Summary
Salınımlar temel ağ özellikleri ve hastalık ve ilaçlarla modüle edilir. Beyin dilim salınımlar incelenmesi kontrollü koşullar altında izole ağların karakterizasyonu sağlar. Protokoller CA1 γ salınımları çağrıştıran akut beyin dilimleri hazırlanması için temin edilmiştir.
Abstract
Nöronal ağ salınımları sağlık ve hastalık beyin aktivitesinin önemli özellikleri ve klinik olarak kullanılan ilaçların bir dizi tarafından modüle edilebilir. (- 80 ila 20 Hz), bir protokol CA1 γ salınımları çalışmak için bir model oluşturmak için temin edilmiştir. Bu γ salınımlar en az 30 dakika boyunca stabil olan ve kalp pili akımlarının aktivasyonu ek olarak, uyarıcı ve inhibitör sinaptik etkinliği bağlıdır. Tetanically uyarılmış salınımlar ağ durumuna rapor başak sayısı, salınım süresi, gecikme ve frekans da dahil olmak üzere tekrarlanabilir ve kolayca ölçülebilir özellikleri bir dizi var. elektriksel uyarılan salınımlar avantajları ağ fonksiyonu sağlam karakterizasyonu sağlayan istikrarı, tekrarlanabilirlik ve epizodik edinimini içerir. CA1 γ salınımları Bu model hücresel mekanizmaları incelemek ve sistematik hastalığı ve uyuşturucu değişmiş nasıl nöronal ağ etkinliği araştırmak için kullanılabilir.Hastalık devlet farmakoloji kolaylıkla özellikle hastalık mekanizmalarını hedef ilaçların seçimi etkinleştirmek için genetik olarak modifiye edilmiş veya girişimsel hayvan modellerinde beyin dilimleri kullanılarak dahil edilebilir.
Introduction
Beyin ağ salınımlar davranışsal devletlere ilişkili farklı frekans bantlarında içinde meydana gelir. Kemirgenlerde, hipokampal θ salınımlar (5-10 Hz), keşfedici davranışlar 1,2 sırasında gözlenen γ salınımlar yaparken - algı ve dikkat 3,4 dahil olmak üzere çeşitli bilişsel süreçler, (20 80 Hz) ortak. Senkron γ ağ etkinlik, aynı zamanda, epilepsi ve şizofreni 5,6 gibi bozuklukların patolojisinde rol oynar. Örneğin, γ salınımlar kortikal epileptik odağın 5,7,8 alanlarına karşılık düşünülmektedir ve pharmacosensitivity veya direnç, epilepsi araştırma 9 soruşturmanın iki önemli alanlar belirteç olarak kullanılabilir.
hipokampal beyin dilim yaygın ağ etkinliğini 10-12 araştırmak için kullanılan bir modeldir. Çeşitli protokoller, tipik olarak beyin dilimleri γ osilasyonları üretmek için geliştirilmiştir ibu tür düşük Mg + 2, 4-aminopiridin (4AP), bicuculline ve kainik asit 12-17 olarak nvolve farmakolojik modülasyonu. Farmakolojik tetiklenen salınımların eksiklikleri uyuşturucu uygulamasından sonra rasgele ve güvenilir üretilen veya zamanla stabil olmadığını vardır. Elektrikle γ salınımlar bu sorunların çoğunun üstesinden de geçici epizodik kayıt ve analiz için izin uyarıcı etkinliğe kilitli avantajı var tetikledi. İşte bir protokol hipokampal dilim stratum Oriens bir tetanik stimülasyon sunarak CA1 γ salınımlarını üretilmesi için tarif edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler üzerinde tüm deneyler Florey Enstitüsü hayvan etik kurul tarafından onaylandı.
