Introduction
Bakterier spiller en rolle i etiologien av forskjellige orale sykdommer så som periodontitt, pulpitt, perikoronitt, cellulitt, og osteomyelitt. For å forstå rollen til bakterier i patogenesen av sykdom og for å overvåke effekten av behandlinger, er lokaliseringen av bakterier i vevet viktig. Nærvær av bakterier i gingival vev fra pasienter med periodontitt har blitt vist ved hjelp av forskjellige metoder, inkludert elektronmikroskopi 1,2, immunohistokjemi og immunfluorescens ved å bruke bakterie spesifikke antistoffer 3-7 og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) 8 ved hjelp av en fluorescence- merket oligonukleotidprobe målretting 16S rRNA. Likevel er disse metodene ikke mye brukt på grunn av tekniske begrensninger eller vanskeligheter. Sammenlignet med antistoffer, sonder målretting 16S rRNA er enkle å produsere og oppnå arts spesifisitet. FISH har vist seg å være et utmerket verktøy for visualisering av bacteria i sine naturlige miljøer som plakk biofilm. Imidlertid, anvendelse av fisk til vevsprøver er begrenset på grunn av forskjellige autofluorescens vevskomponenter. For eksempel, den sterke autofluorescens av røde blodceller hemmer ofte anvendelse av fluorescens-teknologi for å betent vev når de involverer blødning 9.
For å lokalisere bakterier i betente gingivale vev, og derfor en in situ-hybridisering ved anvendelse av en digoksigenin (DIG) -merket DNA-probe er blitt utviklet og anvendt med suksess 10,11. Her en detaljert protokoll for lokalisering av bakterier i parafininnstøpte vev ved bruk av P. gingivalis-spesifikke og universelle eubakterielle onder har blitt beskrevet. Det er spesielt fokusert på standardisering av metoden, slik at lignende resultater kan reproduseres i andre laboratorier. Denne protokollen tillater lokalisering av bakterier innenfor deres histologisk kontekst og results er reproduserbar. Den beskrevne protokoll kan benyttes for å lokalisere bakteriene enten i en artsspesifikk eller universell måte i forskjellige vev. Den universelle probe er spesielt nyttig for å påvise bakterier i polymikrobielle sykdommer og for å undersøke en mulig rolle av bakterier i sykdommer hvor rollen til spesifikke bakterier er ikke kjent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Probe Forberedelse
- PCR-amplifisering av sonden
- For P. gingivalis -spesifikk probe, forsterke et 343-bp DNA-fragment av P. gingivalis 16S rRNA ved PCR ved anvendelse av genomisk DNA fra P. gingivalis og følgende primere: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'og 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. Utfør amplifikasjoner med følgende syklusbetingelser: 35 sykluser ved 95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 min 20 sek, etterfulgt av en 5 min forlengelse ved 72 ° C 10,11.
- Forsterke eubakterielle probe ved anvendelse av et 70-bp DNA-fragment (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') syntetisert som et oligonukleotid, og de følgende primere: 5'-CAG CTG GTR CMT GGY-3' og 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3 '11. Utfør presiseringer med følgende sykleforhold: 40 sykluser9 ved 4 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 min 20 s etterfulgt av en 5 min forlengelse ved 72 ° C 11,12. - Utfelling av PCR produktene (≥500 ul) ved tilsetning av 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 100% etanol (til en 10: 1: 2-forhold) og inkubering ved -20 ° C i 2 timer.
- Sentrifuger blandingen ved 14 000 xg i 15 min, resuspender pelleten i 100 pl TE-buffer, og måle den DNA-konsentrasjonen ved hjelp av optisk densitet ved 260 nm.
- DIG-merking ved hjelp av en DIG DNA merking og gjenkjenning kit
- Bland 3 pg av sonden med vann til et sluttvolum på 15 ul.
- Denaturere DNA ved 95 ° C i 10 minutter og raskt kjøle på is.
