Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52836
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Oral Microbiology and Immunology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University

Introduction

Bakterien spielen eine Rolle in der Ätiologie der verschiedenen oralen Erkrankungen wie Parodontitis, Pulpitis, Perikoronitis, Cellulitis und Osteomyelitis. Um die Rolle von Bakterien in der Pathogenese der Krankheit zu verstehen und um die Wirkung der Behandlung zu überwachen, ist die Lokalisierung von Bakterien innerhalb des Gewebes wichtig. Die Anwesenheit von Bakterien im Zahnfleischgewebe von Patienten mit Periodontitis wurde mit verschiedenen Methoden dargestellt, mit Elektronenmikroskopie 1,2, Immunhistochemie und Immunfluoreszenz unter Verwendung von Bakterien-spezifischen Antikörpern 3-7 und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung eines Fluoreszenz-8 markierte Oligonukleotidsonde Targeting 16S-rRNA. Gleichwohl sind diese Verfahren nicht in großem Umfang aufgrund technischer Einschränkungen oder Schwierigkeiten eingesetzt. Verglichen mit den Antikörpern, sind Sonden Targeting 16S rRNA einfach herzustellen und zu erreichen Artspezifität. FISH hat sich als ein hervorragendes Werkzeug zur Visualisierung von bact seineria in ihrer natürlichen Umgebung, wie beispielsweise Plaque-Biofilm. Jedoch ist die Anwendung der FISH zur Gewebeproben aufgrund Autofluoreszenz der verschiedenen Gewebekomponenten beschränkt. Zum Beispiel die starke Autofluoreszenz von roten Blutkörperchen die oft den Einsatz von Fluoreszenz-Technologie entzündeten Geweben, wenn sie beinhalten Blutungen 9.

Um Bakterien in den entzündeten Zahnfleischgewebe zu lokalisieren, damit eine in situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Digoxigenin (DIG) -markierten DNA-Sonde wurde entwickelt und erfolgreich angewendet 10,11. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Lokalisierung von Bakterien in Paraffin eingebettetem Gewebe unter Verwendung von P. gingivalis-spezifischen und universellen eubakteriellen Sonden wurde beschrieben. Es wird besonders auf die Standardisierung des Verfahrens so, dass ähnliche Ergebnisse in anderen Labors reproduziert werden konzentriert. Dieses Protokoll ermöglicht die Lokalisierung von Bakterien in ihrem Kontext und der histologischen results sind hoch reproduzierbar. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Bakterien entweder in einer artspezifischen oder universell in verschiedenen Geweben zu lokalisieren. Die Universalsonde ist besonders nützlich, um Bakterien in polymicrobial Krankheiten zu detektieren und eine mögliche Rolle von Bakterien bei Krankheiten zu studieren, wo die Rolle von spezifischen Bakterien nicht bekannt ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Probe Vorbereitung