Beyin Dilimler Kesme 1. Kur
- (MM) 125 Kolin-Cl, 2.5 KCI, 0.4 CaCl2, 6 MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 oluşan bir kesim çözüm hazırlayın, 20 D-glikoz karbojen gaz (% 95 O 2 -5 ile doyurulmuş (mM olarak) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 oluşan% CO2) ve yapay serebrospinal akışkan (CSF) kayıt çözeltisi, 10 D-glikoz, doyurulmuş karbojen. Soğuk tutmak için buz üzerinde kesme çözümü yerleştirin.
- Kesme çözeltisi yaklaşık 400 ml Freeze ve bir buz bulamaç oluşturmak için donmamış kesme çözeltisi, 100 ml ile karıştırılır. Karbojen Kabarcık (% 95 O2 -5% CO2), küçük c ile yaklaşık olarak 0.5 L / dakikalık bir akıştaaliber boru ya da sinterlenmiş cam kabarcık sürekli ama nazik bir akış üretir.
- Beyin dilimleri yerleştirileceği yükseltilmiş bir naylon ağ parçası ile 250 ml'lik bir beher hazırlayın. Kabarcıklar doğrudan dilim tutarak alanı bozmaya olmadığını sağlanması, karbojen ile yaklaşık 2 cm örgü ve kabarcık kapak aCSF ile doldurun. Orada naylon mesh hiçbir hava kabarcıkları vardır, bu nedenle herhangi varsa bunları kaldırmak da önemlidir. Bu tutma bölmesi olacak ve oda sıcaklığında tutulur (20-25 ° C).
- Makas büyük bir çifti, makas, küçük ve büyük mikro spatula ve forseps büyük ve küçük çift küçük bir çift de dahil olmak üzere diseksiyon aletleri düzeni ve buz üzerinde onları soğuk. Alüminyum folyo meydanında buz üzerinde vibratome doku kesme blok yerleştirin. 6 cm filtre kağıdı, bir tek kenar jilet ve hem de kesilmiş çözeltisi harç ile doldurulmuş bir 25 ml beher 2 adet elde edilir.
- Buz ile ikinci bir kap doldurun ve doku PAP bir parça koymaker ve buz üzerinde üstüne bir 12 cm kültür çanak yerleştirin. Karbojen ile çözüm buz bulamacı ve kabarcık kesme kültür çanak doldurun. Bu beyin diseksiyonu yapılmalıdır ile hangi kapsayıcıdır.
- Vibratome hazırlayın. Taze çift kenarlı jilet çıkarmak ambalajından (taze bıçak her zaman kullanın) ve% 80 etanol daha sonra deiyonize su ile sprey. Bu koniklik başladığı noktada bir 3 ml'lik plastik transfer pipet kesin. Bu beyin dilimleri aktarmak için kullanılır. Bend yaklaşık 45 ° ve 1 ml şırınga takmak tarafından üssünde 27 G iğne. Bu kesim sırasında dilimleri işlemek için kullanılır.
2. Beyin Dilimler Kesme
- % 2 izofluran veya yerel onaylı yöntemle - Fare (P18 P16) anestezisi. Indüksiyon sonrasında, makas büyük bir çifti ile hayvan başını kesmek ve kabarmış kesme çözüm bulamaç içeren 12 cm kültür çanak içine kafasını bırakın. Bulamaç tamamen için başını sokmak gerekirhızlı soğutma.
- Bir yandan cildi ileri burnuna doğru bağ dokusu soyulması ile baş önünü tutun. Bağ dokusu kesilmiş küçük makas kullanarak altta yatan kafatası ortaya çıkarmak için. Sonra kafatası ve boyun dorsal yönünü örten kasları kaldırın.
- İlk büyük forseps ile kafatası ön güvence altına alarak kafatası beyin çıkarın ve ardından küçük bir makas (Şekil 1, A1 ve A2 etiketli kesimler) kullanarak foramen magnum kemik iki tarafında aracılığıyla iki yan keser.
