte FBS og 10 mikrogram / ml mitomycin C for 90 - 120 min.
- Oppretthold mus indusert pluripotent stammen (IPS) celler på fatet med feeder-celler i nærvær av 5 ml DMEM høy glukoseinneholdende 20% av ES-kvalifiserte FBS, 50 uM 2-mercaptoethanol, ikke-essensiell aminosyre, og antibiotika ( 100 enheter / ml Penicillin G natrium, 100 ug / ml streptomycin sulfat, og 250 ng / ml amfotærcin B).
- Seed 4 × 10 5 iPS-celler på en gelatin-belagt 60 mm rett og ruge dem ved 37 ° C og 5% CO 2. Endre kulturen medium hver dag under inkubasjon. Etter 3-4 dagers dyrking, trypsineres cellene for 1 min med 500 ul av 0,05% trypsin inneholdende 0,02% EDTA ved 37 ° C og 5% CO2. Etter det, løsne cellene ved å trykke dyrkningsskålen ti ganger.
- Legg 2,5 ml DMEM med 10% av ES-kvalifiserte FBS og antibiotika (etter dissosiasjon mus iPS celler i enkeltceller ved pipettering med 1000 ul mikropipette tre ganger) sentrifuger cellesuspensjonen ved 160 x g i 3 minutter og fjerne supernatanten og telle cellene . Etter celletelling, reseed de innsamlede cellene på en gelatin-belagt fatet og inkuberes i 30 min for å isolere iPS-celler fra MEF celler. Etter telling av celler (vanligvis 1 - 3 × 10 6 celler / fatet kan samles), reseed 4 × 10 5 iPS-celler påfatet.
2. Cell Innkapsling inn Alginat Hydrogel Capsules
- Samle cellene ved den samme fremgangsmåte som er beskrevet i 1.5 og 1.6. Etter sentrifugering på 160 × g for 3 min, vaske iPS cellepellet med HEPES-bufret saltvann tre ganger. Etter re-suspendering av cellene i HEPES-bufret saltløsning, filtrere cellesuspensjonen gjennom et 40 um celle sil for å fjerne store aggregater, noe som ellers kan tette igjen munnstykket.
- Bland 2 ml av cellesuspensjonen i HEPES-bufret saltvann og 3 ml 5% Alg-Na-løsning. Til slutt 5 ml av cellesuspensjonen i 3% Alg-Na oppløsning er oppnådd. Celletettheten er fortrinnsvis mer enn 10 6 celler / ml.
- Etter å ha samlet cellesuspensjonen i en 5 ml sprøyte, installere en koaksial dysen (figur 1A, B) på sprøyten og sett dem på sprøytepumpe. Emit N2 gass-strøm (lavere enn 1 liter / min) gjennom den ytre nålen på koaksial dyse ogutvise cellesuspensjonen gjennom den indre dyse.
- Samle dråper i 250 ml 0,5% CaCl2-oppløsning og vent i 10 - 20 min for gelering under omrøring ved 60 til 90 rpm.
3. Behandling av Alginatkapsler (valgfritt)
- Inkuber Alg-CA kapsler i 0,05% (w / v) poly-L-lysin (PLL) løsningen i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Etter vasking av kapsler med HEPES-bufret saltvann, inkuber dem i DMEM inneholdende 10% FBS for å nøytralisere den elektriske ladning på sin overflate. Utnytte dem som belagte kapsler (figur 1C).
- Inkuber kapsler i HEPES-bufret saltvann inneholdende 10 mM EDTA i 5 min. EDTA-behandlede kapsler anvendes som hule kapsler (figur 1C).
4. Kultur og samle celler i Alginatkapsler
- Inkuber de innkapslede cellene ved 75 rpm med risting ved 37 ° C og 5% CO2i 10 dager.
- Samle og inkuber kapslene i 10 mM EDTA ved 37 ° C og 5% CO2 i 10 min. Samle celler fra alginat kapslene uten PLL behandling ved sentrifugering ved 1000 x g i 3 min.
- Hvis alginat kapsler er behandlet med PLL, bryte Alg PLL-membran ved å pipettere opp og ned rundt ti ganger med en nål festet til en sprøyte, og det sentrifuge ved 1000 - 5000 x g i 5 min. Nål diameter bør være lavere enn kapselstørrelse og 25 g (260 um) nåler brukes i dette eksperimentet (600 um)
- Etter sentrifugering, samle Cellepelleten strengt fra ødelagte Alg-PLL membraner hvis du ønsker å samle mRNA prøver fra cellene. Gjenværende Alg-PLL membraner muligens forhindre mRNA rensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I protokollen 2,5 danner utvist alginatoppløsning en sfærisk form umiddelbart etter utstøting (Figur 2A - H). Hvis suspensjonen blir utvist med en N2 strømnings-hastighet lavere enn 1 L / min, størrelsen på dråpene er enhetlig (figur 2I). Hvis imidlertid N-2 strømmen er høyere enn 1 liter / min, dråpe bryter ned (figur 2G, hvite pilen) og størrelsen av dråpene blir heterogen (figur 2J). Gitt denne, er det vanskelig å fremstille små dråper som er mindre enn 500 um ved anvendelse av denne metoden.
I geleringsprosessen (protokoll 2,4), dråper Alg-Na formet sfærisk form Alg-CA kapsler i CaCl2 oppløsning hvis konsentrasjon av Alg-Na (mer enn 3%) er nok (figur 3E-H, K, I). Imidlertid lav konsentrasjon av Alg-Na (mindre enn 3%) fører til ikke-sfærisk og ikke-jevn form av kapsler (figur 3A-D, I), hvilkenhar et problem i beleggingsprosessen. Selv om Alg-Na-konsentrasjonen er ikke nok, kan kuleformede kapsler dannes ved å øke CaCl2-konsentrasjon (figur 3J). Imidlertid rundt 50 mM CaCl 2 er egnet for innkapsling, fordi for høy konsentrasjon av CaCl2 avtar cellevekst og levedyktighet (data ikke vist). Etter slippe inn CaCl 2 løsning, eventuelt kan du vente noen minutter for gele men vi anbefaler å plukke opp kapsler fra CaCl 2 løsning fordi altfor lang inkubasjon i CaCI2 noen ganger påvirker cellevekst. Noen ganger kan du få ikke-sfærisk formet kapsler selv om konsentrasjonene er nok. Dette er sannsynligvis fordi vaske cellular pellet er ikke nok før resuspending celler i Alg-Na-løsning. Resterende reagenser slik som serum muligens forhindre gelering.
Innkapslede celler kan vokse i kapslene, men mobilnettet lekkasje (se pilen i Figur4A) kan forekomme i kapsler uten Alg PLL-belegg (figur 4A). I tilfelle av mus iPS celler, idet cellene danner skiveformede aggregater i hvert Alg-Ca kapsel (figur 4B), mens cellene klumpe seg sammen og danne enkelt sfæriske aggregater i hvert hul kapsel (figur 4C). Initial celletetthet påvirker ikke størrelsen på aggregatene i kapsler, men lav celletetthet (10 5 celler / ml-gel) fører til at unnlatelse av å vokse opp (data ikke vist). Det er således ønskelig å innkapsle 10 6 celler / ml-gel.
I å samle celler fra kapsler, kan Alg-Ca hydrogel løses med alginat-lyase eller chelaterende reagenser, selv om Alg-PLL belegget er vanskelig å oppløse med enzymer eller kjemikalier. Alg-PLL bør derfor være fysisk brutt med pipettering, f.eks. Broken membraner kan skilt fra cellene ved sentrifugering.
Figur 1. Bilder av Innkapsling System og kapsler. (A) et bilde av innkapsling system for Alg-Ca innkapsling på en ren benk. (B) Skjematisk bilde av en koaksial dyse for innkapsling. (C) De tre forskjellige typer kapsler oppnådd i denne rapporten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Effekt av N2-flyt på morfologien av kapslene Continuous-bilder (A - H). Og utseende (I, J) for dråpedannelse på 3% Alg-Na-løsning fra en koaksial dyse i N 2strømme med en L / min (A - D, I), og 2 l / min (E - H, J). Kontinuerlige bilder ble tatt til fange av hi-speed kamera. Hydrogel kapsler er dannet i 0,5% CaCl2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Effekt av Alg-Na og CaCl2 konsentrasjon på morfologien av kapslene Kontinuerlig bilder (A - H). Og utseende (I - L) av Alg-Na dråper herding i CaCl2-løsning. I kontinuerlige bilder, dråper med forskjellig konsentrasjon av Alg-Na, 2% (A - D) og 3% (E - H), blir herding i 50 mM CaCl2-løsning. Kontinuerlige bildene er tatt av hispeed kamera. Utseende bildene viser morfologiske differansen av Alg-Ca kapsler dannet av forskjellige konsentrasjoner av Alg-Na, 2% (l, J) og 3% (K, L), og CaCl2, 50 mM (L, K) og 500 mM (J, L). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 4. Morfologi av Encapsulated Mouse iPS Cell Aggregater i kapslene Micrograph bilder av iPS celle-aggregater dyrkede for 4, 6, 8 og 10 dager (1-4 henholdsvis) i tre forskjellige typer kapsler: (A) nakne, ( B) belagt, og (C) hul kapsler. Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innkapsling kultur kan bli sammenlignet med direkte suspensjonskulturer. Suspensjonskultur er en enklere metode for å oppnå store mengder av pluripotente stamceller enn innkapsling metoder. Imidlertid styring av aggregering av cellene i suspensjonskultur er fortsatt en utfordring. I innkapsling fremgangsmåten blir cellulær aggregering begrenset i kapsler, og kan derfor være godt kontrollert. En tidligere publikasjon viste at innkapslede celler dannes aggregater av jevn størrelse, mens store celleklumper vist i en fri-suspensjonskultur 7. Videre en tidligere rapport viste at sterk uro fører cellular død i direkte suspensjonskulturer av PS celler; dermed nødvendiggjør en begrenset agitasjon rate. I motsetning til dette er innkapsling i stand til å beskytte cellene mot skjærspenning selv under suspensjonsbetingelser. Innkapslingen Fremgangsmåten tillater derfor en grad av fleksibilitet i driftsbetingelsene når voksende celler i suspensjon.
ove_content "> Innkapsling er et nyttig verktøy for både stamcelleforskning, samt endring av masseproduksjon prosessen. innkapsling av stamceller er nyttig i å forske på stamceller nisje, inkludert ekstracellulære matrise og vekstfaktorer. Enkelte forskere har vist at innkapsling av ES-celler i mus VEGF-konjugert agarose hydrogeler fremmet differensiering av celler i blodstamceller 8.Denne artikkelen viser hvordan du kan kapsle mus iPS celler i størrelse styrt Alg-Ca kapsler enkelt ved hjelp av co-axial dyse og N2 flyt. Selv om det er noen innkapsling prosess med ulike verktøy som for eksempel peristaltiske pumpe 9 og elektrisk spenning 10, innkapsling ved hjelp av N2-strømning er en enklere og sikrere metode enn andre metoder. Dessuten er denne metoden i stand til å danne mindre (større enn ca. 600 um) kapsler enn metoden med peristaltisk pumpe(Ca. større enn 3 mm). Store kapsler ta lengre tid for gele helt og lenge inkubasjon i CaCI2 muligens påvirker celleegenskaper. Videre er store kapsler også muligens ha et problem med masse overføring av næringsstoffer eller avfall, slik som glukose og oksygen. Derfor er størrelsen av kapsler dannet av N 2 strømmen (600 -1000 um) er ideell størrelse for cellekultur innsiden.
Denne metoden er ikke egnet til å fremstille små kapsler og kontrollere størrelsen presist. På grunn av fordelingen av dråpene, er denne metoden ikke egnet til å fremstille kapsler som er mindre enn 500 um. Videre er bare visuell observasjon kan bestemme størrelsen av kapsler, og dermed er det vanskelig å kontrollere størrelsen av kapsler ved denne metoden. I dette tilfellet, bruk av microfluidic enheter muligens kan løse disse problemene 11. Men skjer iblant tilstopping i microdevice fordi Alg-Na gels umiddelbart etter møtet CaCI2 solution.
Selv alginat er ikke egnet for kjemisk modifikasjon på grunn av dens høye viskositet, er det i stand til å danne hybrid-kapsler med hydrogel, som i likhet med PEG, er også vanskelig å bruke for innkapsling. En tidligere publikasjon viste at innkapslingen av mus iPS celler i et RGD peptid-konjugert PEG-Alg hybrid hydrogel kapsel forbedret cellevekst 12. Uten kjemisk modifikasjon, vil innkapslingen av celler i bare hydrogel kapsler kan forventes å modifisere stamcelle nisje ved å beholde utskilte faktorer. Faktisk, tidligere forskning vist at de utskilte vekstfaktorer, beholdt i en microbioreactor, var effektiv i å kontrollere stamcelle skjebne 13,14.
Samlingen av celler fra kapsler er fortsatt et uløst problem angående anvendelsen av fremgangsmåten for innkapsling masseproduksjon av pluripotente stamceller. En tidligere rapport viste at at PLL belegg er nødvendig for å keep mus iPS celler inne 7. Hvis Alg-Ca-hydrogel-kapsler er godt belagt med et polykation, for eksempel PLL (protokoll 3/1 til 3/2), vil det være vanskelig å bryte ned kapslene av enten enzym eller chelaterende reagenser. I dette tilfellet er en mekanisk fremgangsmåte så som pipettering av nålen som kreves (protokoll 4.3). De oppsamlede celler kan bli isolert fra oppløste membraner ved sentrifugering, som er større enn 5000 x g, selv om sentrifugering muligens påvirke cellenes levedyktighet på grunn av høy g-kraft. Således er en teknikk for forsiktig fjerning av produksjonsavfall fra celler, så vel som å bryte kapslene viktig i utviklingen av innkapsling teknologi. Selv om noen videre utvikling er nødvendig for å anvende denne fremgangsmåte for masseproduksjon av celler, er innkapsling en lovende metode for både masseproduksjon og stamcelleforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