  1. PCR-Amplifikation der Sonde
    1. Für die P. gingivalis-spezifischen Sonde, verstärken eine 343-bp-DNA-Fragment von P. gingivalis 16S rRNA durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA von P. gingivalis und der folgenden Primer: 5'TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'und 5'-ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. Zuführen Amplifikationen mit den folgenden Zyklusbedingungen: 35 Zyklen bei 95 ° C für 30 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 1 min 20 sec, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 ° C 10,11.
    2. Verstärken die eubakteriellen Sonde mit Hilfe eines 70-bp-DNA-Fragment (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') synthetisiert werden, wie einem Oligonukleotid und der folgenden Primer: 5'-CAG CTG GTR CMT GGY-3' und 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3 '11. Führen Amplifikationen mit den folgenden Zyklusbedingungen: 40 Zyklen9 4 ° C für 30 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 1 min 20 s, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 ° C 11,12.
    3. Ausfällen der PCR-Produkte (≥500 ul) durch Zugabe von 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 100% Ethanol (in einer 10: 1: 2-Verhältnis) und Inkubation bei -20 ° C für 2 Std.
    4. Zentrifuge das Gemisch bei 14.000 × g für 15 min, das Pellet in 100 ul TE-Puffer und Messung der DNA-Konzentration durch optische Dichte bei 260 nm.
  2. DIG-Markierung mit einem DIG DNA-Markierung und Nachweis-Kit
    1. Mix 3 ug der Sonde mit Wasser auf ein Endvolumen von 15 ul.
    2. Denaturieren der DNA bei 95ºC für 10 min und schnell auf Eis kühlen.
    3. Add 2 ul 10fach Hexanukleotid-Mix, 2 & mgr; l dNTP-Markierungsmischung und 1 ul Klenow-Enzym zu 15 & mgr; l des denaturierten DNA.
    4. Mischen und bei 37 ° C für 24 h bis 48 h und Stop-Reaktion durch Erhitzen auf 65 ° C.
  3. Überprüfen Sie die Empfindlichkeit der DIG-markierten Sonde mit einem DIG DNA-Markierung und Nachweis-Kit
    1. Manuell laden 1 ul Verdünnungsreihen der positive Kontrollsonde im Kit enthalten und 1 ng der DIG-markierten Sonde auf der Nylonmembran und trocken für 5 min bei RT.
    2. Kurz einwirken die Membran in 2 × SSC-Puffer (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und Inkubieren der Membran bei 80 ° C für 1 Stunde, um die DNA zu immobilisieren.
    3. Kurz einwirken der Membran in Maleinsäurepuffer (MAB, 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) und Inkubieren mit Anti-DIG-Alkalische Phosphatase (AP) konjugiertem Antikörper verdünnt (1: 5000) in 6 ml Blockierungslösung bereitgestellt im Kit bei RT für 30 min.
    4. Waschen der Membran mit MABT (MAB, das 1% Tween 20) und wendet wurden 40 ul der NBT / BCIP-Lösung mit 2 ml Nachweispuffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, pH 9,5) auf das gemischt- Membran für 1 min. Wenn die Empfindlichkeit der markierten Sonde istnicht zufriedenstellend, wiederholen Sie die Schritte von 1.1.3 bis 1.3.4.
    5. Messung der DNA-Konzentration der markierten Sonde (OD260) Die Konzentration ist anzupassen, um 100 ng & mgr; l -1.
  4. Überprüfen Sie die Spezifität der DIG-markierten Sonde
    1. Denaturieren genomischer DNA-Proben (25 ng 3 ul -1 pro jeder Probe) aus verschiedenen Bakterienspezies, einschließlich des Bakteriums von der spezifischen Sonde ausgerichtet, bei 95 ° C für 10 min und schnell auf Eis kühlen.
    2. Die denaturierte DNA auf der Nylonmembran und trocken manuell laden für 20 min bei RT.
    3. Kurz einwirken die Membran in 2 × SSC-Puffer und Inkubation der Membran bei 80 ° C für 2 Stunden, um die DNA zu immobilisieren.
    4. Blockieren der Membran mit einer Blockierungslösung bei Raumtemperatur für 1 Std.
    5. Verdünnen Sie die Sonde bei 1 ng ul -1 in Hybridisierungspuffer, Denaturierung der verdünnten Proben, und wenden auf die Membran.
    6. Inkubieren der Membran bei 45 ° C für 1 Stunde.
    7. Waschen Sie die Membran dreiMal mit 2x SSC-Puffer.
    8. Kurz einweichen die Membran in MAB.
    9. Inkubieren mit Anti-DIG-AP-konjugierten Antikörper, verdünnt (1: 2000) in 6 ml Blockierungslösung bei Raumtemperatur 1 Stunde.
    10. Waschen der Membran mit MABT und anzuwenden 40 ul der NBT / BCIP-Lösung mit 2 ml Nachweispuffer gemischt.
    11. Wenn die Sonde nicht die erhoffte Spezifität erhöhen die Hybridisierungstemperatur, bis der Spezifität beobachtet.