- Gözler arasında başka bir kesim (bregma sadece ön) (Şekil 1, kesme etiketli B) daha sonra dikkatlice öne sagital sütür boyunca kesilir olun ve beyin (Şekil 1, kesme etiketli C) ortaya çıkarmak için kesilmiş kafatası bölümleri yansıtır.
- Bir kültür çanak üzerine beyin ve yerde kepçe küçük bir spatula kullanın. Karter farkında olunihtiyacınız olacak beynin alt yönü üzerinde ial sinirler bu küçük boyutlu mikro spatula kullanılarak yapılabilir, kesilmiş olması. Kullanımı daha büyük spatula kesim çözüm bulamaç ile dolu 25 ml'lik behere beyin aktarın.
- Dilimleme beyin yarımkürede hazırlanıyor.
- Sonra taze kesme çözüm bulamaç ve kabarcık ile doldurmak bir taze kültür çanak alt 6 cm filtre kağıdı bir parçası yerleştirin. Filtre kağıdı üzerine aşağı beyin, ventral tarafı konumlandırmak için büyük spatula kullanın. Yeni ve temizlenmiş tek kenar jilet alın ve daha sonra, beyincik kaldırmak orta hat boyunca bir kesim iki hemisfer içine beyin ayırmak için yapmak beyin kesti.
- Vibratome doku bloğu hazırlanması.
- , Soğutulmuş vibratome doku bloğu alın yüzeyi kurumaya, ve ortada siyanoakrilat yapıştırıcı bir damla koyun ve beynin yaklaşık boyutuna yayılır. Birini işlemek için küçük bir spatula kullanınBüyük mikro spatula üzerine beyin hemisfer beynin medial tarafı aşağı böylece.
- Mümkün olduğunca çözümün kadar çıkarmak için filtre kağıdının ikinci parçası üzerinde beyin arayüzünde spatula kenarına dokunun. Tutkal üzerine rehberlik küçük spatula ile büyük spatula kapalı beyin kaydırın.
- Beyin tamamen batırılır sağlanması, vibratome odasına kesme blok Güvenli ve kesim çözüm bulamaç ve kabarcık ile odasını doldurun. Beynin ventral yüzü bıçak bakacak şekilde kesme bloğu döndürün.
- Beyin dilimleme.
Not: Her vibratome yüzden üreticinin talimatlarına uyun benzersizdir.- 450 mikron dilim kalınlığı ayarlayın ve yaklaşık 0.3 mm / s hızında beyin üzerinden hareket ederken bıçak titreşimli emin olun. Kortikal yüzeye ventral taraftan beyin ile tamamen kesti, bu olabilir b tüm beyin sagittal dilimleri üretecekelektrofizyolojik kayıtlar için kullanılan e. Dilimler mediale yanal olarak imal edilecek ve tipik 3-4 dilim her yarımkürede kesilebilir.
- Dilim asansörlerin baz dilim geri aşağı yumuşak basına bükülmüş 27 G iğne kullanın. Her dilim kesilir, onlar kadar 8 saat yaşayabilir tutma odasındaki platforma taşımak için transfer pipet kullanın.
3. Ekstraselüler Elektrofizyoloji Kayıtlar
- Kayıt odasına dilim montajı.
- 2 ml / dak ve 32 ° C'ye kadar ısıtıldı - transfer pipeti kullanarak, CSF 1 akan ile perfüze dalgıç bir kayıt odasına bir beyin dilim yerleştirin. kayıtları için kullanılan CSF Mg2 + konsantrasyonu, 4 mM ila 2 mM ila arttıkça tutma odası içinde farklıdır.
- (- 3 mm aralıklı 2 de yayılmış naylon ipliklerini yarı dairesel paslanmaz çelik), bir "harp" ile dilim sabitleyin. YerArp ipliklerini CA1 paralel böylece. 32 ° C'de 10 ml / dak - 8 perfüzyon hızını artırın.