- Tilsett 2 mL av 10x hexanucleotide mix, 2 ul av dNTP-merking mix, og en ul Klenowenzym til 15 mL av denaturert DNA.
- Bland og inkuber ved 37 ° C i 24 timer til 48 timer og stoppe reaksjonen ved oppvarming ved 65 ° C.
- Kontroller følsomheten av DIG-merkede probe ved hjelp av et DIG DNA merking og deteksjonssett
- Manuelt laste en fil av serielle fortynninger av den positive kontroll-proben som følger med settet og 1 ng av den DIG-merkede probe på nylonmembran og tørke i 5 minutter ved RT.
- I korthet suge membranen i 2 x SSC-buffer (0,3 M NaCl, 30 mM natriumsitrat, pH 7,0) og inkuberes membranen ved 80 ° C i 1 time for å immobilisere DNA.
- I korthet suge membranen i maleinsyre-buffer (MAB, 0,1 M maleinsyre, 0,15 M NaCl, pH 7,5) og inkuberes med anti-DIG alkalisk fosfatase (AP) -konjugert antistoff fortynnet (1: 5000) i 6 ml blokkeringsløsning tilgjengelig i settet ved RT i 30 min.
- Vask membran med MABT (MAB inneholdende 1% Tween 20) og anvende 40 pl av NBT / BCIP løsning blandet med 2 ml deteksjonsbuffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, pH 9,5) på Membranen i 1 min. Hvis følsomheten av den merkede probenikke tilfredsstillende, gjenta trinn fra 1.1.3 til 1.3.4.
- Mål-DNA-konsentrasjonen av den merkede probe (OD260) og justere konsentrasjonen til 100 ng ul -1.
- Kontroller spesifisiteten av den DIG-merkede probe
- Denaturering genomiske DNA-prøver (25 ng 3 mL -1 per hver prøve) fra forskjellige bakteriearter, deriblant bakterien målrettet av den spesifikke sonde, ved 95 ° C i 10 minutter og raskt kjøle på is.
- Manuelt laste denaturert DNA på nylonmembranen og tørke i 20 min ved RT.
- I korthet suge membranen i 2x SSC buffer og inkuber membranen ved 80 ° C i 2 timer for å immobilisere DNA.
- Blokker membran med en blokkeringsløsning ved romtemperatur i 1 time.
- Fortynn sonden ved 1 ng mL -1 i hybridiseringsbuffer, denaturerer de fortynnede sondene, og anvende på membranen.
- Inkuber membranen ved 45 ° C i 1 time.
- Vask membranen treganger med 2x SSC buffer.
- I korthet suge membranen i MAB.
- Inkuber med anti-DIG AP-konjugert antistoff fortynnet (1: 2000) i 6 ml blokkeringsløsning ved romtemperatur i 1 time.
- Vask membranen med MABT og anvende 40 pl av NBT / BCIP løsning blandet med 2 ml deteksjonsbuffer.
- Når sonden ikke oppnår den forventede spesifisitet, øker hybridiseringen temperatur inntil spesifisiteten blir observert.
2. In Situ Hybridisering
Merk: For å unngå tørking av prøver og reagenser, utføre alle inkuberinger i en fuktet kammer foret med våte papirhåndklær.
- De-paraffinization og rehydrering av vevssnitt
- Forbered 4 mikrometer tykke vevssnitt fra parafininnstøpte blokker. Formalin, paraformaldehyde og sink-basert fiksativ er kompatible med denne protokollen.
- Forbered alle reagenser som bruker DEPC-behandlet vann.
- Varme glir i en tørr ovn ved 60 ° C i 30 min og inkuber lysbilder ved romtemperatur i 30 min.
- Fordype lysbilder i 100% xylen i 5 min tre ganger; bruke fersk xylen hver gang.
Merk: Gjør dette de-voksing prosedyre i avtrekksskap. - Dyppe objektglass i 100% etanol i 5 min to ganger, ved hjelp av frisk etanol hver gang, og rehydrere belegg i serie 90%, 80% og 70% etanol-løsninger i 5 min hver.
