Summary
振動は、基本的なネットワークのプロパティであり、病気や薬物によって調節されます。脳スライス振動を研究することは、制御された条件下で分離されたネットワークの特徴付けを可能にします。プロトコルはCA1のγ振動を誘発するための急性脳切片の調製のために提供されます。
Abstract
神経回路網の振動は、健康と疾患における脳活動の重要な特徴であり、臨床的に使用される薬物の範囲によって調節することができます。 （ - 80ヘルツ20）プロトコルはCA1のγ振動を研究するためのモデルを生成するために設けられています。これらのγ振動は、少なくとも30分間安定しており、ペースメーカー電流の活性化に加えて、興奮性と抑制性シナプス活性に依存します。 Tetanically刺激振動は、ネットワーク状態に報告スパイク·カウント、発振期間、待ち時間および周波数を含む再現性、容易に定量化可能な特性の数を持っています。電気的に刺激振動の利点は、安定性、再現性とネットワーク機能の強固な特性評価を可能にするエピソードの取得を含みます。 CA1のγ振動のこのモデルは、細胞メカニズムを研究し、体系的疾患および薬物によって変更される方法を神経回路網の活動を調査するために使用することができます。疾患状態の薬理学を容易に特に病気のメカニズムを標的とする薬剤の選択を可能にするように遺伝的に改変された、または介入の動物モデルからの脳切片を使用して組み込むことができます。
Introduction
脳のネットワーク振動が行動状態に相関異なった周波数帯域内で発生します。げっ歯類では、海馬θ振動（5から10 Hz）は、探索行動1,2の間に観察されたγ振動しながら-知覚と注意3,4を含むさまざまな認知過程、と（20〜80 Hz）と関連付けます。同期γのネットワーク活動はまた、てんかんや統合失調症5,6のような障害の病態に関与しています。例えば、γ振動が皮質てんかん焦点5,7,8の領域に対応すると考えられているとpharmacosensitivityや抵抗、てんかん研究9における調査の二つの重要な領域のマーカーとして使用することができます。
海馬脳スライスは、広くネットワーク活動10-12を調査するために使用されているモデルです。様々なプロトコルは、典型的には、I脳切片におけるγ振動を発生させるために開発されていますこのような低Mg 2+を 、4-アミノピリジン（4AP）、ビククリン、およびカイニン酸12-17としてnvolve薬理学的調節。薬理学的に引き起こさ振動の欠点は、それらが薬物適用後にランダムに発生し、確実に生成されるか、または経時的に安定していないということです。電気的γ振動は、これらの問題の多くを克服し、また時間的にエピソードの記録および分析を可能にする刺激イベントにロックされるという利点を有するトリガー。ここで、プロトコルは、海馬スライスにおける階層oriensにテタヌス刺激を提供することにより、CA1のγ振動を発生させるために記載されています。
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Protocol
マウスの実験はすべてフローリー研究所動物倫理委員会によって承認されました。
脳スライスを切断するための1.セットアップ
- （MM）125コリン-Clで、2.5のKCl、0.4のCaCl 2、6のMgCl 2、1.25のNaH 2 PO 4、26 NaHCO 3で成る切削液を調製し、20 D-グルコースは、カルボゲンガス（95％O 2 -5で飽和します（MM）125のNaCl、2.5のKCl、2 CaCl 2を、2のMgCl 2、1.25のNaH 2 PO 4、26 NaHCO 3で飽和した10 D-グルコースから構成される％のCO 2）と人工脳脊髄液（aCSFの）記録液カーボゲン。冷たいそれを維持するために氷の上に切削液を配置します。
- 切削液の約400 mlで凍結し、氷スラリーを生成するために解凍切断溶液100mlと一緒にブレンドします。小さ なCを通る約0.5リットル/分の流量でカルボゲン（95％O 2 -5％CO 2）とバブルaliberチューブまたは焼結ガラスは、泡の安定したが、穏やかな流れを生成します。
- 脳スライスが配置される上に隆起したナイロンメッシュインサートを備えた250ミリリットルのビーカーを用意します。気泡が直接スライス保持領域を破壊しないようにすること、カルボゲンで約2cmと気泡によってメッシュをカバーするためにaCSFで記入してください。これは、任意にそれらを削除しているので、もし存在する空気の泡が、ナイロンメッシュに存在しないことも重要です。これは、保持チャンバになり、室温に保たれている（20から25°C）。
- はさみの大きなペア、はさみ、小規模および大規模マイクロスパチュラ、鉗子の大小のペアの小さい一対解剖器具を配置し、氷の上にそれらを冷やします。アルミニウム箔の広場に氷上でビブラ組織切断ブロックを配置します。 6センチメートル濾紙、単一のエッジかみそりの刃、同様に切削液のスラリーを充填した25ミリリットルのビーカーの2枚を入手します。
