Summary
Resistens riktade läkemedel är utbrett och behovet av att identifiera resistensmekanismer - före eller efter kliniska utbrott - är avgörande för att styra alternativa kliniska förvaltningsstrategier. Här presenterar vi ett protokoll för att koppla härledning av läkemedelsresistenta linjer in vitro med sekvensering för att påskynda upptäckten av dessa mekanismer.
Introduction
Detaljerad molekylär karakterisering av tumörgenom från robust teknik sekvense och förbättrad uppgifter analysverktyg har lett till upptäckten av viktiga genetiska förändringar i specifika cancertyper 1,2. Utveckling av riktade behandlingar som syftar till dessa genetiska skador, såsom HER2, BCR-ABL, EGFR och ALK, har avsevärt förbättrat livskvaliteten för patienter 1,2. Trots den särskilda karaktären hos denna metod har det kliniska svaret på de flesta ensamstående terapier varit suboptimal som motstånd i slutändan framträder. Nyligen har betydande framsteg gjorts när det gäller att förstå de molekylära grunderna för resistens mot målsökande behandling. Intressant blir det uppenbart att en framstående resistensmekanismen involverar ihållande mål / väg-aktivitet. Som ett typexempel, androgenreceptorn (AR) -directed enzalutamide behandling av prostatacancer leder till anrikning av aktiverande mutationer i AR själva, upprätthålla AR-signalering output i närvaro av den 3-5-inhibitorn. Denna kunskap har lett till en aggressiv kampanj för att 1) utveckla tredje generationens antagonister som kan fortsätta att undertrycka både WT och mutant-AR-funktionen i enzalutamide resistenta PCa 3 och 2) identifiera potentiella nedströmsnoder för AR signalering som kan riktas för terapeutisk intervention . Likaså resistens mot andra klasser av inhibitorer, såsom de som targeting EGFR, BRAF och ABL leder ofta till mutationer som återaktivera den ursprungliga beroendeframkallande kinasvägen 1.
Med vetskapen om att motståndet framträder oundvikligen i de flesta patienter, utveckla strategier för att snabbt föra dessa mekanismer i ljuset kommer att möjliggöra utvecklingen av effektiva uppföljnings terapier. En strategi som i stor utsträckning används för att analysera genomik av kliniska eldfasta tumörer i förhållande till behandlingsnaiva eller -känsliga tumörer att identifiera anrikningar / uttömning i genetiska skador som kan vara mottagliga för dmatta upptäckt. Trots sitt löfte, det finns två stora skulder detta synsätt som försvårar snabb upptäckt. För det första kan få snabb tillgång till tumörmaterial för genomisk förhör fungera som ett betydande hinder på vägen från terapi för att bota. För det andra kan deconvolution av den myriad av genetiska skador i den resistenta inställningen vara utmanande eftersom tumörer kan presentera betydande intratumoral heterogenitet 6,7.
Mot bakgrund av dessa utmaningar har man ökat beroende av preklinisk upptäckten av resistensmekanismer. Detta tillvägagångssätt kan möjliggöra identifiering av framstående resistensmekanismer innan de kliniska prövningarna 1 som kan vägleda alternativa strategier klinisk förvaltning hos de patienter som bär dessa mekanismer antingen före behandling eller till följd av uppkomsten av resistens.
Ett sådant preklinisk upptäckt verktyg som i stor utsträckning används är att tillämpa objektiva funktionella RNAi skärmar. För examenpel, Whittaker och kollegor tillämpade en genomet skala RNAi skärmen för att identifiera att NF1 förlust förmedlar resistens mot RAF och MEK-inhibitorer via en varaktig MAPK vägsaktivering 8. Dessa fynd visade sig vara kliniskt relevant eftersom förlust-of-funktion mutationer i NF1 observerades i BRAF -mutant tumörceller som i sig är resistenta mot RAF inhibition och i melanomtumörer resistenta mot vemurafenib aktivering 8. Trots framgången med detta tillvägagångssätt, många kliniskt relevanta mål ofta inte identifieras, förmodligen på grund av förlust av funktions partiskhet av denna strategi.