- Bir mikroskop yer, bir uyarıcı elektrot ve CA1 (Şekil 2A) 'in stratum radiatumunun yüzeyi üzerinde bir kayıt elektrotu (ACSF kayıt solüsyonu ile doldurulmuş, cam elektrot) altında. Kayıt elektrot yerleştirmek sonra ilk uyarıcı elektrot yerleştirin.
- Schaffer 120 ile teminatların teşvik - 150 uA genliği ve 0.1 msn süre test darbesi ve dilim sağlığı (Şekil 2B) belirlemek için ortaya çıkan alan, uyarıcı sonrası sinaptik potansiyel (fEPSP) dalga formunu gözlemleyin. dilim yüzeyinden 100 mikron bir fEPSP küçük lif voleybolu ve büyük genlikli ile kayıt almak için - uyarıcı ve kayıt elektrotları yaklaşık 50 dilim taşındı gerekebilir. Schaffer teminat fEPSPs basmakalıp ve dilim sağlığı iyi bir gösterge sağlamak uyarılmış. Healthy dilimler tipik olarak en az 0.3 amplitüd oranı fEPSP için bir fiber voleyle göstermektedir.
- Elektrotlar Repozisyonlama.
- Bir disseksiyon mikroskobu kullanılarak, startum Oriens'in ortasına uyarıcı elektrot taşıma ve Şekil 3A'da gösterildiği gibi, mümkün olduğu kadar kayıt elektrot yakın olarak piramidal hücre tabakası kayıt elektrot hareket ettirin. 150 uA testi darbesi yaklaşık olarak 1 mV - 120 fEPSP yanıt genliği, böylece 100 um - uyarıcı ve kayıt elektrotları yaklaşık dilim içine 50 itti gerekebilir.
- Γ titreşimleri oluşturuluyor.
- Γ titreşimler 200 Hz teslim 20 x 0.1 msn bakliyat bir tren ile doku teşvik oluşturmak için. Her 5 dakikada teslim Bu tetanik uyaran tekrarlanabilir yanıtları verebilir.
- Aşağıdaki kayıt parametrelerini kullanın.
- Giriş gerilimi aralığı maç çıkış sinyalinin kazancını Scaledijital dönüştürücü analog. Maksimum beklenen sinyal gezi giriş gerilim aralığı% 30 az kullandığından emin olun. Sinyaller klip olabilir yüksek olarak kazançları ayarlarken dikkatli olun. alan kayıtları için gerekli tipik bant genişliği temel sürüklenme çıkarmak için 0.1 Hz AC bağlantı ile 500 Hz olduğunu.
- Sinyal yumuşatma önlemek için düşük geçiş filtresi köşe frekansı 5 kat daha hızlı - en az 4 Digitize.
- Veri analizi.
- 5 Hz yüksek geçiren filtre verileri herhangi bir temel vardiya kaldırmak için. 10 ms arasında en az bir olay ayrımı, zirve ve 7 ms regresyon aralığı, ~ 100 mV / ms bir eşik tipik bir etkinlik süresi ve% 100 arasında bir ayırma vadi ile, bir türevi eşik kullanılarak ani belirlenmesi. İlk tespit başak için geçen zaman stimülasyon dışlayıcı bitiminden sonra oluşmaya olarak gecikme hesaplayın. Bu analiz, sivri, gecikme arası etkinlik aralığının sayıda karakterizasyonu için izin verir ve süresi hesaplanıraşağıdaki gibidir:
- Her süpürme için salınım başına başak sayısı belirlenir olarak sivri sayısını hesaplayın.
- Salınım gecikme hesaplayın. Her salınım için, stimülasyon dışlayıcı sonundan itibaren ilk tespit başak zamanı çıkarma.
- Ortalama arası Olay aralığını (ISI) hesaplayın. Birden tespit sivri ve ortalama arasındaki süreyi belirleyin.