- 氷と第二の容器を充填し、組織PAPのピースを置きますえー、氷上で上にある12 cmの培養皿を置きます。カルボゲンで解氷スラリーと泡を切断すると培養皿を埋めます。これは、脳の解剖を行うこととした容器です。
- ビブラトームを準備します。その後、脱イオン水をその包装から（たびに新鮮なブレードを使用）、新鮮な両刃のカミソリの刃を外し、80％エタノールでスプレー。それは先細りし始める時点で3ミリリットルのプラスチック転送ピペットをカットします。これは、脳スライスを転送するために使用されます。ベンド約45°、1ml注射器に付着することによりベースで27 G針。これは、切断中のスライスを操作するために使用されます。
2.脳スライスを切断
- 2％イソフルランまたは局所的に承認された方法で - マウス（P18 P16）を麻酔。誘導後、はさみの大きなペアで動物を刎ねると泡状の切削液のスラリーが含まれているサイズである12 cmの培養皿に頭をドロップします。スラリーを完全にするために頭を浸す必要があります急速冷却。
- 一方、鼻に向かって前進皮膚および結合組織を剥離して、ヘッドの前面を持ちます。結合組織を切断する小型のはさみを使用して、下にある頭蓋を露出させます。その後、頭蓋骨と首の背側面を覆う筋肉を削除します。
- 最初の大鉗子で頭蓋骨の前面を固定することによって頭蓋骨から脳を削除してから、小さなハサミ（ 図1、A1とA2のラベルカット）を使用して、大後頭孔の骨両側を介して2つの横方向のカットを行います。
- 目の間に別のカット（ブレグマのちょうど前方）（ 図1、カットラベル付けB）を注意深く前方矢状縫合に沿って切断を行い、脳（ 図1、カットラベルされたC）を明らかにカット頭蓋骨のセクションを反映しています。
- 培養皿に脳と場所をかき出すために小さなへらを使用してください。 CRANの点に注意してください。切断する必要がある脳の下面にIAL神経が、これはより小さなサイズのマイクロスパチュラを使用して行うことができます。大きいヘラを使用すると、切削液のスラリーを充填した25ミリリットルのビーカーに脳を転送します。
- スライス用の脳半球の準備。
- その後、新鮮な切削液のスラリー及び泡でいっぱいに新鮮な培養皿の底6センチろ紙の一枚を置きます。濾紙上に、脳、腹側を下に配置するために、より大きなヘラを使用してください。新しく、清掃単一のエッジかみそりの刃を取り、2つの半球に脳を分離するために、中間線に沿ってカットを行い、その後、小脳を除去するために、脳をカット。
- ビブラ組織ブロックを準備します。
- 、チルドビブラトーム組織ブロックを取り、表面を乾燥し、中間にシアノアクリレート接着剤の滴を配置し、脳のおおよその大きさに均一に広がります。のいずれかを操作するために、小さなヘラを使用して大きなマイクロスパチュラ上に脳半球の脳の内側がダウンしているようにします。
- 可能な限り解決策をできるだけ多く除去するために、ろ紙2枚目の脳の界面にへらの端をタッチします。のりにそれを導くために小さいスパチュラを使用して、より大きなへらから脳をスライドさせます。
- 脳が完全に浸漬されることを保証、ビブラトーム室に切断ブロックを確保し、切削液のスラリーや気泡を持つチャンバーを埋めます。脳の腹側がブレードに直面しているように、切断ブロックを回転させます。
- 脳スライス。
注：各ビブラトームので、製造元の指示に従って独特です。- 450ミクロンにスライス厚を設定し、それは約0.3ミリメートル/秒の速度で脳内を移動するようにブレードが振動していることを確認します。皮質表面に腹側から脳を介して完全にカットし、これは、bはでき全脳矢状スライスを生成します電気生理学的記録のために使用される電子。スライスは、内側に横方向に生成されると、典型的には3から4のスライスは、各半球から切断することができます。
- スライスリフトのベースはバックダウン穏やかなプレスにスライスを曲がった27 G針を使用する場合。各スライスを切断するように、彼らは、最大8時間のために実行可能である収容室にプラットフォームの上に移動するには、転送ピペットを使用しています。
3.細胞外電気生理学レコーディング
- 記録チャンバー内のスライスをマウントします。
- 2 ml /分および32℃に加熱 - トランスファーピペットを用いて、aCSFのは1で流れるで灌流沈め記録室に脳スライスを配置します。のMg 2+濃度は4 mMの2ミリモルから増加される。レコーディングに使用するaCSFのは、保持チャンバ内のものとは異なります
- （ - 3 mmの間隔2で張らナイロンストランドを有する半円形のステンレス鋼）「ハープ」でスライスを固定します。場所ハープストランドはCA1に平行に走るようにします。 32℃で10 ml /分 - 8に灌流の速度を上げます。