I motsats till en mindre partisk verktyg för preklinisk upptäckten av resistensmekanismer innebär generering av resistenta cellinjer genom långvarig exponering för föreningen av intresse i kombination med NGS-baserade iska eller transcriptomic profilering. Denna strategi har genomförts framgångsrikt av flera grupper för att identifiera spontanaåterkommande enstaka nukleotid varianter eller uttrycks förändringar som gör motstånd 5,9,10. Till exempel var ett återkommande F876L mutation i AR nyligen upptäckt i resistenta kloner in vitro 3-5 och i xenograft-tumörer in vivo 5 före identifiering av denna mutation i kliniken 4. Helt nyligen, Bhang och kollegor (2015) 11 som används ClonTracer två kliniskt relevanta modeller för att visa att majoriteten av resistenta kloner som uppstår under långvarig drog exponering var en del av en befintlig subpopulation antyder att de flesta funktionellt relevanta mutationer är sannolikt redan befintlig som blivit vald för under val 11.
I motsats till den genomiska profilering av tumörer som diskuterats tidigare, detta tillvägagångssätt nytta av mindre heterogenitet som "homogena" resistenta kloner används för analys underlättar mer exakt genetisk dissektion av potentiella förare. Furthermmalm, spännande, förutom möjligheten att upptäcka resistensmekanismer, denna metod kan också användas för att identifiera de cellulära verkningsmekanismer och mål för bioaktiva små molekyler som denna information är okänd 10. Med tanke på de tydliga fördelar och flera användningsområden för denna strategi, här presenterar vi ett protokoll med uppgifter framgångsrikt genomförande av en sådan preklinisk skärm för att maximera potentialen för kliniskt betydelsefulla upptäckter.
Protocol
1. Bedöma GI 50 för Förening (s) of Interest
- Generera tillväxtkurva (s) för cellinjer av intresse för att bedöma lämplig sådd densitet. Täppa antalet celler vid olika tidpunkter efter sådd (dag 2, 4, 6 och 8) i förhållande till dag 0. Detta kommer att ge en relativ tillväxt av cellinjen av intresse och bör användas för att bedöma den inledande såddtäthet så att konfluens inte uppnås i 96-brunnsplattor inom 7 dagar.
- När tillväxtkurvor har fastställts att utsäde lämpligt antal celler i icke-transparenta, tydliga bottnade 96-brunnsplattor i 100 pl cellmedie bedöma GI 50. Seed antalet celler baserat på cellinjen som används och bestäms i 1,1. Typiskt, utsäde 3x10 3 celler för snabbväxande cellinjer med en fördubbling tid på ~ 24 timmar, HCT116 t.ex..,.
- Förbered en analysplatta (dag-1). För analysplattan, utsädes celler vid önskad densitet i 100 pl odlingsmedium in brunnar skuggade i blått (Figur 1). Wells markeras med vitt innehåller endast media.
- Förbered en kontrollplatta (dag-1). För kontrollplattan, utsäde samma densitet av celler som i steg 1.2.1 i 100 pl odlingsmedium i en separat 96-brunnars platta. Denna "dag 0" behandlingen kommer att hjälpa till att tolka den cytostatiska / cytotoxiska karaktär av föreningarna som analyseras (Figur 2).
- Nästa dag (dag 0), läsa kontrollplattan. Jämvikta luminiscerande cellviabilitet reagens (cellTiter-Glo substrat blandades med buffert enligt tillverkarens instruktioner) till RT och blanda försiktigt genom att vända innehåll för att erhålla en homogen lösning. Lägg 80 fil reagens till de 100 pl celler / mediemix och skaka innehållet i 30 min för att inducera cellys.
- Spela luminiscens med en luminometer inställd på en exponering 0,1-1,0 sek och detektionsvåglängd av 560 nm.
- Lägg testföreningar (föreningarav intresse) till analysplattor (dag 0). Gör en 1: 4 serieutspädning av föreningar i DMSO vid 200x slutlig koncentration för totalt 10 koncentrationer (9 utspädningar innehållande förening och endast en DMSO, förening platta). Som ett första utgångspunkt, sträva efter en 200x lägsta dos av 0,03 um och en övre dos på 2000 iM (slutlig volym 200 l).