- Salınım süresini hesaplayın. Her salınım içinde ilk ve son tespit edilen başak arasındaki süreyi ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stratum Oriens'in tetanik stimülasyon sağlam ve tekrarlanabilir γ salınımlar (35.4 ± 2.2 Hz) ürettiğini, Şekil 3B bakın. Salınımlar CA3 gelen girdiler bükük 32 G iğne kullanılarak CA2 bölgede dilim keserek kesildi yerel CA1 ağı içinde üretilen olduğunu göstermek için. salınımlar yerel olarak oluşturulan belirten, (kesilmemiş dilim 5.89 ± 0.8 sivri, n = 6;; kesme dilimleri 6.16 ± 1.1 ani n = 6 p = 0.85) kesim dilimleri salınım özelliklerinin kesilmemiş dilim farklı değildi.
Bu yöntemin önemli bir avantajı, kayıt stabilitesidir. Tetanoz, 5 dakikalık aralıklarla verilen zaman salınımlar (15 dakika vs 30 dk başak sayısı p = 0.26), herhangi bir dilim için en az 30 dakika boyunca stabil idi. Bir salınım ve diğer parametreler dahilinde sivri toplam sayısı dilimleri arasında farklılıklar vardır. Dbazal özellikleri farklılıklar önemsiz faktörler böylece deneyler eşleştirilmiş halı çalışmaları yapılabilir. Içi dilim karşılaştırmaları değişkenlik için endişe olabilir ve yeterince güç verme karşılaştırmalar aşılabilir.
Daha sonra, bu tetanically uyarılmış CA1 γ salınımlarının üretimi için gerekli olan, iyon kanalları ve reseptörleriyle incelenmiştir. Α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) farmakolojik blokajı 20 uM 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX) (Şekil 4a, b), GABA ile reseptörleri 20 uM bicuculline (Şekil 4C) olan bir reseptör, İH akımı 20 uM 4- (N-etil-N-fenilamino) -1,2-dimetil-6- (metilamino) pyrimidinium klorür (ZD7288) (Şekil 4D), ve T-tipi Ca 100 uM Ni2 + (Şekil 4E) ile 2 + kanal bağımsız bir şekilde oluşturulan sivri sayısını azaltan her vardı(P <0.05; CNKX n = 6; bicuculline n = 7; ZD7288, n = 6; Ni2 + n = 6). Düşündüren (kontrol, 8.3 ± 2.2 sivri n = 5;, AP5, 5.9 ± 3.1 sivri p = 0.22) (2R) -amino-5-phosphonopentanoate (AP5, 20 uM) uygulanması sivri sayısını etkilemedi NMDA reseptörleri, bu terkipte γ osilasyon üretimi dahil değildir.
Bu hazırlık ilaçların ağ ölçeği eylemini belirlemek için idealdir. Retigabin potasyum kanallarını açar ve membran uyarılabilirliğini 18-20 azaltan bir klinik kullanılan anti-epileptik ilaçtır. Retigabinin Banyo, (Şekil 5) salınım doza bağımlı bir sivri sayısının azaltılmasını ve süresini üretti.
Şekil 1. Kafatasının şematik ve yeniden kesim yerini gösteren cilt örten beyin Dana. A1, A2, B ve C beynin çıkarılması için kafatasını açmak için yapılması gereken kesim yerleri işaretleyin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
CA1 Schaffer içinde uyarıcı ve kayıt elektrotları Şekil 2. Yerleştirme testi dilim sağlığına teminatların. (A) uyarıcı elektrot (Stim) ve kayıt elektrot (Rec). (B) 120 uA stimülasyonu (* ile işaretlenmiş lif voleybolu) tarafından uyarılmış bir fEPSP temsili bir örneği yerleşimini gösterir. Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.