- CA1（ 図2A）の放線状層の表面上に、解剖顕微鏡下に置く刺激電極と記録電極（ガラス電極は、aCSFの記録液が充填されました）。記録電極を配置し、最初の刺激電極を配置します。
- シェーファーは120と担保刺激- 150μAの振幅と0.1ミリ秒の持続時間の試験パルスとスライス健康（ 図2B）を決定するために、得られたフィールド興奮性シナプス後電位（のfEPSP）の波形を観察します。のfEPSPが小さい繊維ボレーと大きな振幅で記録を取得するために100μmのスライス面から - 刺激と記録電極は、約50スライスに移動する必要があるかもしれません。シャファー側枝はfEPSPsはステレオタイプであり、スライス健康の良い指標を提供誘発しました。 Healthyスライスは、典型的には0.3未満ののfEPSP振幅比に繊維ボレーを示します。
- 電極の再配置。
- 解剖顕微鏡を使用して、階層oriensの真ん中に刺激電極を移動し、 図3Aに示すように、できるだけ記録電極の近くに錐体細胞層に記録電極を移動させます。 120のfEPSP応答振幅ように100ミクロン - - 150μAテストパルスは、約1 mVである。刺激と記録電極は、スライスを約50に押し込むことが必要になることがあり
- γ振動を発生させます。
- γ振動を生成するには、200 Hzで配信さ20×0.1ミリ秒パルスの列で組織を刺激します。 5分ごとに送達された場合、この強縮刺激は、再現性のある反応を得ることができます。
- 次の記録パラメータを使用してください。
- の入力電圧範囲と一致するように出力信号の利得をスケールアナログ·デジタル変換器。予想される最大信号エクスカーションが、入力電圧範囲の30％の最小値を使用していることを確認します。信号がクリップする可能性があります高いようにゲインを設定するときは注意してください。フィールド·レコーディングのために必要な典型的な帯域幅は、ベースラインのドリフトを除去するために0.1 HzのACカップリングと500 Hzです。
- 信号エイリアシングを回避するために、ローパスフィルタのコーナー周波数よりも速く5倍 - 少なくとも4をデジタル化。
- データ分析。
- 5 Hzのハイパスフィルタデータは、任意のベースラインシフトを除去しました。 10ミリ秒の最小イベント分離、ピークと7ミリの回帰間隔、〜100 mVの/秒のしきい値にする典型的なイベント時間、および100％の分離谷で、デリバティブのしきい値を使用してスパイクを識別します。刺激アーチファクトの終了後に発生する最初に同定されたスパイクに要した時間と待ち時間を計算します。この分析は、スパイク、待ち時間、イベント間の時間間隔の数の特徴付けを可能にし、そして持続時間は、のように計算します次のとおりです。
- 各スイープ用発振あたりのスパイクの総数が決定されるスパイクの数を計算します。
- 発振待ち時間を計算します。それぞれの発振に、刺激アーチファクトの終了から最初に同定スパイクの時間を減算します。
- 平均イベント間間隔（ISI）を計算します。複数の検出スパイクと平均との間の時間を決定します。
- 発振期間を計算します。各振動内の最初と最後の検出スパイク間の時間を測定します。
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Representative Results
地層oriensのテタヌス刺激は（35.4±2.2 Hz）で、堅牢で再現性のγ振動を生成し、 図3Bを参照してください。振動はCA3からの入力が屈曲32 G針を用いCA2領域のスライスを切断することによって切断されたCA1ローカルネットワーク内で生成されたことを実証するために。振動が局所的に生成されていることを示し、カットスライスの振動特性は、切断されていないスライス（切断されていないスライス5.89±0.8スパイク、N = 6;±1.1 6.16スライスをカットスパイク、N = 6、P = 0.85）と差がなかったです。
この方法の重要な利点は、記録の安定性です。破傷風は、5分間隔で送達されたときに振動が（15分対30分のスパイクの数についてp = 0.26）は、任意の所与のスライスのために少なくとも30分間安定でした。振動およびその他のパラメータの中のスパイクの総数のスライス間のばらつきがあります。 Dのためのベースライン特性の差は軽微な要因であるように、実験対のラグ研究を行うことができます。イントラスライスの比較のために変動が懸念されることができ、十分な電力供給を比較することによって克服することができます。