- Lägg serieutspädda föreningar till medium för att göra en förening medium mix på 10x slutkoncentration (slutlig volym på 100 pl, mellanplattan). Förvara föreningen plattan vid -20 ° C för användning på dag 3 av analysen. Tillsätt 10 | il av förening-medelblandning till celler i triplikat på sådant sätt att den högsta dosen är 10 ^ M (t ex., Raderna B, C och D, dag 0) (Figur 1). Inkubera analysplattor under 3 dagar vid 37 ° C. Kasta mellanplattan (s) efter användning.
- Dag 3, förbereda en 400 pl 1x förening medium mix med hjälp av de sammansatta plattorna framställda i 1.4. Vänd analysplattor för att ta bort media och klappa torrt på autoclaved pappershanddukar 2-3x att avlägsna kvarvarande medium. Lägg förening / media (100 ul / brunn) till brunnar skuggade i blått och tillsätt 100 l av media till omkretsen brunnar för att förhindra avdunstning (Figur 1). Åter inkubera analysplattorna vid 37 ° C under ytterligare 3 dagar.
- På dag 6, bedöma relativa antalet livsdugliga celler genom att utföra en luminescens behandlingen såsom beskrivs i steg 1,3.
- Använd dagen 0 avläsningen bedöma statiska / giftiga föreningar. Giftiga ämnen inducera apoptos medan cytostatika inducera cellcykelstopp. Om föreningen är toxisk (dag 6 läsning är under dag 0 behandlingen), överväga att välja GI 50 och GI 50 x 5 koncentrationer för motstånds analyser. Men om föreningen inducerar stasis (lika med eller högre än d0 behandlingen), anser GI 100 och GI 100 x5 för resistensanalyser (Figur 2).
2. Installera läkemedelsresistens Analyser
- Om arbets witha cytostatiskt medel, utsäde celler vid ett sammanflöde av 30-40% i 150 mm 2 vävnadsodlingsskålar (volym = 30 ml) för motståndet analysen. Om man arbetar med ett toxiskt medel, utsäde på en 70-80% sammanflödet.
- För cellinjer som härbärgerar en intakt felpamingsreparation (MMR) mekanism, inkubera cellerna från steg 2,1 O / N vid 37 ° C med den cancerframkallande N-etyl-N-nitrosourea (ENU). Behandla celler med 30 | il av en förrådslösning av 50 mg / ml ENU (slutlig koncentration 50 | ig / ml) för att förbättra genomisk instabilitet. För cellinjer som har en defekt MMR (tabell 2 och 3), kan behandling med ENU eller andra cancerframkallande ämnen inte vara nödvändigt.
- För andra cellinjer, bestämma MMR-brist av NCI kriterier som använder mikro instabilitet 12, eller baserat på den publicerade karakterisering med hjälp av mikro instabilitet analyser eller genomisk / epigenomiska profilering av MMR-gener 13-15.
- Behandla celler med testföreningen (er) avränta på koncentrationen bestämdes i steg 1.8. För mycket giftiga föreningar som orsakar celldöd i en typisk tre-dagars viabilitetsanalys 10, börja med en behandling i låg dos (dvs, GI 50) och stegvis öka koncentrationen (multiplar av GI 50) av förening var 2-3 veckor tills robust motstånd observeras. Fyll media och förening var 3 d.
- När urvalet har inletts, ändra media / förening blanda var 3-4 dagar tills resistenta kloner dyker upp. Motstånd per definition uppstår när behandlade celler visa större tillväxt / lönsamhet under läkemedelsbehandling i förhållande till akut behandling av DMSO-behandlade kontrollceller.
3. Isolera enda cell Clones
- Undersök odlingsskål med faskontrastmikroskopi (förstoring 40x) för livskraftiga kluster av celler.
- Markera tillfredsställande kloner på botten av skålen med en märkpenna. Plocka kloner som är av genomsnittlig storlek (större kolonier kanhärstammar från flera celler) och väl isolerade från andra kolonier. Plocka kloner genom att använda någon av två metoder som beskrivs i steg 3.3.
- Tillvägagångssätt 1: Använda en pipett (Figur 3)
- Ta tillväxtmedier och skölj med 1x PBS för att avlägsna eventuella flytande celler.
- Använd svarta märken som guide till "plocka" kloner med pipettspetsen (bifogas pipett, p200 helst).