2. In situ-Hybridisierung

Hinweis: Um die Trocknung der Proben und Reagenzien zu vermeiden, führen alle Inkubationen in einer befeuchteten Kammer mit feuchten Papiertüchern ausgekleidet.

  1. De-paraffinization und Rehydrierung der Gewebeschnitte
    1. Bereiten Sie 4 um dicke Gewebeschnitte von in Paraffin eingebetteten Blöcken. Formalin, Paraformaldehyd und Zinkbasis Fixiermittel sind mit diesem Protokoll kompatibel.
    2. Bereiten Sie alle Reagenzien mit DEPC-behandeltem Wasser.
    3. Wärmeträger in einem Trockenofen bei 60 ° C für 30 min inkubieren Folien bei Raumtemperatur 30 min.
    4. Einzutauchen gleitet in 100% Xylol für 5 min dreimal; frisches Xylol jedes Mal.
      Hinweis: Führen Sie diese Entparaffinierung Verfahren in einem Chemieabzug benutzen.
    5. Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol für 5 min zweimal mit frischem Ethanol gewaschen und rehydrieren Proben in serielle 90%, 80% und 70% Ethanol-Lösungen für jeweils 5 Minuten.
    6. Einzutauchen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 1 min und waschen Folien in mit DEPC behandeltem PBS (pH 7,4) für 6 min.
  2. Vorbehandlungen von Gewebeschnitten
    1. Einzutauchen Folien in 0,1 N Salzsäure für 20 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 30 sec.
    2. Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere rund um Proben mit einem Wachsstift.
      Hinweis: Die Größe der hydrophoben Barriere hängt von der Größe der Proben. Daher variieren die Mengen der Reagenzien in den folgenden Schritten verwendet wird, auf die Größe der Proben abhängig, sondern den hy füllenphobe Barriere (50 ul für kleine Proben und 400 & mgr; l für große Proben).
    3. Behandlung von Proben mit 50 bis 400 & mgr; l Proteinase K (1-10 ug ml-1 in mit DEPC behandeltem PBS) in einem Trockenofen bei 37 ° C für 30 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem 1x PBS für 1 min.
    4. Einweichen gleitet in 4% Paraformaldehyd in DEPC behandeltem PBS für 10 min, dann waschen Folien in mit DEPC behandeltem PBS für 1 min.
    5. Einweichen Folien in 0,1 M Triethanolamin-HCl (pH 8,0), enthaltend 0,5% Essigsäureanhydrid für 20 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 30 sec.
  3. Die Hybridisierung mit Sonde und Waschen
    1. Einzutauchen Folien in 2 × SSC-Puffer für 20 min.
    2. Verdünne die Sonde bei 1 ng & mgr; l -1 in Hybridisierungspuffer (4 × SSC, 50% [Vol / Vol] Formamid, 1x Denhardt-Lösung, 10% [w / v] Dextransulfat, 0,1% [Gew / Vol] Natriumdodecylsulfat, 0,4 mg ml -1 Lachssperma-DNA). Für Negativkontrollen, mischen Sie die markierte Sonde mitein 10-facher Überschuß von nicht-markierten Sonde.
    3. Denaturierung der verdünnten Proben und gelten 50 bis 400 & mgr; l auf Gewebeschnitten. Legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger und Dichtung mit Nagellack.
    4. Wärmeträger in PCR-Maschine bei 90 ° C für 10 min inkubieren Objektträger in einer Feuchtkammer O / N bei 45 ° C oder optimale Temperatur beim Schritt 1.4.11 bestimmt.
    5. Kühlen Sie die Objektträger bei 4 ° C für 30 Minuten, entfernen Sie Deckgläser und Objektträger eintauchen in eine serielle SSC-Puffer als Followings: 4x SSC für 10 Minuten, vorgewärmten (45 ° C) 2 × SSC für 20 Minuten, 2x SSC für 10 min und 0,2 × SSC für 10 min.
  4. Detektion mit anti-DIG AP-konjugierten Antikörper
    1. Waschen Folien MABT für 5 min.
    2. Block mit 50 bis 400 & mgr; l Blockierlösung mit 1% Tween 20 für 20 min.
    3. Hinzuzufügen 50-400 ul anti-DIG-AP-Antikörper in Blockierungslösung (1: 1.000) verdünnt anld bei 37 ° C für 90 min.
    4. Waschen Folien MABT für 10 min.
      5. <li> Tauchen Folien in Detektionspuffer, der 1% Tween 20 für 5 min.
    5. Behandlung mit 50 bis 400 μ von 1 mM Levamisol (in Nachweispuffer, der 1% Tween 20) für 5 min auf endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren.
    6. Verteilen von 50 bis 400 ul der vorgemischten NBT / BCIP-Lösung (in Detektionspuffer auf 1: 100 verdünnt) auf jeder Probe und inkubiere Folien in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 2 bis 3 h, bis das entwickelte Signal zufriedenstellend.
    7. Spülen Sie Dias mit entionisiertem Wasser bis zur Visualisierung an und ziehen Sie 50 bis 400 & mgr; l von 0,05% [w / v] methyl grün als Gegenfärbung bei 37 ° C für 10 min.
    8. Spülen Sie Dias mit entionisiertem Wasser, entwässern in 100% Ethanol, und tauchen in Xylol.
    9. Übernehmen 80 ul Befestigungslösung auf jedem Objektträger geben und mit Deckgläschen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 zeigt Dot-Blotting von DIG-markierten Sonden im Vergleich mit der positiven Kontrollsonde in dem Satz um ihre Empfindlichkeit zu bestimmen. Das 343 bp P. gingivalis -spezifischen Sonde ist 25-mal empfindlicher ist als die 70 bp eubakteriellen Sonde, Fig. 2 zeigt in-situ-Hybridisierung von Patienten mit chronischer Periodontitis zum Nachweis von P. erhalten Gingivagewebe gingivalis und Eubakterien. Die Bakterien Signale, in violett dargestellt, wurden im Rahmen des Epithels, der Lamina propria und Biofilm außerhalb des Gewebes befindet erkannt. Jedoch ist die Verteilung von P. gingivalis und Eubakterien im Zahnfleischgewebe war anders. Bei hoher Vergrößerung (1,000x), verschiedene Formen (coccus, Stange, spindelförmig, und behaart Form) von Bakterien sichtbar waren mit dem eubakteriellen Sonde, während nur stabförmigen Bakterien wurden von der P. erfasst gingivalis-spezifischen Sonde. Die dispergierten Formen bakterieller Signalewurden ebenfalls beobachtet.

