Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kloning og storskala produksjon av høykapasitets adenovirusvektorer Basert på Human adenovirus type 5

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/52894
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Virology and Microbiology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Department of Human Medicine, Faculty of Health, University Witten/Herdecke

Introduction

For genet terapeutiske anvendelser er det av stor betydning for å unngå cytotoksiske og immunogene bivirkninger forårsaket av ekspresjon av virale proteiner, transgenet i seg selv eller ved innkommende virale proteiner. Adenovirusvektorer (AdV) er mye brukt for å innføre fremmed DNA inn i en rekke forskjellige celler for å undersøke effekten av transgene uttrykk 1,2. Den mest avanserte versjonen av AdV er representert ved høykapasitets adenovirusvektorer (HCAdV) mangler alle virus kodende sekvensene 3,4 og dermed tilby en pakkekapasitet opp til 35 kb kombinert med lav immunogenisitet og lav toksisitet 5-8. På grunn av deres høye pakkekapasitet de tillater levering av store eller flere transgener ved hjelp av en enkelt vektor dose. Derfor, de representerer et verdifullt verktøy for forskersamfunnet.

I motsetning til første eller annen generasjon AdV mangler de tidlige gener E1 og / eller E3 som enkelt kan produseres ved hjelp av kommersielle kits, vector genom konstruksjon og virusproduksjon av HCAdV er mer kompleks. Systemet for bygging av HCAdV genomer er basert på plasmidet pAdFTC bærer en HCAdV genom blottet for alle virale sekvenser og shuttle plasmid pHM5 9-12. Enhver genet av interesse på opp til 14 kilobaser (kb) kan bli klonet inn i shuttle-vektoren pHM5 hvor multiple kloningssete flankert av gjenkjenning / spalte sidene til de målsøkende endonukleaser PI- SCE I og I- Ceu I. Derfor kan et klonet gen frigjøres ved suksessiv PI- SCE I, og I- Ceu I fordøyer for etterfølgende rettet innføring i de samme restriksjonssetene som er tilstede i genomet HCAdV som inneholdes i plasmid pAdFTC. I pAdFTC transgenet innføringsstedet ligger mellom PI- SCE I, og I- Ceu I spaltningsseter er flankert av stuffer DNA, og de ​​ikke-kodende sekvenser som er nødvendig for adenovirus-genom emballasje slik som 5 'og 3' inverterte terminale gjentagelser (Itrs)i begge ender og emballasjen signal nedstrøms for 5'ITR. Den ekstra stuffer DNA gir optimale størrelsen på den endelige HCAdV genomet som strekker seg fra 27 til 36 kb å sikre effektiv pakking under virusproduksjon. Siden pAdFTC er et stort plasmid med inntil 45 kb (avhengig av størrelsen av det innsatte transgenet), og bruken av homing endonukleaser med sammenlign lange DNA-gjenkjenningsseter viser sterk DNA-binding, flere opprenskningstrinn er nødvendig under overføring av transgenet fra pHM5 til pAdFTC. Forsiktig håndtering unngå skjærkrefter anbefales.

De Itrs av HCAdV genomet er flankert av Ikke-restriksjonsenzymgjenkjennelses ligger rett oppstrøms for 5'ITR og nedstrøms av 3'ITR 12. Derfor kan HCAdV frigis av Not I fordøye for etterfølgende transfeksjon av det virale genomet inn i HCAdV produsent-cellelinje. Legg merke til at bruken av restriksjonsenzymet NotI for relenkel virusgenomet fra plasmidet pAdFTC innebærer at den innsatte transgenet er blottet for Not I DNA-gjenkjenningsseter. De HEK293 celle basert produsent celler (116 celler) stabilt uttrykker Cre rekombinase. For virus forsterkning 116 celler er co-infisert med en hjelper virus (HV) som gir alle AdV gener som trengs for replikering og emballasje i trans 3,4. HV er en første generasjons AdV med en floxed pakking signal som blir fjernet i løpet av virus forsterkning av Cre rekombinase uttrykt i 116 celler 4. Dette sikrer at hovedsakelig HCAdV genomer inneholdt et intakt emballasje signal blir innkapslet.