- Dyppe objektglass i DEPC-behandlet vann i 1 min og vaske objektglass i DEPC-behandlet PBS (pH 7,4) i 6 min.
- Forbehandling av vevssnitt
- Fordype lysbilder i 0,1 N saltsyre i 20 minutter og vask lysbilder i DEPC-behandlet vann i 30 sek.
- Tegn en hydrofob barriere rundt prøver ved hjelp av en voks penn.
Merk: Størrelsen av den hydrofobe barrieren, avhenger av størrelsen av prøver. Derfor volumer av reagenser som brukes i de følgende trinn varierer avhengig av størrelsen på prøvene, men må fylle HYdrophobic barriere (50 ul for små prøver og 400 mL for store prøver). - Behandle prøver med 50-400 ul proteinase K (1 til 10 ug ml -1 i DEPC-behandlet PBS) i en tørr ovn ved 37 ° C i 30 minutter og vask glir i DEPC-behandlet 1 x PBS i 1 min.
- Sug glir i 4% paraformaldehyd i DEPC-behandlet PBS i 10 minutter, deretter vaske objektglass i DEPC-behandlet PBS i 1 min.
- Sug lysbilder i 0,1 M trietanolamin-HCl (pH 8,0) inneholdende 0,5% eddiksyreanhydrid i 20 minutter og vask glir i DEPC-behandlet vann i 30 sek.
- Hybridisering med sonde og vasking
- Fordype lysbilder i 2x SSC buffer i 20 min.
- Fortynn sonden ved 1 ng mL -1 i hybridiseringsbuffer (4x SSC, 50% [volum / volum] formamid, 1 x Denhardts løsning, 10% [vekt / volum] dekstransulfat, 0,1% [vekt / volum] natriumdodecylsulfat, 0,4 mg ml -1 laks sperm DNA). For negative kontroller, bland den merkede probe medet 10-gangers overskudd av ikke-merket probe.
- Denaturering av utvannet prober og bruke 50-400 ul på vevssnitt. Plasser et dekkglass på lysbildet og forsegle med neglelakk.
- Varme glir i PCR maskin ved 90 ° C i 10 minutter og inkuberes glir i et fuktet kammer O / N ved 45 ° C eller optimale temperatur bestemmes i trinn 1.4.11.
- Kule lysbildene ved 4 ° C i 30 min, fjern dekkglass, og fordype lysbilder i en serie SSC buffer som følgende: 4x SSC i 10 minutter, forvarmet (45 ° C) 2x SSC i 20 min, 2x SSC for 10 min, og 0,2 x SSC i 10 min.
- Detection med anti-DIG AP-konjugert antistoff
- Vask slides i MABT i 5 min.
- Blokker med 50 til 400 pl blokkeringsløsning med 1% Tween 20 i 20 min.
- Legg 50 til 400 ul av anti-DIG-AP-antistoff fortynnet i blokkeringsløsning (1: 1000) anld Inkuber ved 37 ° C i 90 min.
- Vask slides i MABT i 10 min. <li> dyppe objektglass i deteksjonsbuffer inneholdende 1% Tween 20 i 5 min.
- Behandl med 50 til 400 μ av 1 mM levamisol (i deteksjonsbuffer inneholdende 1% Tween 20) i 5 minutter for å inaktivere endogen alkalisk fosfatase.
- Fordel 50 til 400 pl av den forblandede NBT / BCIP-løsning (fortynnet i buffer ved påvisning 1: 100) på hver prøve, og inkuber glir i et fuktet kammer ved RT i 2 til 3 timer inntil det utviklede signalet er tilfredsstillende.
- Vask objektglass med avionisert vann for å stanse visualisering og anvende 50 til 400 pl av 0,05% [vekt / volum] metyl grønn flekk som en teller ved 37 ° C i 10 min.
- Skyll lysbilder med de-ionisert vann, tørke i 100% etanol, og lev i xylen.
- Påfør 80 mL av monteringsløsningen på hvert lysbilde og dekk med dekkglass.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser dot-blotting av DIG-merkede prober, sammenlignet med den positive kontroll-proben tilgjengelig i settet for å bestemme deres følsomhet. Den 343 bp P. gingivalis -spesifikk probe er 25 ganger mer følsom enn 70 bp eubakterielle probe. Figur 2 viser in situ hybridisering av gingival vev oppnådd fra pasienter med kronisk periodontitt for påvisning av P. gingivalis og eubacteria. Bakterie signaler, som er vist i fiolett, ble påvist i det epitel, lamina propria, og biofilm som ligger utenfor vevet. Men fordelingen av P. gingivalis og eubacteria i tannkjøttvevet var forskjellig. Ved høy forstørrelse (1,000X), diverse former (coccus, stang, fusiform, og hårete form) av bakterier som var synlig ved hjelp av det eubakterielle probe, mens bare stavformede bakterier ble detektert av P. gingivalis -spesifikk probe. De spredte former for bakterie signalerDet ble også observert.
Hajishengallis et al. demonstrerte den vesentlige rollen som kommensale bakterier i utviklingen av P. gingivalis indusert eksperimentell periodontitt hos mus 14. Anvendelsen av Dekstransulfatet natrium (DSS), en tett kobling (TJ) -disrupting kjemiske, på gingival slimhinner indusert periodontitt og alveolarbentap i mus 13. Den eubakterielle probe hell oppdaget bakterier i tannkjøtt vev fra DSS gruppen som ikke ble oppdaget av P. gingivalis -spesifikk probe (figur 3).
Det eubakterielle probe er nyttig for studiet av den potensielle engasjement av bakterier i andre sykdommer. Siden International Agency for Research on Cancer utpekt Helicobacter pylori som en karakter jeg karsinogen for magekreft 15, har potensial involvering av bakterier i utviklingen av andre kreftformer vært mye studert. Når sections av lunge biopsier diagnostisert med squamous cell carcinoma ble in situ hybridisert med det eubakterielle probe, ble bakterier påvist både i tumorcellene og mellom de omgivende stromal / infiltrerende celler (figur 4). In situ-hybridisering ved anvendelse av det eubakterielle probe ble også anvendt for å utforske tilstedeværelse av bakterier i lesjoner av muntlige lichen planus, en betennelses immun sykdom med ukjent etiologi. Interessant ble det bakterielle signaler detektert, ikke bare innen epitel, men også i lamina propria, hvor båndlignende infiltrering ble observert. Under høy forstørrelse, ble de bakterielle signaler som detekteres i kjernen av mange celler (figur 5).
Figur 1. Sensitivitet test av DIG-merkede prober. Seriefortynnes skredder merket prober og en positiv kontrol sonde i settet ble prikken utslettet med anti-DIG-AP-konjugert antistoff. Etter tilsetning av substratet, idet blot med P. gingivalis -spesifikk probe ble utviklet for 30 sek, mens blot med eubakterielle sonden ble utviklet i 1 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Påvisning av bakterier i gingival vev oppnådd fra pasienter med kronisk periodontitt. Deler av gingival biopsier fra den friske området (A) og det syke området (B) av en pasient med periodontitt ble utsatt for hematoksylin-eosin (H & E) flekker eller in situ hybridisering med enten P. gingivalis -spesifikk probe eller det eubakterielle probe. Negative kontroller ble hybridisert med proben blandet med 10 gangers overskudd av umerket probe. Den forstørrede området merkes med en firkantet boks. Representative positive signaler, som vises i fiolett, er merket med tynne piler. Tykke piler indikerer plakett biofilm utenfor vev. Plakett biofilm undersøkt ved 1,000X forstørrelse er vist i innfellinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Påvisning av orale kommensale bakterier i tannkjøttvevet hos mus. Experimental periodontitt ble indusert i BALB / c-mus ved oral inokulering av P. gingivalis (Pg) eller anvendelsen av DSS på gingival slimhinnen. Gingival seksjoner fra mus ble utsatt for H & E farging eller in situ hybridisering med enten < em> P. gingivalis -spesifikk probe eller det eubakterielle probe. Representative positive signaler, som vises i fiolett, er merket med piler. Original forstørrelse er x400. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Påvisning av bakterier innenfor kreft lesjon. De delene av lunge biopsier fra pasienter diagnostisert med plateepitelkarsinom ble farget med H & E eller in situ hybridiserte med enten universell eubakterielle sonde eller den negative kontrollen probe. Den forstørrede området merkes med en firkantet boks. Representative positive signaler, som vises i fiolett, er merket med piler. Kant av tumorceller, er angitt med stiplede linjer.Arget = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Påvisning av bakterier innenfor lesjoner av muntlige lichen planus. De delene av biopsi fra munnslimhinnen diagnostisert som muntlige lichen planus ble farget med H & E eller in situ hybridiserte med enten universell eubakterielle sonde eller den negative kontrollen probe. De forstørrede områder er markert med en firkantet boks. Representative positive signaler, som vises i fiolett, er merket med piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her en protokoll for å lokalisere bakterier i parafininnstøpte vev ved bruk av et DIG-merket DNA-probe er blitt beskrevet. Sonden retter seg mot det DNA- eller RNA-molekyler av bakterielle 16S rRNA-genet, og 16S rRNA-målretting prober kan utformes enten som artsspesifikk eller universell. Den spesifikke hybridisering av P. gingivalis -spesifikk sonde til P. gingivalis, men ikke til andre orale bakterier er tidligere vist 10. I motsetning til dette, det eubakterielle probe hybridisert til alle bakterie genomisk DNA testet (17 ulike arter), selv om hybridisering effektivitet varierte 12. Antallet T-nukleotider i sonden bestemmer effektiviteten av DIG-merking. Produksjon av en DIG-merket probe med høy følsomhet er den mest kritiske trinnet for en vellykket gjennomføring av den beskrevne protokollen. Behandling av prøver med saltsyre forbedrer signal-til-støyforholdet ved utvinning av proteiner og delvis hydrolysis av målsekvenser. En økning i konsentrasjonen av proteinase K øker target tilgjengelighet av sonder, men reduserer vevet bevaring. Derfor er det anbefalt å teste flere konsentrasjoner av proteinase K, avhengig av hvilke typer av vev. Acetyleringen trinnet reduserer bakgrunnsbinding av den negativt ladede proben til proteinene i vevet ved acetylering av de positivt ladede aminogrupper. Etter en serie av disse fremstillingstrinn, vevssnittene rive lett, og dermed må håndteres med forsiktighet. Bakgrunnen er minimal sammenlignet med fisk. Imidlertid bør signalene fra vev med høy endogen alkalisk fosfatase-aktivitet slik som ben og slimkjertler være kritisk tolkes.
PCR-amplifiserte DNA-prober som er enkle å fremstille og stabile i forhold til RNA-prober. Immunhistokjemisk påvisning av hybridiserte prober tillater identifisering av histologiske strukturer gjennom sammenligning med H & E beiset deler: epitel,bindevev, inflammatoriske infiltrater, og blodårene er vel skilles. En av begrensningene i den beskrevne protokoll er den manglende evne til å anvende multiple prober samtidig. I tillegg, er utelukkelse av signalene fra bakterielle forurensninger på overflaten av seksjoner begrenset.
Denne protokollen kan tilpasses til å detektere andre bakterielle transkripter innen vevssnitt 16. I tillegg kan denne protokollen bli utvidet til det dobbelte immunhistokjemisk farging med deteksjon av en vertscellemarkør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av en bevilgning (2013R1A1A3005669) fra National Research Foundation of Korea og stipend (HI13C0016) av den koreanske Health Technology R & D Project, Ministry of Health & Welfare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