- Överför kloner i 48-brunnsplattor med 200 fil färskt medium (med halvföreningskoncentration för att tillåta optimal återhämtning av celler).
- Låt cellerna att återhämta sig under 2-3 dagar innan du lägger 200 pl färsk media / perfekt förening koncentration.
- Fortsätt att ändra media / förening var 3-4 dagar och fortsätter att expandera kloner.
- Tillvägagångssätt 2: Använda Kloning skivor (Figur 3)
- Markera kloner som beskrivs i steg 3.2.
- Placera 3 mm kloning skivor i en 10 cm vävnadsodlingsskål innehållande 5 ml 0,25% trypsin-EDTA under 2 min.
- Aspirera media från skål med resistenta kloner och overlay kloner med trypsin indränkt klonings skivor med sterila engångs pincett.
- Låt stå 1-2 minuter, beroende på hur lätt kloner lyfta av plattorna, i en 37 ° C inkubator.
- Plocka upp kloning skivor med steril pincett och överför till 48-brunnsplattor med 200 fil färskt medium och en halv koncentration av föreningen.
- Pipettera upp och ner försiktigt för att lossa cellerna från kloning skivor och inkubera O / N vid 37 ° C (lämna kloning skivor i brunnar).
- Nästa morgon, ta bort klonings skivor från 48-brunnsplattor och fylla brunnar med 200 ul färskt medium / förening (halv perfekt förening koncentration).
- Tre dagar senare, fylla media med den perfekta koncentrationen av förening.
- Fortsätt att ändra media / föreningen var 3-4 dagar och fortsätter att expandera kloner.
4. Bedömning Grad Resistance av isolerade kloner
- När 10-20 kolonier expanderas, generera GI 50 kurvor som beskrivs i steg 1 för att bedöma graden av resistens.
- Inkludera alltid kontrollpopulationer behandlade med DMSO under urvalsprocessen. Det är mycket troligt att det spektrum av motståndet kommer att bli stora (några visar delvis medan andra visar fullständig resistens). Samla några kloner från var och en av dessa klasser som mekanismen för resistens kan variera mellan de två grupperna.
5. Nästa generations sekvensering
- Spinn ner 2 miljoner celler (kontroll och resistenta kloner) (500 xg under 5 min) i 15 ml koniska flaskor för både gDNA och RNA samling (alltså 2 x 2 miljoner).
- Tvätta två gånger med 1 x PBS och frysa pellets i -80 ° C tills redo för isolering.
- Använd en kommersiell utvinning kit för att isolera RNA eller gDNA enligt tillverkarens protokoll.
- Skicka in prover för nästa generations sekvenseringmed hjälp av leverantörens protokoll 10.
6. Bioinformatik analys av prover (hela-exome sekvensering)
- Förbehandla sekvensdata enligt en best practice DNA-punkter rörledningen 16.
- Kartlägga alla läser att referera mänskliga genomet GRCh37 använder BWA 17. Konvertera okomprimerade SAM formaterade anpassningar till komprimerad BAM-format med Samtools 18. Sortera anpassningar av samordna med Samtools. Lägg lästa grupper som använder Picard. (För specifik BWA, Samtools och Picard kommandon, se tilläggs Text 1, raderna 1-4)
- Markera alla dubbletter läser med hjälp av MarkDuplicates kommandot från Picard verktygssats 19. Index här filen med Samtools. (Kompletterande Text 1, raderna 5-6)
- För att minimera felparade baser i alla läser, justera läser lokalt på områden som hyser små insättningar eller deletioner med användning av en Indel realigner 20. (Kompletterande Text 1, raderna 7-8)
- För att ytterligare förbättra Accuracy variant ringer, empiriskt kalibrera bas kvalitetsresultat med hjälp av en bas kvalitetsresultat omkalibrering verktyg. Basen kvalitetskalibreringsverktyget ska inte bara korrekt inledande kvalitetsresultat, men också ta hänsyn till samvariation av flera funktioner, inklusive läst grupp, maskincykel, basposition och dinukleotid sammanhang (tidigare + aktuella baser). Generera omkalibreras BAM med Picard PrintReads. (För specifika kommandon för detta steg, se tilläggs Text 1, raderna 9-10)
- Upprepa steg 6.1.1 till och 6.1.4 (kompletterande Text 1, raderna 1-10) för varje prov sekvens.