次に、これらのtetanically刺激CA1のγ振動の発生のために必要とされるイオンチャネル及び受容体を調べました。 α -アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4- isoxazolepropionic酸（AMPA）の薬理学的遮断は、20μM6-シアノ-7- nitroquinoxaline -2,3-ジオン（CNQX）（ 図4A、B）、GABA受容体に、20μM4-（N-エチル-N-フェニルアミノ）-1,2-ジメチル-6-（メチルアミノ）ピリミジニウムクロリド（ZD7288）（ 図4D）と20μMビククリン（ 図4C）と受容体、I Hの電流及びT型Ca、100μMのNi 2+（ 図4E）2+チャネルは独立して生成されたスパイクの数を減らすことができ、それぞれでした（p <0.05; CNQX N = 6、ビククリン、N = 7; ZD7288はn = 6;のNi 2+はn = 6）。ことを示唆している、（コントロール、8.3±2.2のスパイクであり、n = 5; AP5、5.9±3.1スパイクP = 0.22）（2R） - アミノ-5- phosphonopentanoate（AP5、20μM）の適用は、スパイクの数に影響を及ぼさありませんでしたNMDA受容体は、この準備でγ振動発生に関与していません。
この調製は、薬物のネットワーク規模の行動を決定するための理想的です。レチガビンは、カリウムチャネルを開き、膜興奮18-20を低減し 、臨床的に使用される抗てんかん薬です。レチガビンのバス·アプリケーションが（ 図5）の振動の用量依存性におけるスパイクの数の減少と持続時間を生じました。
図1頭蓋骨の回路図と再カットの位置を示す皮膚の上に位置します脳を子牛。 A1、A2、BおよびCは、脳の除去のために頭蓋骨を開くなされる必要があるカットの位置をマーク。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
CA1シェーファーで刺激と記録電極の配置図2は、テストスライス健康に担保します。 （A）は、刺激電極（スティミュラス）と記録電極（REC）。（B）120μA刺激（*でマークされた繊維ボレー）により誘発されるのfEPSPの代表的な例の配置を表示します。 拡大表示するにはここをクリックしてください。この図のバージョン。
発振を誘発するために使用される記録と刺激電極の図3の構成。（A）CA1の地層錐で階層oriensと記録電極（REC）で刺激電極（スティミュラス）のロケーション（B）の代表例テタヌス刺激により誘導されるγ振動は（アーティファクト「スティミュラス」でマーク）。定量化可能な出力を示す代表的なトレース。 ISIインタースパイク間隔。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
tetanically GENERの図4.薬理学的特性評価atedγ振動。（A）CNQXの効果を示す代表的なトレース。 （B）CNQXの影響を実証するグラフ（20μMと、N = 6）、（C）、ビククリン（20μMであり; n = 7）、（D）、ZD7288（20μMであり; n = 6）および（E）のNi 2+ （100μMであり; n = 6）スパイクの数に。データは、一対比較として表示されます。 * P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ネットワークのプロパティの図5レチガビン効果。制御条件と（B）との誘起振動（A）の減少ネットワーク活動を示す代表的な例<レチガビンと強い>（C）。発振開始、および（G）間のスパイク間隔（ISI）に（D）スパイク数、（E）振動時間、（F）に示す待ち時間の効果のまとめ。データは、一対比較として表示されます。 * P <0.05。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
急性脳スライスにおけるCA1のγ振動を生成するための堅牢な方法が記載されています。生成された振動が制御し、ネットワーク振動12の神経生理学的基礎を理解するためのより良い機会を可能にするローカル回路から生じます。 AMPA受容体、GABA A受容体は、I HとT型Ca 2+チャネルはすべて、このモデルにおけるγ振動のために必要とされます。ここで説明するローカルCA1の振動が確実に発生させることができるが、これは、脳スライスが健康であることを確実にすることに依存しています。重要なステップは、氷冷溶液中で除去した後、急速に浸漬中に脳に浸透しないように注意しながら、頭蓋骨から脳を迅速に除去することです。スライス健康21を維持するために60秒-理想的には頭蓋骨から断頭し、脳の除去との間の時間はない30以上である必要があります。