Pre-amplifisering av HCAdV blir utført ved å utføre serielle aging måten i 116-celler dyrket på overflater i vevskulturskåler. Etter hver passering virale partikler blir frigjort fra infiserte celler ved å gjennomføre tre påfølgende fryse-tine-trinn. Med hver passasje økende antall celler som er infisert med1/3 av cellelysat fra den foregående passasje. Endelig lysat fra den siste pre-forsterkertrinnet blir brukt til å infisere produsent celler dyrket i suspensjon i en roterende kolbe for storskala forsterkning. Virioner er renset fra suspensjonsceller ved å utføre ultrasentrifugering i en cesiumklorid densitetsgradient 4,12. Med denne fremgangsmåten tomme partikler og ferdig montert partikler blir delt opp i to adskilte bånd. For ytterligere å konsentrere HCAdV partiklene en andre ikke-gradvis ultrasentrifugetrinnet utføres. Deretter ble den resulterende bånd som inneholder det HCAdV samles og dialyseres mot en fysiologisk buffer. Endelige vektor forberedelser karakteriseres med hensyn til antall absolutte viruspartikler, smittsomme partikler og HV kontamineringsnivåer. Absolutte virale partikler kan bestemmes ved lysering av virale partikler og måling av absorbansen ved 260 nm, eller ved å utføre kvantitativ real-time PCR (qPCR) 12. Smittsomhet av pursert viruspartikler kan bestemmes ved måling av qPCR HCAdV genom tilstede i infiserte celler, 3 timer etter infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruksjon av rekombinant HCAdV genomer basert på Plasmid pAdFTC

Merk: Alle plasmider har blitt beskrevet tidligere 11,12 og er tilgjengelig på forespørsel. Kloningsprosedyren er skjematisk vist i figur 1.