- Identifiera enda nukleotidvariation (SNV) i varje klon med hjälp av en parad variant ringer tool19, 21-23. För varje klon sekvens kör parade variant ringa med föräldra klonen som matchade "normala". (Kompletterande Text 1, rad 11)
- Filter återkommande, högkvalitativa varianter och förbereda sig för anteckning med en variant annotation verktyg 24. Deprioritize variants inte gemensam för alla resistenta kloner. (Se R skript i tilläggs Text 2)
- Kommentera varianter med en anteckning verktyg 25, 26. Många variant anteckningsverktyg har en medföljande web app tillåter data laddas upp och bearbetas av en fjärrserver.
- Använd en funktionell inverkan verktyget 27-29 att prioritera dessa varianter förutspådde att ha hög funktionell effekt. Liksom variant anteckning, flera verktyg finns tillgängliga för funktionell effekt förutsägelse via ett webbgränssnitt.
Representative Results
För att maximera potentialen för att upptäcka de viktigaste funktionella förare av motstånd, välj en enda cell kloner för expansion, fenotypisk testning och sekvensering. Såsom visas i figur 4A, HCT116 celler behandlas för en förlängd period med cytotoxisk förening # 1 ledde till spontan uppkomst av resistenta kloner som fortsatte att växa under behandlingen (streckade svarta cirklar). Dessa kloner plockades med hjälp av metod # 1 som anges i figur 3 och därefter expanderat för fenotypisk analys. Såsom visas i figur 4B, resistenta kloner 1-3 alla visade signifikant resistens till förening # 1 och dess nära analog förening # 2 (större viabilitet / tillväxt), medan alla kloner uppvisade känslighet för en orelaterad cytotoxisk förening VELCADE. Efter bekräftelse av fenotypisk resistens var gDNA isolerades och lämnas in för hela-exome sekvensanalys. Bioinformatiska verktyg tillämpades för att begränsa in på de strukturella varianter somär 1) återkommande och 2) har potential för funktionell effekt (Figur 5A). Strukturella varianter som uppfyllde dessa två kriterier bekräftades av en oberoende sekvense verktyg. Såsom visas i figur 5B, ett heterozygot missense-mutation som identifierades med användning av hel-exome sekvense bekräftades med användning av Sanger-sekvensbestämningsmetoden (övre panelen, WT-sekvens; undre panelen, mutantsekvens). Efter sekvensbekräftelse, modercellinjen ursprungligen användes för motstånds analysen var genetiskt manipulerade för att uttrycka det mutanta cDNA till funktionellt bekräfta rollen för mutationen. Såsom illustreras i fig 6, medan överuttryck av WT-cDNA misslyckades med att ge resistens, tvångs uttryck av det mutanta cDNA signifikant ges fenotypisk resistens till förening # 1, vilket bekräftar den funktionella rollen för denna strukturella variation som en drivkraft av resistens. Alla reagenser som används för detta experiment sammanfattas i tabell 1 trong>.
Figur 1. Layout analys och kontrollplattor. Blå nyans, sammansatta behandlings brunnar. Vit skugga, enda medium. Föreningar spädes i serie 1: 4 och administreras i triplikat (BD eller EG). 2 föreningar kan appliceras per platta.
Figur 2. Representativa lönsamhets kurvor. Röd streckade linjen representerar den dag 0 behandlingen. X-axeln anger ökande doser av förening till höger och y-axeln representerar viabilitet i förhållande till DMSO-kontrollbrunnarna. GI 100 = dos för att uppnå 100% tillväxthämning; GI 50 = dos som används för att reducera viabiliteten till 50% DMSO-kontroll.
_upload / 52879 / 52879fig3.jpg "/>
Figur 3. Två metoder för att plocka resistenta kloner för expansion. Tillvägagångssätt 1- använda pipett för att plocka upp och överföra väldefinierade kloner till 48-brunnsplattor. Tillvägagångssätt 2 användning trypsin-indränkt klonings skivor för att lyfta kloner och överföra till 48-brunnsplattor.
Figur 4. Bekräftelse av motståndet uppnås för HCT116 kloner till förening # 1 in vitro. (A) Förening # 1-resistenta HCT116 kloner uppstod efter kontinuerlig treveckors val. (B) livskraft kontroll och resistenta kloner testades efter 72 timmar behandling med olika föreningar. Förening # 2 är en nära analog av förening # 1. Velcade användes som en kontroll cytotoxiskt medel. Data visas som genomsnitt + standardavvikelse för tre biologiska replikat.
Figur 5. Identifiering av en unik, återkommande mutation (single nucleotide varianter, SNVs) i gen A i förening # 1-resistenta HCT116 kloner. (A) Arbetsflöde att identifiera SNVs förekommer i alla resistenta kloner och förväntas ha en mycket funktionell effekt av MutationAssessor. (B) Bekräftelse av mutationen i genen A av Sånger-sekvensering.
Figur 6. Åter uttryck av muterad gen A ges resistens mot förening # 1 in vitro. Livskraft de tekniska HCT116 cellinjer testades efter 72 timmar behandling med förening # 1. HCT116-WT eller muterade cellinjer som stabilt uttrycker WT eller muterade cDNA av genen A, respektive. Data visas som genomsnitt + standardavvikelse of tre biologiska replikat.
| Provnamn | Aminosyra | Primär vävnad | Zygositet | |
| C-33-A | p.E768fs * 44 | cervix | Heterozygot | |
| C-33-A | p.S860 * | cervix | Heterozygot | |
| KML-T1 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| CP66-MEL | p.C822F | hud | Heterozygot | |
| CTV-1 | p.0? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| EFO-27 | p.Q130fs * 2 | äggstock | Heterozygot | |
| EFO-27 | s.? | äggstock | Heterozygot | |
| p.E467K | bröst | Heterozygot | ||
| J-RT3-T3-5 | p.R711 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| LNCaP | s.? | prostata | Homozygot | |
| LoVo | s.? | tjocktarm | Homozygot | |
| MOLT-13 | p.R711 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| NALM-6 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| NCI-H630 | p.R680 * | tjocktarm | Heterozygot | |
| SKUT-1 | p.L787fs * 11 | endometrium | Homozygot | |
| SKUT-1B | pL787fs * 11 | endometrium | Homozygot | |
| SUP-T1 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
Tabell 1. Msh2 -mutated cellinjer. Cellinje (provnamn), aminosyrasubstitution, är linjen ursprungs och zygositet anges.
| Provnamn | Aminosyra | Primär vävnad | Zygositet | |
| CCRF-CEM | p.R100 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Heterozygot | |
| CCRF-CEM | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Heterozygot | |
| CW-2 | p.Y130fs * 6 | tjocktarm | Homozygot | |
| DU-145 | s.? prostata | Homozygot | ||
| GR-ST | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| HCT-116 | p.S252 * | tjocktarm | Homozygot | |
| IGROV-1 | p.S505fs * 3 | äggstock | Homozygot | |
| MN-60 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| NCI-SNU-1 | p.R226 * | mage | Homozygot | |
| P30-OHK | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| PR-Mel | s.? | hud | Homozygot | |
| REH | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot | ||
| SK-OV-3 | p.0? | äggstock | Homozygot | |
| SNU-1544 | p.S2L | tjocktarm | Heterozygot | |
| SNU-1746 | p.E523K | tjocktarm | Homozygot | |
| SNU-324 | p.C233R | pankreas | Heterozygot | |
| SNU-324 | p.V384D | pankreas | Heterozygot | |
| SNU-478 | p.V384D | pankreas | Heterozygot | |
Tabell 2. MLH1 -mutated cellinjer. Cellinje (provnamn), aminosyrasubstitution, är linjen ursprungs och zygositet anges.
Discussion
Val av cellinje (r): Karakterisering av genetisk tillstånd och genomisk instabilitet
Utan tvekan, den enskilt mest kritiska faktorn för att framgångsrikt upptäcka kliniskt relevanta resistensmekanismer är den initiala cell linjeval. Två faktorer bör övervägas. Först syftar till att välja cellinje (s) av samma härstamning / subtyp hyser de definierande genetiska egenskaper av sjukdomen (t ex., BRAF V600E i melanom). Förhör av allmänt tillgängliga transcriptomic och mutationsdata för båda cellinjerna 30-32 och primär / metastasering tumörer för olika indikationer 33,34 kommer att underlätta urvalsprocessen. Även om identifiering av cellinjer med kliniskt relevanta genetiska förändringar är perfekt, i vissa fall detta inte är möjligt på grund av brist på tillgängliga cellinjer eller genomförbart på grund av faktorer såsom svårighetsgrad och längd av screeningprocessen.
35. Baserat på COSMIC databasen finns flera kandidat cellinjer med brister i en av två ofta muterade MMR-gener, MSH2 eller MLH1 (Tabell 2 och 3). Alternativt, om cellinjer av intresse inte finns lagerskador i MMR, akut behandling med fysikaliska eller DNA reaktiva kemiska mutagener, som alkyleringsmedel N-etyl-N--nitrosourea (ENU) kan användas för att öka genomisk instabilitet. Även om båda metoderna kan avsevärt SHorten tid att uppnå resistenta kloner och uppföljning sekvensering, bör stränga funktionstestning utföras på kandidatgener som ett större antal icke-funktionella, passagerare mutationer kommer sannolikt att dyka upp. SNVs kan vara rangordnas för att maximera chanserna för att identifiera funktionellt relevanta mutationer. För det första, att välja de mutationer som är återkommande i oberoende kloner kommer att öka sannolikheten dessa mutationer är förare av motstånd. I händelse återkommande mutationer inte är identifierade, med fokus på SNVs som passar mekanismen för verkan av läkemedlet (t ex läkemedlets mål eller en känd nedströms effektor av läkemedelsmål) kan vara meningsfulla. Ytterst är guldmyntfoten alltid experimentell utvärdering av resistens förmedlande verksamhet kandidat SNVs av ektopisk cDNA uttryck i läkemedelskänsliga moderceller.
DNA vs RNA-sekvensering
När resistenta kloner har genererats, DNA och / eller RNAkan sekvens beroende på behovet. DNA-sekvensering, antingen exome eller hel-genomsekvensering, kommer att möjliggöra identifiering av nedärvda och somatiska varianter, såsom SNP InDels och antalet exemplar varianter. Medan det mer kostnadseffektivt vänliga exome sekvense fokuserar på generering läser från kända kodande regioner, kommer hela-genomet sekvense generera sekvensdata för hela genomet som kan underlätta identifiering av mutationer i icke-kodande element såsom förstärkare eller miRNA 36. Eftersom genuttryck data inte mäts under DNA-sekvensering, är det svårt att förutsäga vilken mutation (er) kommer sannolikt att vara en funktionell förare. I detta avseende, sekvensering av RNA, även om mer kostsamma, erbjuder denna fördel. Det faktum att mutationen samtal endast utförs på uttryckta RNA-slag förhöjer sannolikheten att mutationen av intresse kan vara en funktionell drivrutin. Förutom att tillåta en mer fokuserad undersökning av mutationer för uppföljning funktionell testning, RNA-sekvensering ocksåerbjuder den extra fördelen av att kunna identifiera genuttryck förändringar, alternativ splitsning och nya chimära RNA arter, däribland genfusioner som också kan fungera som potenta förare av motstånd.
Bioinformatics rörledning
Exempel kommandon tillhandahålls för illustrationssyfte, men mer detaljerad dokumentation och handledning är tillgängliga från Broad Institute 16 och bör läsas noggrant innan NGS analys. Följande kommandon är konstruerade för en UNIX-skalmiljö på ett system där alla verktyg och referensdata har förinstallerat. Dessa kommandon utgår också FASTQ filer som innehåller parade ändsekvensen läser från två prover, som heter "föräldraansvar" och "resistent" har tagits emot från leverantören och placeras i "data" katalogen. I de flesta fall kan dessa kommandon bör anpassas eller optimerade för ett specifikt program med ytterligare kommandoraden argment (t.ex. lägga till "-t 8" till kommandot bwa tillåter flertrådade drift över 8 processorkärnor). Läs grupper (som tilldelar anpassningar till biologiska prover), ofta måste läggas till BAM-filer, även om det bara finns ett prov per bam-fil, för att uppfylla kraven filformat för vissa verktyg. Läs grupparametrarna RGID, RGSM, RGPL, RGPU och RGLB kan vara godtyckliga strängar som beskriver den kända ta prov, sekvense plattform och biblioteksstrategi.
In vitro vs in vivo-analyser
Även om flera resistensmekanismer som identifierats av in vitro-selektion har kontrollerats och befunnits vara kliniskt relevant, det finns en möjlighet att de mekanismer som inte kan tjäna som relevanta eller dominerande mekanismer för klinisk resistens. En orsak till detta kan vara en väsentlig roll för mikromiljön driva resistens mot behandling, en komponent som saknar i det experimentella protokollet / setup discussed hittills. I själva verket har flera studier visat att anti-cancermedel som kan döda tumörceller ineffektiva när tumörcellerna odlas i närvaro av stromaceller som innebär medfödda resistensmekanismer som följer av stroman 37,38. Att identifiera sådana stroma-inducerad förvärvade resistensmekanismer, kan man överväga att utföra in vitro samodling eller in vivo tumörmotstånds analyser. Sedan den förra analysen är ganska komplex, många har tillgripit generera läkemedelsresistenta tumörxenografter att ta itu med potentiella roll stroma i körmotståndet. Sådana studier har avslöjat både identiska 5 och unika 39 resistensmekanismer i förhållande till in vitro-selektion, vilket innebär att stroma faktiskt kan spela en roll i den senare. Men man måste vara uppmärksam på hur lång tid det kan ta att generera sådana resistenta tumörer och komplexiteten i uppföljningen genomanalys complexities på grund av intratumoral molekylära och cellulära heterogenitet.
Målidentifiering
Förutom att upptäcka drogresistensmekanismer, kan även tillämpas här NGS-baserade genomisk profilering metod för att identifiera cellulära mål av kemiska prober. Historiskt sett har flera objektiva metoder använts för att identifiera de cellulära verkningsmekanismer och mål med låg molekylvikt kemikalier med biologiska aktiviteter, inklusive affinitetsrening i kombination med kvantitativa proteomik, jästgenomiska metoder, RNAi screening och beräknings slutsats närmar sig 40. Som en förlängning till belysning av läkemedelsresistensmekanismer som använder NGS-baserade iska eller transcriptomic profilering av fenotypiskt resistenta cellpopulationer, identifiering av unika återkommande single nucleotide variationer (SNVs) eller uttryck förändringar som gör motstånd kan erbjuda insikter funktionella cellulära mål av föreningar. Thans bygger på tanken att en delmängd av resistensmekanismer observerade kan innebära återkommande mutationer i gener som kodar för de direkta proteinmål av den lilla molekylen. Nyligen har flera rapporter validerade nyttan av strategi, särskilt genom att kombinera med andra metoder, bland annat storskaliga cancercellinje känslighet profilering, att avslöja de cellulära mål av små molekyler sonder 9,10.
Disclosures
Publiceringsersättningar för denna artikel betalas av H3 biomedicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
| Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
| Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
| RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
| Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
| GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
| MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
| Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
| MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |
References
- Sellers, W. R. A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy. Cell. 147 (1), 26-31 (2011).
- Housman, G., et al. Drug resistance in cancer: an overview. Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).
- Balbas, M. D., et al. Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design. Elife. 2, e00499 (2013).
- Joseph, J. D., et al. A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509. Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).
- Korpal, M., et al. An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide). Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).
- Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Whittaker, S. R., et al. A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition. Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).
- Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance. Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).
- Adams, D. J., et al. NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes. ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).
- Bhang, H. E., et al. Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding. Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).
- Boland, C. R., et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).
- Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein. Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).
- Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes. Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).
- Ahmed, D., et al. Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines. Oncogenesis. 2, e71 (2013).
- GATK. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/gatk/guide (2015).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Picard. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: http://broadinstitute.github.io/picard (2015).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).
- Cibulskis, K., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
- Oncotator. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/oncotator (2015).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 38 (16), e164 (2010).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 6 (2), 80-92 (2012).
- Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Ng, P. C., Henikoff, S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).
- Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Abaan, O. D., et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology. Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).
- Forbes, S., et al.
- Shah, S. P., et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).
- Behjati, S., et al. Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma. Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).
- de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance. J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).
- Kotani, A., et al. A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells. Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).
- Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase. Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