テタヌス刺激を使用して、ローカルのCA1γ振動はすることができます薬剤に依存せずに、標準的な生理学的記録溶液中で生成されました。これは、薬剤の添加は解釈を混乱することができる疾患モデルにおいて病状を特徴付けるために有利です。例えば、抗てんかん薬には、このモデルローカルCA1活性および感度を使用して、ヒトの遺伝性てんかん22のマウスモデルにおいて増強されました。ネットワーク活動を調査するために、このモデルの使用は、てんかんに限定されるものではなく、容易に、アルツハイマー病、自閉症および統合失調症などの他の疾患にも適用することができます。薬剤がローカルCA1振動十分な組織の酸素を生成する必要はありませんが、脳切片23の代謝要求に起因するものです。高灌流速度は、脳切片24,25のためのより多くの生理学的な環境を作成するスライス内の酸素およびpHバランスを改善します。
generatするテタヌス刺激を使用することのさらなる利点電子ネットワークの振動がエピソード実験計画が反復様式で、例えば、開始、持続時間およびスパイク数の遅延などのネットワークアクティビティパラメータのより容易な定量を可能に用いることができることです。対照的に、化学的に誘発されたネットワーク活動は、自発的13,15,16,26-28及び定量化することがより困難です。テタヌス刺激は、しかし、時間をかけてネットワーク活性の変化を引き起こす可能性のNMDA受容体依存性シナプス可塑性の変化を引き起こす可能性があります。これを制御し、複数の強縮刺激にわたって安定した発振の生成を有効にするには可塑性の変化は、Mg 2+レベルを上昇させることによって制限することができます。このプロトコルは、再現性を向上させるが、それは、NMDA受容体機能の影響に不透明です。
インタフェース記録チャンバーは、スライスの健康を向上させるより小さな刺激アーティファクトの付加的な利点と雑音比、より焦点低い強度の刺激に良好な信号を得ることができます。穴あきchambeRの記録方式は、また、長期の実験のためのスライスの健康を改善するであろう。マイクロ電極アレイ記録室またはパッチクランプ記録を使用することで、より良いγ振動とより広範なネットワーク機能への影響のメカニズムを調べるためにレコーディングの間に測定されるように、広い視野と単一ニューロンの機能を有効にします。電圧およびカルシウムセンサーならびにoptogenetic方法の組み込みは、記録と刺激パラダイムの両方で追加の実験的な柔軟性を導入します。同様のプロトコルが研究中の疾患の病理に、より関連し得る他の脳領域のために開発します。プロトコルのための最終的な使用は、単一ニューロンのパッチクランプおよびイメージング研究とフィールドレコーディングを組み合わせることにより、振動の計算モデルを構築し、テストするためのものであってもよいここで説明します。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288) | Sigma-Aldrich | Z3777 | |
| Biuculline | Sigma-Aldrich | 14340 | |
| 6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX) | Sigma-Aldrich | C127 | |
| Nickel | Sigma-Aldrich | 266965 | |
| Carbamazepine | Sigma-Aldrich | C4024 | |
| (2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV) | Tocris Bioscience | 0105 | |
| Retigabine | ChemPacific | 150812-12-7 | |
| Choline-Cl | Sigma-Aldrich | C1879-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-250G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma-Aldrich | 223506-500G | |
| MgCl2 • 6H2O | Sigma-Aldrich | M2670-500G | |
| Electrode glass | Harvard Apparatus | GC150F-10 | |
| Concentric bipolar stimulating metal electrode | FHC | CBBPF75 | |
| Digital Isolator | Getting Instruments | Model BJN8-9V1 | |
| Model 1800 amplifier | A-M systems | Model 1800 amplifier | |
| Digitizer | National Intruments | NI USB-6211 | |
| Vibrotome | Leica | VT1200s |
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