Hajishengallis et al. zeigten die wesentliche Rolle des kommensalen Bakterien in der Entwicklung von P. gingivalis induzierten experimentellen Parodontitis bei Mäusen 14. Die Anwendung von Dextransulfat-Natrium (DSS), ein tight junction (TJ) Brechender chemischen, auf Gingivaschleimhaut induzierte Parodontitis und Alveolarknochen Verlust bei Mäusen 13. Eubakteriellen Sonde erfolgreich erkannt Bakterien in den Zahnfleischgewebe vom DSS Gruppe, die nicht durch die P. nachgewiesen gingivalis-spezifischen Sonde (Abbildung 3).

Eubakteriellen Sonde ist nützlich für die Untersuchung der potenziellen Beteiligung von Bakterien in anderen Krankheiten. Seit der Internationalen Agentur für Krebsforschung Helicobacter pylori als Grad I Karzinogen für Magenkrebs mit 15 bezeichnet, hat mögliche Beteiligung von Bakterien in der Entwicklung von anderen Krebsarten in großem Umfang untersucht. Wenn sections von Lungenbiopsien mit Plattenepithelkarzinomen diagnostiziert wurden in situ mit eubakteriellen Sonde hybridisierten, wurden die Bakterien sowohl innerhalb der Tumorzellen und bei den umliegenden Stromazellen nachgewiesen / Infiltrationszellen (Abbildung 4). In-situ-Hybridisierung unter Verwendung der eubakteriellen Sonde wurde ebenfalls angewendet erkunden Sie das Vorhandensein von Bakterien in den Läsionen der oralen Lichen ruber, einer entzündlichen Immunerkrankung mit unbekannter Ursache. Interessanterweise wurden bakterielle Signale nicht nur innerhalb der Epithelien, sondern auch in der Lamina propria, wo bandförmige Infiltration beobachtet wurde, festgestellt. Unter hoher Vergrßerung wurden die Bakteriensignale in den Zellkernen von vielen Zellen (5) detektiert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Sensitivity Test der DIG-markierten Sonden. Seriell verdünnte custom-markierten Sonden und eine positive control-Sonde mit dem Kit mitgeliefert wurden dot mit Anti-DIG-AP-konjugierten Antikörper geblottet. Nach Zugabe des Substrats, des Blots mit dem P. gingivalis-spezifischen Sonde wurde für 30 s entwickelt, während der Blot mit dem eubakteriellen Sonde wurde für 1 min entwickelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2. Nachweis von Bakterien im Zahnfleischgewebe von Patienten mit chronischer Periodontitis erhalten wurde. Abschnitte der Zahnfleischproben von gesunden Stelle (A) und der erkrankten Stelle (B) eines Patienten mit Parodontitis wurden Hämatoxylin-Eosin unterworfen (H & E) Färbung oder in situ-Hybridisierung mit entweder dem P. gingivalis-spezifischen Sonde oder die eubakteriellen Sonde. Negative Kontrollen wurden mit der Sonde mit 10-fachen Überschuß nicht-markierten Sonde gemischt hybridisiert. Der vergrößerte Bereich wird mit einem quadratischen Feld angezeigt. Vertreter positive Signale, in violett dargestellt, sind mit dünnen Pfeilen markiert. Dicken Pfeile zeigen Plaque Biofilm außerhalb des Gewebes. Die Plaque Biofilms an 1,000x Vergrößerung untersucht werden in Einsätzen gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Figur 3. Nachweis der oralen kommensalen Bakterien im Zahnfleischgewebe von Maus. Experimental Periodontitis wurde in BALB / c-Mäusen durch orale Beimpfung von P. induzierte gingivalis (Pg) oder Anwendung DSS auf Gingivaschleimhaut. Zahnfleischschnitten von Mäusen wurden in H & E-Färbung oder in situ Hybridisierung mit entweder der zogen < em> P. gingivalis-spezifischen Sonde oder die eubakteriellen Sonde. Vertreter positive Signale, in violett dargestellt, sind mit Pfeilen markiert. Original Vergrößerung x400. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Nachweis von Bakterien im Krebs Läsion. Die Abschnitte der Lunge Biopsien von Patienten mit Plattenepithelkarzinom diagnostiziert wurden mit H & E oder in situ entweder mit dem universellen eubakteriellen Sonde oder die Negativkontrolle Sonde hybridisiert gefärbt. Der vergrößerte Bereich wird mit einem quadratischen Feld angezeigt. Vertreter positive Signale, in violett dargestellt, sind mit Pfeilen markiert. Grenze der Tumorzellen werden mit gepunkteten Linien angedeutet.Arget = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Nachweis von Bakterien in den Läsionen der oralen Lichen ruber. Die Abschnitte der Biopsie von Wangenschleimhaut als orale Lichen ruber diagnostiziert wurden mit H & E oder in situ entweder mit dem universellen eubakteriellen Sonde oder die Negativkontrolle Sonde hybridisiert gefärbt. Die vergrößerte Bereiche sind mit einem quadratischen Feld angezeigt. Vertreter positive Signale, in violett dargestellt, sind mit Pfeilen markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier ein Protokoll, um Bakterien in Paraffin eingebetteten Gewebe unter Verwendung eines DIG-markierte DNA-Sonde wurde beschrieben zu lokalisieren. Die Sonde selektiv DNA oder RNA-Moleküle von bakteriellen 16S-rRNA-Gens und des 16S-rRNA-Targeting-Sonden können entweder als artspezifische oder Universal ausgebildet sein. Die spezifische Hybridisierung des P. gingivalis-spezifischen Sonde an P. gingivalis, aber nicht auf andere orale Bakterien wurde bereits gezeigt worden 10. Im Gegensatz dazu die eubakteriellen Sonde an allen getesteten bakteriellen genomischen DNA (17 verschiedene Arten) hybridisiert, wobei die Hybridisierungseffizienz variierte 12. Die Zahl der T-Nukleotide, die in der Probe ermittelt, die Effizienz der DIG-Markierung. Herstellung einer DIG-markierten Sonde mit hoher Sensitivität ist der kritischste Schritt für die erfolgreiche Durchführung des beschriebenen Protokolls. Behandlung der Proben mit Salzsäure verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis durch die Extraktion von Proteinen und partielle hydrolysis von Zielsequenzen. Eine Erhöhung der Konzentration von Proteinase K erhöht Ziel Zugänglichkeit der Sonden reduziert aber Gewebeerhaltung. Daher wird empfohlen, mehrere Konzentrationen von Proteinase K zu testen, abhängig von den Arten von Gewebe. Der Acetylierungsschritt abnimmt Hintergrund Bindung der negativ geladenen Elektrode an die Proteine ​​des Gewebes durch die Acetylierung der positiv geladenen Aminogruppen. Nach einer Reihe von dieser Vorbereitungsschritte, reißen die Gewebeschnitte leicht somit mit Vorsicht behandelt werden. Hintergrund ist minimal im Vergleich mit Fisch. Jedoch sollten die Signale von Geweben mit hoher endogene alkalische Phosphatase-Aktivität, wie Knochen und Schleimdrüsen kritisch interpretiert werden.