  1. Klone et gen av interesse (GOI) inkludert promotor og polyadenyleringssignalet (PA) i shuttle plasmid pHM5, ved hjelp av en kloning strategiske valget, for å generere pHM5-GOI.
    MERK: Siden pAdFTC er en relativt stor plasmid, er klassiske plasmid forberedelse protokoller anbefalt å unngå sheering av plasmid DNA ved hjelp av kommersielle plasmid rensing kits som er basert på silika membraner. I- Ceu jeg og PI -Sce jeg sterkt binde til DNA og endre elektro mobilitet av fordøyd DNA. Derfor er en fenol-kloroform ekstraksjon og etanol utfelling (trinn 1.3) som er nødvendig før agarose gelelektroforese.
  2. Digest 20 mikrogram av PHM5-GOI og 10 ug pAdFTC ved I-CeuI (10 U) i 3 timer ved 37 ° C i et totalvolum på 100 pl for å linearisere plasmider (~ 2,8 kb + GOI ORF sekvens og ~ 31kb, henholdsvis).
  3. Rens lineariserte plasmider ved hjelp av fenol-kloroform-ekstraksjon, fulgt av etanol (EtOH) 13 utfelling.
    1. Tilsett 100 ul av fenol: kloroform: isoamylalkohol og bland forsiktig ved å vende røret flere ganger. Sentrifuge i 2 minutter ved 15000 x g.
    2. Overfør supernatanten til et nytt rør, tilsett 20 pl natriumacetat (pH 5, 3 M) og 400 ul iskald EtOH (99.8%), og suspensjonen blandes kraftig. Sentrifuger i 10 minutter ved 15 000 x g.
    3. Fjern supernatanten, tilsett 300 ul 70% EtOH og sentrifuge i 2 minutter ved 15000 x g. Deretter fjerner supernatanten og lufttørke DNA pellet. Oppløse pelleten i 10- 20 mL av dH 2 O. Ikke tørk DNA pellet for lenge, som det vil være vanskeligere å få DNA i løsningen.
  4. Digest I-CEU I -digested pHM5-GOI og pAdFTC plasmid fra trinn 1,3) i minst 3 timer eller O / N med restriksjonsenzymet PI -Sce I (10 U) ved 37 ° C i et totalvolum på 50 ul, og deretter rense jeg -CeuI og PI -Sce jeg fordøyd plasmider ved hjelp av fenol-kloroform ekstraksjon etterfulgt av EtOH nedbør (se trinn 1.3). Løs opp DNA i 20 pl nukleasefritt gratis dH 2 O.
  5. Separat pHM5 plasmid ryggrad (2,8 kb) og GOI (fra trinn 1.4) på ​​en preparativ agarosegel og gel-rense GOI bruker en kommersiell gel-og PCR opprydding kit. En representativ agarosegel for spaltningen er vist i figur 2A.
  6. Dephosphorylate I- Ceu jeg og PI -Sce I-spaltet pAdFTC (fra trinn 1.4) med kalvetarm alkalisk fosfatase CIP (10 U) i 1 time ved 37 ° C i et totalvolum på 25 ul og rense defosforylert plasmid pAdFTC ved fenol-kloroform-ekstraksjon og påfølgende EtOH precipitation (trinn 1.3). Eluere DNA i 20 pl nukleasefritt gratis dH 2 O.
  7. Utføre analytisk gelelektroforese fra en delmengde av defosforylert pAdFTC plasmid (fra trinn 1,6) og renset GOI-fragment (fra trinn 1.5) for å analysere hvorvidt fordøyer er fullført og størrelsene av de forventede fragmentene er riktige (~ 31 kb til linearisert pAdFTC ).
    Merk: Størrelsen på GOI er variabel avhengig av størrelsen av transgenet ekspresjonskassetten. Anslå de relative konsentrasjoner av de respektive fragmenter for etterfølgende ligering. En representativ agarosegel av rensede fragmenter er vist i figur 2B.
  8. Sett opp ligeringsreaksjonen i et totalt volum på 20 pl ved bruk av 400 U T4 DNA-ligase, og et molart forhold mellom vektor for å sette på 1: 3.
    NB: I samsvar med agarose gel er vist i figur 2B vi vanligvis ligere i et totalt volum på 20 ul med 2- til 6-pl vektor, 8- til 12 ulsette inn og 400 U av T4 DNA-ligase. Som DNA-konsentrasjonen er vanligvis lav etter flere phenolization trinn, bruke så mye DNA som mulig, slik at det ikke tilføres H2O må tilsettes for å nå den endelig volum på 20 ul. Ligere ved 16 ° CO / N og deretter utføre fenol-kloroform-ekstraksjon fulgt av utfelling EtOH (trinn 1.3).
    1. Elueres DNA i 15 ul nuklease fri dH 2 O og fordøye det rensede ligeringsreaksjonen med restriksjonsenzymet Swai (10 U) i 2 timer ved 25 ° C i et totalt volum på 20 ul. Deretter konsentrere og rense DNA, ved å utføre fenol-kloroform-ekstraksjon fulgt av utfelling EtOH (trinn 1.3). Eluere DNA i 10 ul nukleasefritt gratis dH 2 O.
  9. Transform 2 mL av den rensede Swa jeg fordøyd ligation produkt av elektroporering i DH10B eller DH5a elektrokompetente E. coli og utvalgte kloner for 16 til 24 timer ved 37 ° C på ampicillin-holdig LBplatene (50 mg / ml ampicillin). Velg 5- 10 kloner og forberede plasmid DNA mini-preparater bruker alkalisk lysering etterfulgt av fenol-kloroform ekstraksjon og påfølgende EtOH nedbør (trinn 1.3) 13.
  10. Utføre en analytisk digest av plasmid mini-preparater, etterfulgt av agarosegel elektroforese for å kontrollere størrelsen av DNA-fragmenter. Foreslåtte restriksjonsenzymer er for eksempel I- Ceu jeg og PI- SCE jeg slippe innsatsen, Spe jeg eller HincII (figur 2C).
  11. Amplifisere et korrekt klon på ampicillin-holdig LB-medium (50 mg / ml ampicillin), og utføre en Midi- eller maxi-plasmid preparatet ved hjelp av en hvilken som helst kommersielt tilgjengelig plasmid rensing kit.

2. Offentliggjøring av HCAdV-genomer fra pAdFTC Plasmid og Preamplification av HCAdV vektorer i Producer Cell Linje 116

  1. Fordøye 20 ug av den pAdFTC baserte adenoviral produksjon plasmid inneholdende den klonede GOI fra trinn 1.11) iet totalt volum på 100 ul ved bruk av Not I (20 U) ved 37 ° C i> 2 timer og utføre fenol-kloroform-ekstraksjon to ganger etterfulgt av EtOH utfelling. Løs opp i 20- 30 mL sterilt dH 2 O.
  2. Kontroller en delmengde av 1:10 fortynnet spaltet pAdFTC-GOI-DNA ved gel-elektroforese. En 9 kb fragmentet til plasmidet ryggrad og, avhengig av størrelsen på GOI, et andre DNA-fragment for den HCAdV genomet (størrelse: 28- 36 kb) er detekterbar.
    NB: Et representativt eksempel på Not I sammendrag blir vist i Figur 2D. Linearisert DNA kan lagres i flere dager ved 4 ° C eller ved -20 ° C i flere uker.
  3. Før du fortsetter med protokollen, sørg for at hjelperen virus AdNG163R-2 har blitt forsterket fire.
    Merk: celler transfektert med pAdFTC avledet HCAdV vektorer er genmodifiserte organismer klassifisert som biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2), må du bruke riktig oppbevaring og avfallshåndteringtiltak, herunder personlig verneutstyr, og arbeider under BSL-2 LAF hetter.
  4. Kultur 116 celler i MEM Eagle-medium supplert med 10% FBS og hygromycin B (100 ug / ml). Seed lav passasje (under passering 10) 116-celler (0,4x 10 ~ 6 celler) i en 60 mm vevskulturskål en dag før transfeksjon, slik at de når 50- 80% konfluens neste dag.
  5. Transfektere linearisert HCAdV genomet fra trinn (2.1) inn i 116 celler ved hjelp av fremgangsmåter, slik som kalsiumfosfat-transfeksjon eller andre kommersielt tilgjengelige transfeksjon reagenser (figur 3A). 16- 18 timer etter transfeksjon, forsiktig fjerne medium, tilsett 3 ml friskt medium (MEM, 5% FBS) og infisere celler med HV AdNG163R-2 4 påføre 5 førende enheter (TU) per celle (siden en konfluent 60 mm vevskulturskål inneholder ~ 3.2x 10 6 celler, legge ~ 1,6x 10 7 TU av HV).
    1. Forsiktig flytte parabolen hver 20 min i løpet av den første timen etter smitte tilsikre lik HV distribusjon. Dyrke infiserte celler ved 37 ° C og 5% CO2. Ved effektiv virus amplifikasjon cytopatisk effekt (CPE) forårsaket av virusreplikasjon (celler er rundet opp og løst koblet til eller koblet fra vevskulturskål) er observerbar 48 timer etter infection.If CPE observert tidligere mengden av HV må bli redusert. Hvis CPE starter senere, har mer hjelpervirus som skal brukes.
  6. Høste celler, inkludert supernatant 48 timer etter infeksjon ved å spyle av cellene fra dyrknings fatet ved hjelp av kulturmediet. Celler som er suspendert i deres kulturmedium kalles passasje 0 (P0). Split P0 i to fraksjoner.
    1. Fra 0,5 ml av de løsnede celler spinne ned cellene i 3 minutter ved 2000 xg og fjerne medium fra cellepelleten, blir det senere brukt for isolering av genomisk DNA (gDNA) for qPCR basert analyse av amplifikasjonsprosessen. Lagres cellepelleter ved -20 ° C inntil videre behandling.
    2. Fra 2,5ml av de frigjorte celler frigi virale partikler ved frysing (ved -80 ° C eller i flytende nitrogen) og tining (ved romtemperatur eller i et 37 ° C vannbad) i celler som er resupended i sitt medium tre til fire ganger. Denne fraksjonen er enn kalt lysat av P0.
  7. Sikre at vevskulturskåler med 116 celler som er dyrket til 90- 95% confluency hjelp MEM-medium supplert med FBS (10%) og hygromycin B (100 mikrogram / ml) og HV er tilgjengelig for følgende aging trinn.
  8. Bland 1 ml friskt medium (MEM, 5% FBS) sammen med 2,5 ml av løsningen fra det foregående avsnittet (trinn 2.6.2) til et sluttvolum på 3,5 ml, tilsett HV anvende to TU per celle (siden en 60 mm vev kultur tallerken om confluency av 90- 95% inneholder ~ 3.2x 10 6 celler, legge ~ 6,4x 10 6 TU av HV). (Figur 3B). Fjern forsiktig medium fra en 60 mm skål med 116 celler og tilsett den virale blandingen til cellene. Gjenta trinn 2,6) - 2,8) to ganger for å oppnå lysater av passaldre P1 og P2.
  9. Bland 17,5 ml fersk media (MEM, 5% FBS) med 2,5 ml av løsningen fra P2 og legge HV påføre to TU per celle (siden en 150 mm vevskulturskål på en confluency av 80- 100% inneholder ~ 2x 10 7 celler, legge ~ 4x 10 7 TU av HV). Fjern mediet fra en 150 mm skål av 116 celler, og infisere celler med virale blandingen. Dyrke infiserte celler ved 37 ° C og 5% CO2.
  10. 48h etter infeksjon høste celler som er beskrevet i trinn 2,6) for å oppnå passasje P3 (figur 3B).
    1. Gjenta trinn 2.6) 1.
    2. Fra den resterende 19,5 ml P3 frigivelse viruspartikler fra de resupended cellene ved frysing og tining tre til fire ganger. Denne fraksjon er enn kalt lysat av P3.
      Merk: Noen vektorer slutt kan kreve ekstra passasjer i 150 mm skåler til de er forsterket tilstrekkelig. Effektiviteten av pre-amplifikasjonsprosessen må derfor overvåkes under serie passaldring. qPCR basert analyse av amplifikasjonsprosessen kan utføres som beskrevet i del 3 (se også figur 4A). Pre-amplifikasjon av HCAdV bærer en ekspresjonskassett for grønt fluorescerende protein (GFP) lett kan vurderes ved å observere GFP flourecscent signal ved hjelp av et fluorescensmikroskop (figur 4B).

3. Overvåking av Amplification Process hjelp Kvantitativ-Real Time PCR (qPCR) (se også figur 4A).

  1. Isoler gDNA fra cellepelleter fra hver passering av preamplifaction (trinn 2.6) - 2.10) ved hjelp av noen kommersiell DNA isolering kit for isolering av gDNA fra dyrkede celler eller en annen metode for valg. For optimale PCR resultat bruk gDNA så fersk som mulig. Ellers gDNA kan oppbevares ved -20 ° C inntil videre anvendelse.
  2. For å bestemme antallet HCAdV genomer tilstede i cellene i den respektive passasje av qPCR-analyse generere en standardkurve ved bruk av 10 1 </ sup> - 10 9 kopier av et plasmid som bærer GOI inneholdt i HCAdV genomet.
  3. Analyser samme mengde gDNA fra P0- P3 (trinn 2.6- 2.10) søker qPCR bruker 400 nM av primere spesifikke for GOI finnes i HCAdV genomet. For å gjennomføre qPCR følger produsentens instruksjoner av respektive qPCR kjemikalier. Still qPCR program som følger: pre-inkubering ved 95 ° C i 10 min, forsterkning i 40 sykluser på 95 ° C i 10 s, 55- 60 ° C i 15 s og 72 ° C i 20 s. På basis av standardkurven antall HCAdV genomer i reaksjonen, kan interpoleres.

4. Large Scale Amplification of HCAdV vektorer i 116 celler Økende i Suspension

  1. Legg 900 ml forvarmet (37 ° C) friskt MEM supplert med 10% FBS og hygromycin B (100 ug / ml) i en 3 l spinnerkultur kolbe (figur 3B).
  2. Fjern medium fra minst 10 individuelle 150 mm vevskulturskåler med en16 celler dyrket ved en confluency på 90- 100% og skylle av cellene med 10 ml frisk forvarmet (37 ° C) MEM supplert med FBS (10%) og hygromycin B (100 ug / ml) ved anvendelse av en serologisk pipette. Pipetter opp og ned flere ganger for å få en homogen cellesuspensjon. Overfør cellene direkte inn i den roterende kolbe som allerede inneholder 900 ml fra trinn 4.1).
    Merk: Ikke bruk Trypsin / EDTA som det kan negativt påvirke veksten av suspensjonsceller. Etter fjerning av medium umiddelbart overføre celler inn i den roterende kolbe. Ikke ta mer enn to vevskulturskåler gangen. Jo lengre ventetid etter legge friske media desto vanskeligere blir det å enebolig cellene fra vevskulturskål.
  3. For å sikre optimal cellevekst inkubatet roterende kolbe på en magnetrører i en vevskulturinkubator i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Juster magnetisk rører til 70 rpm for å unngå festing av celler til glassflatene. Overvåke cellevekst i spinnerkultur kolben for å undersøke hvorvidt celler dyrket i spinnerkultur kolben er levedyktig, og at de vokser i tilstrekkelige mengder. Hver gang før tilsetning av friskt medium overføring 2 ml fra bioreaktoren til en 60 mm vevskulturskål. Observere cellemorfologi under et mikroskop.
    Merk: Celler som danner klumper som flyter i kulturmediet indikere optimal vekst og levedyktighet (se også figur 4C). Etter 24 timers de danner kolonier på overflaten av vevskulturskål. 30- 50% samløpet indikerer optimal tetthet.
  4. 24 timer etter oppsett av spinnerkultur kolben legge til 500 ml friskt medium (MEM, 10% FBS) supplert med hygromycin B (100 ug / ml). 24 timer senere gjenta dette trinnet.
  5. 72 timer etter oppsett av spinnerkultur, tilsett 1000 ml friskt MEM medium (10% FBS) sammen med hygromycin B (100 ug / ml), noe som resulterer i et totalvolum på 3 liter cellesuspensjon.
  6. 24 timer etter å ha nådd avKanonvolumet av tre liter, innhøsting 116 suspensjonsceller ved sentrifugering i 10 minutter ved 500 xg ved romtemperatur. Kast supernatanten. Hold tømt spinner kultur kolbe under panseret vev kultur.
  7. Resuspender cellepelleter i friskt MEM supplert med 5% FBS ved å pipettere opp og ned omtrent 8- 10 ganger for å få en homogen cellesuspensjon. Volumet av medium avhenger av om lysat fra trinn 2.10) 2. (19,5 ml, se trinn 4.8) 1. alternativ a) eller en renset viral lager av HCAdV fra trinn 5.9) 2. (flere ul depanding på viral titer, se trinn 4.8) 2., alternativ b) brukes for infeksjon av cellene. Bruke et totalt volum på 150 ml.
    1. Alternativ A: For infeksjon av 116 henge celler med lysat fra P3 (primær forsterkning) overføre celler fra trinn 4.8) til en 250 ml lagring flaske utstyrt med en steril magnetisk rørepinne eller en 250ml liten skala spinner kolbe og co-infisere celler med virus i lysatet fra P3 (trinn 2.10.2) og 2 TU av HV per celle. Forutsatt en tetthet på 3 x10 5 celler per ml, er det totale celletallet 9x 10 8 celler. Dermed legger 1,8x 10 9 TU av HV.
    2. Alternativ b: For infeksjon av 116 suspensjonsceller med renset viral lager, overføre celler fra trinn 4.8) til en 250 ml lagring flaske utstyrt med en steril magnetisk rørepinne eller en 250ml liten skala spinner kolbe og co-infisere celler med 100 viruspartikler per celle av tidligere renset HCAdV (fra trinn 5.9) 2.). Således legge 9x 10 10 VP ifølge fysisk titer (målt ved absorbans ved 260 nm, trinn 6) av det rensede HCAdV og 1,8 x 10 9 TU av HV.
  8. Omrør den celle-virus-blandingen fra september 4.8.1) eller 4.8.2) på en magnetrører i en vevskulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 timer ved 60 rpm. Sørg for at lagringsbeholderen ikke er helt lukket for å tillate luft sirkulasjon.
  9. 2 timer etter infeksjon overføre det totale volumet av den celle-virus-blandingen inn i 3 l spinner kulture kolbe og tilsett 1,850 ml friskt forvarmet (37 ° C) MEM media supplert med 5% FBS til et totalt volum på 2 liter og inkuber i vevskultur-inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 48 timer ved 70 rpm.
  10. Høste cellene ved sentrifugering i 10 min ved 890x g ved RT i 500 ml sentrifugerør. Fjern medium og resuspender pelleterte celler i et totalvolum på 28 ml DPBS. Pipettere opp og ned for å oppnå en homogen cellesuspensjon. Fryse celle-virus-suspensjon i flytende nitrogen eller ved -80 ° C, noe som gjør at suspensjonen er fullstendig frosset. Oppbevar celle-virus-suspensjon ved -80 ° C inntil utgangs viruset rensing.

5. Rensing og Dialyse av HCAdV

  1. For å fremstille virus-lysat for cesiumklorid (CsCl) gradienter, fryse celle-virus-suspensjon fra trinn 4.11) i flytende nitrogen, og tining i et vannbad ved 37 ° C fire ganger.
  2. Sentrifuger viralt lysat ved 500 x g i 8 min ved RT og samle supernatanten inneholdende HCAdV.
  3. For Ultrasentrifugering fremstille CsCI-oppløsninger som follows.Weigh 37,5 g (1,5 g / cm 3), 33,5 g (for 1,35 g / cm 3), og 31,25 g (for 1,25 g / cm 3) av CsCl pulver henholdsvis og fylle opp med dH 2 O til 25 ml.
    1. Stirr inntil løsningen blir klar og sterilt filter løsningene. Endelig fjerne 1 ml av hver løsning og veie det på en fin skala for å sjekke været tettheten er riktig. 1ml bør veie 1,5 g, 1,35 og 1,25 g henholdsvis.
    2. Hvis tettheten er for høy justere den ved trinnvis tilsetning av små volumer (ul) av sterile dH 2 O. Etter tilsetning av dH 2 O måle densitiy nytt. Om nødvendig legger mer dH 2 O.
    3. Gjenta prosedyren til tetthet er riktig. Hvis tettheten er for lav justere den ved å tilsette små mengder av CsCl pulver. Sterilt filter det igjen og sjekke tettheten. Hvis tettheten er for høy justere den ved adding dH 2 O som beskrevet tidligere. Hvis tettheten er fortsatt for lavt legge mor CsCl, sterilt filter det igjen og sjekke tettheten. Gjenta prosedyren til tettheten er riktig.
  4. Forbered CsCI trinngradienter i seks klare ultrasentrifuge rør. Forsiktig og langsomt pipettere CsCI løsninger inn i rørene ved hjelp av følgende rekkefølge: 0,5 ml av 1,5 g / cm 3 CsCl-oppløsning, 3 ml av 1,35 g / cm 3 CsCl-oppløsning og 3,5 ml av 1,25 g / cm 3 CsCl-oppløsning (figur 2C) .
  5. Overlay ~ 4,5 ml ryddet vektor supernatant fra trinn 5.2) på toppen av 1,25 g / cm3 CsCl lag. Sentrifuger gradientene i en ultrasentrifuge ved bruk av en utsvingbare rotor (SW-41) ved 12 ° C i minst 2 timer ved 226 000 x g (35 000 rpm) med langsom akselerasjon og retardasjon for å separere HCAdV-genomet inneholdende virale partikler fra tomme partikler og celle rester.
    MERK: Under optimale forhold en diffus band av celleavfall formes på toppen avrørene. Under to hvite bånd kan observeres. Det øvre båndet inneholder tomme partikler, mens det nedre båndet er lik HCAdV (figurene 2C og 5A).
  6. Fjern forsiktig lag av cellerester og tomme partiklene og samle 1 ml av de nedre bånd fra hvert rør og overføre viruset med en ren pipettespissen inn i et sterilt 50 ml rør. Legg opp til 24 ml av 1,35 g / cm 3 CsCl løsning på de innsamlede viruspartikler og bland forsiktig.