Salınımı uyandırmak için kullanılan kayıt ve stimülasyon elektrotları Şekil 3. Yapılandırma. (A) CA1 stratum pyramidale stratum oriens ve kayıt elektrot (Rec) 'de uyarıcı elektrot (Stim) yeri. (B) tipik bir örneği tetanik stimülasyon tarafından uyarılan γ salınımlar (artifact "Stim" ile işaretlenir). Ölçülebilir çıktıları gösteren Temsilcisi iz. ISI arası başak aralığı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tetanically gener Şekil 4. farmakolojik karakterizasyonubir- γ salınımlar. (A) CNQX etkisini gösteren Temsilcisi iz. (B) CNQX etkisini gösteren grafikleri (20 uM, n = 6), (C), bicuculline (20 uM, n = 7), (D), ZD7288 (20 uM, n = 6) ve (E) Ni 2+ (100 uM, n = 6) sivri sayısı. Veriler eşleştirilmiş karşılaştırmalar olarak sunulmuştur. * P <0.05, ** p <0.01 ve *** p <0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ağ özelliklerine Şekil 5. Retigabin etkileri. Kontrol koşulları ve (B) ve uyarılmış salınımlar (A) azaltılmış ağ etkinliği gösteren temsili örnekler <retigabinle ile strong> (C). Salınım başlangıcı ve (G) arası başak aralığı (ISI) ile (D) başak sayısı, (E) salınım süresi, (F) gecikme gösterilen etkilerin özeti. Veriler eşleştirilmiş karşılaştırmalar olarak sunulmuştur. * P <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akut beyin dilimleri CA1 γ salınımları oluşturmak için sağlam bir yöntem tarif edilmektedir. oluşturulan titreşimler, kontrol ve ağ salınımlarının 12 nörofizyolojik temelini anlamak için daha iyi bir fırsat sağlayan bir yerel devresinden kaynaklanmaktadır. AMPA reseptörleri, GABA A reseptörleri, I, H ve T-tipi Ca2 + kanallarının bu modelde γ salınımlar için gereklidir. Burada açıklanan yerel CA1 salınımları sağlam oluşturulabilir iken bu beyin dilimleri sağlıklı olmasının sağlanması bağlıdır. Bir kritik bir adım buz gibi soğuk çözelti içinde çıkarılması ve daha sonra hızlı daldırma sırasında beyin nüfuz özen kafatası beyin hızla çıkarılması olduğunu. Dilim sağlığını korumak için 21 60 sn - İdeal Dekapitasyon ve kafatası beyin çıkarılması arasındaki süre en fazla 30 olmalıdır.
Tetanik stimülasyon kullanarak yerel CA1 γ salınımlar olabilirfarmakolojik ajanlar dayanarak olmadan standart fizyolojik kayıt çözümleri üretti. Bu farmakolojik ajanların eklenmesi yorumlanmasına neden olabilecek hastalık modellerinde patolojilerin karakterize etmek için yararlıdır. Örneğin, anti-epileptik ilaç, bu model, lokal CA1 aktivitesi ve duyarlılığı kullanılarak insan genetik epilepsi 22 bir fare modelinde geliştirilmiştir. ağ etkinliğini araştırmak için bu modelin kullanımı, epilepsi ile sınırlı değildir ve kolayca Alzheimer hastalığı, otizm ve şizofreni gibi diğer hastalıklar da uygulanabilir. Farmakolojik ajanlar nedeniyle beyin dilim 23 metabolik talebe yeterli doku oksijenasyonu, yerel CA1 salınımları üretmek için gerekli olmasa da. Yüksek perfüzyon oranları beyin dilimleri 24,25 için daha fizyolojik ortam yaratmak dilim içinde oksijen ve pH dengesini iyileştirmek.