PCR-amplifizierte DNA-Sonden sind einfach herzustellen und stabil im Vergleich zu RNA-Sonden. Der immunhistochemische Nachweis der hybridisierten Sonden erlaubt die Identifizierung von histologischen Strukturen durch Vergleich mit H & E-gefärbten Schnitten: Epithel,Bindegewebe, entzündlichen Infiltraten und Blutgefäße sind gut unterscheiden. Eine der Beschränkungen der beschriebenen Protokoll ist die Unfähigkeit, mehrere Sonden gleichzeitig anzuwenden. Zusätzlich ist der Ausschluss der Signale von bakteriellen Verunreinigungen auf der Oberfläche der Abschnitte begrenzt.

Dieses Protokoll kann angepasst ist, andere bakterielle Transkripte in Gewebeabschnitten 16 zu erkennen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll erweitert werden, um eine Doppelfärbung mit immunhistochemischen Nachweis eines Wirtszellmarker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss (2013R1A1A3005669) von der National Research Foundation Korea und einem Zuschuss (HI13C0016) des koreanischen Health Technology R & D Project, Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride Sigma 6404
50% Dextran sulfate solution Millipore S4030
50X Denhardt’s solution Sigma D2532
DEPC Sigma P159220
DIG DNA labeling and detection kit Roche 11 093 657 910
Formamide Sigma F9037
ImmEdge™ Pen Dako H-400
Levamisole Vector SP-5000
Magnesium chloride Sigma 246964
Maleic acid Sigma M0375
Methyl green Sigma M6776
Paraformaldehyde Sigma P1648
Permount Fisher SP15-500
Salmon sperm DNA solution Invitrogen #15632-011
Sodium chloride Sigma S9625
Sodium citrate Duksan D1420
Sodium dodecyl sulfate Amresco 227
Triethanolamine-HCl Sigma 90279
Tris-HCl Research organics 3098T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
  2. Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
  3. Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
  4. Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
  5. Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
  6. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  7. Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
  8. Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
  9. Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
  10. Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
  11. Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
  12. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
  13. Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
  14. Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
  16. Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).

Tags

Immunologie Parodontologie orale Mikrobiologie, Bakterien in Paraffin eingebetteten Gewebe artspezifischen universal
<em>In-situ-Nachweis</em> von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K.… More

Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836, doi:10.3791/52836 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter