Protocol
1. Materiais Preparando
- Preparar tampão HEPES 10 mM. Ajustar o pH para 7,0 à TA e adicionar NaCl a 0,9%.
- Preparar a solução de alginato e 5% de solução de EDTA a 10 mM através da mistura de solução salina tamponada com HEPES preparado em 1.1. Ajustar o pH para 7,0 à temperatura ambiente.
- Autoclave os reagentes (1.1, 1.2) durante 20 min a 121 ° C.
- Preparar 60 milímetros pratos revestidos com gelatina em camadas com 1,2-2,0 x 10 6 de fibroblastos de rato embrionário (MEF) células, as quais são tratadas como células de alimentação por incubação dentro de DMEM contendo 10% de FBS ES-qualificados e 10 ug / ml de mitomicina C para 90 - 120 min.
- Manter rato induzida estaminais pluripotentes (IPS) sobre o prato de células com as células de alimentação na presença de 5 ml de DMEM de alto teor de glucose contendo 20% de FBS ES-qualificado, 50 uM de 2-mercaptoetanol, aminoácidos não-essenciais, e antibióticos ( 100 unidades / ml de penicilina G sódio, 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina, e 250 ng / ml de amphotericin B).
- Semente 4 × 10 5 células iPS sobre uma placa de 60 mm revestidas com gelatina e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. Alterar o meio de cultura todos os dias durante a incubação. Após 3-4 dias de cultura, as células trypsinize durante 1 min com 500 ul de tripsina a 0,05% contendo EDTA a 0,02% a 37 ° C e 5% de CO 2. Depois disso, retire as células tocando no prato de cultura dez vezes.
- Adicionar 2,5 ml de DMEM com 10% de FBS e antibióticos ES-qualificado (seguindo as células iPS dissociação do rato em células individuais por pipetagem com 1.000 mL micropipeta, três vezes) suspensão de células centrifugar a 160 × g por 3 min e remover o sobrenadante e contar as células . Seguindo a contagem das células, propagar novamente as células recolhidas num prato revestido com gelatina e incubar durante 30 min para isolar as células iPS a partir das células MEF. Após a contagem das células (geralmente 1-3 × 10 6 células / prato pode ser coletado), reseed 4 × 10 5 células iPS emo prato.
2. celular encapsulação em cápsulas de Hidrogel de Alginato
- Recolher as células por o mesmo procedimento descrito em 1.5 e 1.6. Após a centrifugação a 160 x g durante 3 minutos, lava-se a pelete de células iPS com solução salina tamponada com HEPES três vezes. Depois de re-suspender as células em solução salina tamponada com HEPES, filtrar a suspensão de células através de um filtro de 40 um da célula, a fim de remover grandes agregados, o que poderia de outro modo entupir o bocal.
- Misturar 2 ml de suspensão de células numa solução salina tamponada com HEPES e 3 ml de solução a 5% Alg-Na. Finalmente 5 ml de suspensão de células numa solução de 3% Alg-Na é obtido. A densidade celular é desejavelmente superior a 10 6 células / ml.
- Depois de recolher a suspensão de células para uma seringa de 5 ml, instalar um bocal co-axial (Figura 1A, B) na seringa e colocá-las sobre a bomba de seringa. Emit N2 fluxo de gás (inferior a 1 L / min) através da agulha exterior do bico de co-axial eexpelir a suspensão de células através do bocal interno.
- Recolhe gotas em 250 ml de 0,5% de solução de CaCl2 e esperar 10-20 min para a gelificação enquanto se agitava a 60-90 rpm.
3. Tratamento de cápsulas de alginato (opcional)
- Incubar cápsulas Alg-Ca em 0,05% de poli-L-lisina (PLL) solução durante 5 min a 37 ° C e 5% (w / v) de CO 2.
- Após lavagem das cápsulas com solução salina tamponada com HEPES, incubar em DMEM contendo FBS a 10% a fim de neutralizar a carga eléctrica na sua superfície. Utilizá-los na forma de cápsulas revestidas (Figura 1C).
- Incubam-se as cápsulas em solução salina tamponada com HEPES contendo 10 mM de EDTA durante 5 minutos. As cápsulas tratado com EDTA são utilizados na forma de cápsulas ocas (Figura 1C).
4. Cultura e coletar células em alginato Cápsulas
- Incubar as células encapsuladas a 75 rpm com agitação a 37 ° C e 5% de CO 2durante 10 dias.
- Recolha e incubar as cápsulas em EDTA 10 mM a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 10 min. Recolher as células a partir das cápsulas de alginato PLL sem tratamento por centrifugação a 1000 × g durante 3 min.
- Se as cápsulas de alginato são tratadas com PLL, romper a membrana Alg-PLL, pipetando para cima e para baixo em torno de dez vezes com uma agulha ligada a uma seringa e centrifuga-se que em 1000 - 5000 × g durante 5 min. Diâmetro da agulha deve ser menor do que o tamanho da cápsula e 25 g (260 ^ m) de agulhas são utilizadas nesta experiência (600 um)
- Após a centrifugação, coletar sedimento celular estritamente a partir de membranas Alg-PDD quebrados se você quiser coletar amostras de mRNA a partir de células. Restantes membranas Alg-PLL possivelmente prevenir a purificação de ARNm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
No protocolo de 2,5, a solução de alginato expelido forma uma forma esférica imediatamente após a expulsão (Figura 2A - H). Se a suspensão é expulso com uma taxa de fluxo de N2 inferior a 1 L / min, o tamanho das gotículas é uniforme (Figura 2I). No entanto, se o fluxo de N2 é superior a 1 L / min, a gotícula de quebra (Figura 2G, de setas brancas) e o tamanho das gotas se torna heterogéneo (Figura 2J). Sendo assim, é difícil preparar gotículas mais pequenas do que 500 um, utilizando este método.
No processo de gelificação (protocolo 2.4), Alg-Na forma esférica gotículas formadas cápsulas Alg-Ca em solução de CaCl2 se a concentração de Na-Alg (mais do que 3%) é suficiente (Figura 3E-H, K, I). No entanto baixa concentração de Alg-Na (inferior a 3%) faz com que não esférica e forma não-lisa de cápsulas (Figura 3A-D, I), quetem um problema no processo de revestimento. Mesmo se a concentração de Na-Alg não é suficiente, cápsulas esféricas podem ser formadas através do aumento da concentração de CaCl 2 (Figura 3J). No entanto, cerca de 50 mM de CaCl 2 é adequado para a encapsulação devido concentração demasiado elevada de CaCl 2 diminui o crescimento e viabilidade celular (dados não mostrados). Depois de largar em solução de CaCl 2, opcionalmente, você pode esperar por alguns minutos para gelificação mas recomendamos pegando cápsulas de CaCl 2 solução, porque muito tempo de incubação em CaCl2, por vezes, afeta o crescimento celular. Às vezes você obter cápsulas em forma não esféricas mesmo que as concentrações são suficientes. Isto é provavelmente porque lavar pellet celular não é suficiente antes de ressuspender as células em solução Alg-Na. Reagentes residuais, tais como soro, eventualmente, evitar a gelificação.
Células encapsuladas podem crescer nas cápsulas mas vazamento celular (com setas na Figura4A) pode ocorrer em cápsulas sem revestimento de PLL-Alg (Figura 4A). No caso de células de ratinho iPS, as células formam agregados em forma de disco em cada cápsula Alg-Ca (Figura 4B), enquanto que as células se aglutinarem e formar agregados esféricos individuais em cada cápsula oca (Figura 4C). Densidade celular inicial não afecta o tamanho dos agregados em cápsulas, mas a baixa densidade celular (5 a 10 células / ml de gel) faz com que a incapacidade de crescer-se (dados não mostrados). Assim, 10 6 células / ml em gel é desejável encapsular.
Na recolha de células a partir de cápsulas, Alg-Ca hidrogel pode ser dissolvido com liase quelantes ou reagentes de alginato, embora o revestimento Alg-PLL é difícil de dissolver com enzimas ou produtos químicos. Alg-PLL deve, portanto, ser fisicamente quebrado com pipetagem, por exemplo. Membranas quebrado pode ser dissociada das células por centrifugação.
Figura 1. Imagens de encapsulamento Sistema e cápsulas. (A) Uma imagem do sistema de encapsulamento para Alg-Ca encapsulamento sobre uma bancada limpa. (B) imagem esquemática de um bocal co-axial para encapsulamento. (C) Os três tipos diferentes de cápsulas obtidos neste relatório. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Efeito de um fluxo de N2 sobre a morfologia das cápsulas imagens contínuas (A - H). E aparência (i, j) de formação de gotículas de solução de 3% Alg-Na a partir de um bocal co-axial em N2fluir em 1 L / min (A - D, I) e 2 L / min (E - H, J). Imagens contínuas foram capturados pela câmera oi-velocidade. Cápsulas de hidrogel são formados em 0,5% de CaCl2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Efeito de Alg-Na e CaCl 2 Concentração sobre a morfologia das cápsulas imagens contínuas (A - H). E aparência (I - L) de Alg-Na gotas de gelificação na solução de CaCl 2. Em imagens contínuas, gotas possuindo uma concentração diferente de Alg-Na, 2% (A - D) e 3% (E - H), são de gelificação em CaCl 2 mM de solução 50. Imagens contínuas são capturados por oi-câmera rápida. Aparência imagens mostram a diferença morfológica de cápsulas Alg-Ca formadas por diferentes concentrações de Alg-Na, 2% (G, J) e 3% (K, G), e CaCl 2, 50 mM de (G, K) e 500 mM (J, L). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 4. Morfologia de Encapsulated Rato agregados de células iPS nas cápsulas imagens Micrografia de iPS de células-agregados cultivadas para 4, 6, 8 e 10 dias (1-4), respectivamente, em três diferentes tipos de cápsulas de: (a) nuas, ( B) revestido, e (C) cápsulas ocas. Por favor cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A encapsulação pode ser cultura em comparação com as culturas em suspensão directos. Cultura em suspensão é um método mais simples para obter grandes quantidades de células estaminais pluripotentes que os métodos de encapsulamento. No entanto, controlando a agregação de células numa cultura em suspensão é ainda difícil. No método de encapsulamento, agregação celular é limitado em cápsulas e podem, portanto, ser bem controlada. A publicação anterior mostrou que células encapsuladas formado agregados de tamanho uniforme, enquanto que grandes aglomerados de células apareceu em uma cultura livre de suspensão 7. Além disso, um relatório anterior demonstrou que a forte agitação provoca a morte celular em culturas de suspensão direta de células PS; necessitando, portanto, uma velocidade de agitação limitada. Em contraste, a encapsulação é capaz de proteger as células a partir de tensão de corte, mesmo sob condições de suspensão. Por conseguinte, o método de encapsulamento permite um grau de flexibilidade nas condições de funcionamento, quando o crescimento de células em suspensão.
ove_content "> A encapsulação é uma ferramenta útil tanto para investigação de células germinais, assim como modificação do processo de produção em massa. A encapsulação de células estaminais é útil para pesquisar o nicho de células-tronco, incluindo os factores de crescimento e da matriz extracelular. Alguns investigadores demonstraram que a encapsulação de células ES de ratinho em hidrogéis de agarose VEGF-conjugado promoveu a diferenciação das células em células progenitoras de sangue 8.Este artigo mostra como para encapsular células iPS de rato em cápsulas de Alg-Ca controlada de tamanho facilmente usando bocal co-axial e fluxo de N2. Embora existam alguns processo de encapsulação com vários instrumentos, tais como a bomba peristáltica 9 e tensão eléctrica 10, o encapsulamento usando um fluxo de N2 é um método mais simples e mais seguro do que outros métodos. Além disso, este método é capaz de formar menor (maior do que cerca de 600 um) do que o método de cápsulas com a bomba peristáltica(Maior do que cerca de 3 mm). Cápsulas grandes demoram mais tempo para gelificação completamente e incubação longo tempo em CaCl2 possivelmente afeta características celulares. Além disso, grandes cápsulas também, eventualmente, ter um problema de transferência de massa de nutriente ou resíduos, como glicose e oxigênio. Por conseguinte, o tamanho das cápsulas formadas por fluxo de N2 (600 -1.000 mm) é o tamanho ideal para a cultura de células dentro.
Este método não é adequado para preparar pequenas cápsulas e controlar o tamanho precisamente. Devido à repartição das gotículas, este método não é adequado para preparar cápsulas mais pequenas do que 500 um. Além disso, apenas a observação visual pode determinar o tamanho das cápsulas, portanto, é difícil controlar o tamanho das cápsulas por este método. Neste caso, a utilização de dispositivos de microfluidos, possivelmente, pode resolver estes problemas 11. No entanto, às vezes o entupimento ocorre em microdispositivo porque géis Alg-Na imediatamente após a reunião CaCl2 solutde iões.
Apesar de o alginato não é adequado para modificação química devido à sua elevada viscosidade, que é capaz de formar cápsulas de híbridos com hidrogel, que, tal como PEG, é também difícil de utilizar para encapsulamento. A publicação anterior mostrou que a encapsulação de células iPS do mouse em um peptídeo conjugado com RGD PEG-Alg cápsula de hidrogel híbrido melhorado crescimento celular 12. Sem modificação química, a encapsulação de células em cápsulas de hidrogel apenas seria de esperar para modificar o nicho de células estaminais através da retenção de factores segregados. De fato, pesquisas anteriores demonstraram que os fatores de crescimento secretadas, retidos em um microbioreactor, foram eficazes no controle do destino da célula-tronco 13,14.
A recolha de células a partir de cápsulas é ainda um problema por resolver em relação à aplicação do método de encapsulamento para a produção em massa de células estaminais pluripotentes. Um relato anterior mostrou que este revestimento de PLL é necessário keep células iPS rato dentro 7. Se Alg-Ca cápsulas de hidrogel são bem revestido com um policatião como a PLL (protocolo de 3,1-3,2), que vai ser difícil de quebrar as cápsulas por qualquer uma das enzimas ou reagentes quelantes. Neste caso, um método mecânico, tais como a pipetagem pela agulha é necessária (protocolo 4.3). As células colhidas pode ser isolado a partir de membranas quebrados no centrifugação superior a 5.000 x g, apesar de centrifugação pode possivelmente afectar a viabilidade celular devido à elevada força-G. Assim, uma técnica de remoção de detritos de células suavemente, bem como quebrar as cápsulas é importante no desenvolvimento da tecnologia de encapsulamento. Embora alguns maior desenvolvimento é obrigado a aplicar este método para a produção em massa de células, o encapsulamento é uma técnica promissora para a produção em massa e investigação em células estaminais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