Generat için tetanik uyarımı kullanmanın bir başka avantajı,e ağ salınımları epizodik deneysel tasarım tekrarlanabilir bir şekilde, böyle bir başlangıcı, süresi ve başak numaralarına gecikme gibi ağ aktivite parametreleri, daha hazır kantitatif sağlayan kullanılabilir olmasıdır. Bunun tersine kimyasal olarak indüklenen ağ etkinliği kendiliğinden 13,15,16,26-28 ve ölçmek için daha zordur. Tetanik stimülasyon, ancak zamanla ağ aktivitesinde değişikliklere neden olabilir NMDA reseptör bağımlı sinaptik plastisite değişikliklere neden olabilir. Bunun için kontrol ve çoklu tetanik uyaranlar plastisite değişiklikler üzerinde kararlı salınım nesil etkinleştirmek için Mg 2 + seviyesini yükseltmektir sınırlı olabilir. Bu protokol, tekrarlanmasını arttırır, ancak, NMDA reseptör fonksiyonunun herhangi bir etkisi opaktır.
Arayüz kayıt odaları, dilim sağlığını iyileştirmek küçük uyarım eserler yararı ile gürültü oranları ve daha odak alt yoğunluk uyarısına iyi sinyal verebilir. Delikli chamber kayıt yöntemleri de uzun vadeli deneyler için dilim sağlığını geliştirmek olacaktır. Mikro elektrot dizisi kayıt odaları veya yama kelepçe kayıt kullanılması daha iyi γ salınımlar ve geniş ağ fonksiyonu üzerindeki etkilerini altında yatan mekanizmaları araştırmak için kayıtlar sırasında ölçülecek geniş alan ve tek nöron fonksiyonu sağlar. Gerilim ve kalsiyum sensörler Ortaklığın yanı sıra optogenetic yöntemler hem kayıt ve uyarıcı paradigmalar ek deneysel esneklik getirecek. Benzer protokolleri çalışılan hastalık patoloji daha alakalı olabilecek diğer beyin bölgeleri için geliştirilmiş. Protokol için bir nihai kullanım bina ve tek nöron yama kelepçe ve görüntüleme çalışmaları ile saha kayıtları birleştirerek salınımlarının hesaplama modellerini test etmek için olabilir burada açıklamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288) | Sigma-Aldrich | Z3777 | |
| Biuculline | Sigma-Aldrich | 14340 | |
| 6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX) | Sigma-Aldrich | C127 | |
| Nickel | Sigma-Aldrich | 266965 | |
| Carbamazepine | Sigma-Aldrich | C4024 | |
| (2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV) | Tocris Bioscience | 0105 | |
| Retigabine | ChemPacific | 150812-12-7 | |
| Choline-Cl | Sigma-Aldrich | C1879-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-250G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma-Aldrich | 223506-500G | |
| MgCl2 • 6H2O | Sigma-Aldrich | M2670-500G | |
| Electrode glass | Harvard Apparatus | GC150F-10 | |
| Concentric bipolar stimulating metal electrode | FHC | CBBPF75 | |
| Digital Isolator | Getting Instruments | Model BJN8-9V1 | |
| Model 1800 amplifier | A-M systems | Model 1800 amplifier | |
| Digitizer | National Intruments | NI USB-6211 | |
| Vibrotome | Leica | VT1200s |
References
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 26 (4), 407-418 (1969).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 45-56 (2007).
- Buzsáki, G., Wang, X. -J.
- Kobayashi, K., et al. Cortical contribution to scalp EEG gamma rhythms associated with epileptic spasms. Brain Dev. 35 (8), 762-770 (2013).
- Andreou, C., et al. Increased Resting-State Gamma-Band Connectivity in First-Episode Schizophrenia. Schizophr Bull. , (2014).
- Alarcon, G., Binnie, C. D., Elwes, R. D., Polkey, C. E. Power spectrum and intracranial EEG patterns at seizure onset in partial epilepsy. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 94 (5), 326-337 (1995).
- Fisher, R. S., Webber, W. R., Lesser, R. P., Arroyo, S., Uematsu, S. High-frequency EEG activity at the start of seizures. J. Clin. Neurophysiol. 9 (3), 441-448 (1992).
- Kwan, P., Brodie, M. J.
- Traub, R. D., Kopell, N., Bibbig, A., Buhl, E. H., LeBeau, F. E., Whittington, M. A. Gap junctions between interneuron dendrites can enhance synchrony of gamma oscillations in distributed networks. J. Neurosci. 21 (23), 9478-9486 (2001).
- Traub, R. D., Whittington, M. A., Buhl, E. H., Jefferys, J. G., Faulkner, H. J. On the mechanism of the gamma --> beta frequency shift in neuronal oscillations induced in rat hippocampal slices by tetanic stimulation. J. Neurosci. 19 (3), 1088-1105 (1999).
- Whittington, M. A., Stanford, I. M., Colling, S. B., Jefferys, J. G., Traub, R. D. Spatiotemporal patterns of gamma frequency oscillations tetanically induced in the rat hippocampal slice. J. Physiol. 502 (3), 591-607 (1997).
- Avoli, M., Panuccio, G., Herrington, R., D’Antuono, M., de Guzman, P., Lévesque, M. Two different interictal spike patterns anticipate ictal activity in vitro. Neurobiol. Dis. 52, 168-176 (2013).
- Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions. Cereb Cortex. 24 (1), 162-173 (2014).
- Gloveli, T., Albrecht, D., Heinemann, U. Properties of low Mg2+ induced epileptiform activity in rat hippocampal and entorhinal cortex slices during adolescence. Brain Res. Dev. Brain Res. 87 (2), 145-152 (1995).
- McLeod, F., Ganley, R., Williams, L., Selfridge, J., Bird, A., Cobb, S. R. Reduced seizure threshold and altered network oscillatory properties in a mouse model of Rett syndrome. Neuroscience. 231, 195-205 (2013).
- Bracci, E., Vreugdenhil, M., Hack, S. P., Jefferys, J. G. On the synchronizing mechanisms of tetanically induced hippocampal oscillations. J. Neurosci. 19 (18), 8104-8113 (1999).
- Main, M. J., Cryan, J. E., Dupere, J. R., Cox, B., Clare, J. J., Burbidge, S. A. Modulation of KCNQ2/3 potassium channels by the novel anticonvulsant retigabine. Mol. Pharmacol. 58 (2), 253-262 (2000).
- Wickenden, A. D., Yu, W., Zou, A., Jegla, T., Wagoner, P. K. Retigabine, a novel anti-convulsant, enhances activation of KCNQ2/Q3 potassium channels. Mol. Pharmacol. 58 (3), 591-600 (2000).
- Otto, J. F., Kimball, M. M., Wilcox, K. S. Effects of the anticonvulsant retigabine on cultured cortical neurons: changes in electroresponsive properties and synaptic transmission. Mol. Pharmacol. 61 (4), 921-927 (2002).
- Pomper, J. K., Graulich, J., Kovacs, R., Hoffmann, U., Gabriel, S., Heinemann, U. High oxygen tension leads to acute cell death in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. Dev. Brain Res. 126 (1), 109-116 (2001).
- Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. Enhanced in vitro CA1 network activity in a sodium channel β1(C121W) subunit model of genetic epilepsy. Epilepsia. 55 (4), 601-608 (2014).
- Lord, L. -D., Expert, P., Huckins, J. F., Turkheimer, F. E. Cerebral energy metabolism and the brain/'s functional network architecture: an integrative review. J. Cereb. Blood Flow Metab. 33 (9), 1347-1354 (2013).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur. J. Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. J. Neurosci. Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions. Cereb Cortex. 24 (1), 163-173 (2012).
- Antuono, M., Köhling, R., Ricalzone, S., Gotman, J., Biagini, G., Avoli, M. Antiepileptic drugs abolish ictal but not interictal epileptiform discharges in vitro. Epilepsia. 51 (3), 423-431 (2010).
- Stenkamp, K., et al. Enhanced temporal stability of cholinergic hippocampal gamma oscillations following respiratory alkalosis in vitro. J. Neurophysiol. 85 (5), 2063-2069 (2001).