  7. Fyll sentrifugerør med 1,35 g / cm 3 CsCl-virus løsning til toppen og sentrifuger O / N (18- 20 h) ved 226000 x g (35000 rpm) ved 12 ° C i en ultrasentrifuge ved bruk av en utsvingbare rotor (SW-41 ) med treg akselerasjon og retardasjon.
  8. Samle HCAdV stede i fremtredende nedre band. Som potensiell øvre båndet inneholder tomme partikler fjerne øverste lagene fra toppen ved hjelp av en pipette (se figur 2C og 5B) Så ta bort den nedre bandet USIng en pipette.
  9. Dialyser de innsamlede viruspartikler for buffer utveksling.
    1. Klipp av en stripe av dialyserør (MWCO: 50000) på ca 8 cm i lengde, vaske det med sterilt dH 2 O for tre ganger. Deretter lukker en side av dialyserøret med en plastklemme og overføre de innsamlede virus fra trinn 5.8) i røret ved hjelp av en 1 ml pipette. Unngå luftbobler i slangen og lukke den på den andre siden med en plast klemme dialyse nedleggelser.
    2. Dialyser i 1 liter dialysebuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glyserol og 1 mM MgCl2 i deionisert H2O) i 2 timer ved 4 ° C med sakte omrøring. Utveksling dialysebuffer med 2 liter dialysebuffer og dialyser O / N ved 4 ° C under langsom omrøring. Alternativt bruke en sucrosebuffer (140 mM NaCl, 5 mM Na HPO 2 4 x2H 2 O, 1,5 mM KH 2PO 4 og 730 mM sukrose, pH 7,8).
    3. Samle dialysert viruspartikler fra trinn 5.9) 2. anvendelse av en 1 ml pipette. Forbered flere aliquoter av de ønskede små volumer (25 til 100 ul) og lagres renset virus ved -80 ° C.

6. Måling av fysisk Titer av Endelige HCAdV Forberedelser av optisk tetthet (OD)

  1. Fortynn 25 ul av den endelige vektoren preparatet fra trinn 5.9) 2 med 475 ul lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS)), rist i 20 min ved RT og til slutt sentrifugeres i 2 minutter ved romtemperatur ved 15 000 x g.
  2. Siden absorbansverdier ved 260 nm (A260) er vanligvis lav, måle absorbansen fire ganger ved anvendelse av 100 ul av supernatanten, og beregne middelverdien av fire målinger. Beregn antallet virale partikler pr ml (VP / ml-1) ved hjelp av følgende formel: VP / ml -1 = (gjennomsnittlig A260) x (20) x (1,1 x 10 12) x (36 kb / HCAdV størrelse i kb ).
    MERK: Resultater av et typisk utbytte av absolutt virale partikler (OD titer) er vist i figur 7A

7. Måling Total Partikler, Smittsomme Enheter av HCAdV og HV forurensningsnivåer i finalen Vector Utarbeidelse av qPCR. Et skjema for titrering prosedyre er vist i Figur 6

  1. Seed HEK293 celler i 6 eller 12 brønns vevskulturplater slik at cellene når 90% konfluens på neste dag. For å bestemme antallet infeksiøse viruspartikler (smittsom titer), infisere celler av en brønn i en multi-brønn plate med en pl og en andre brønn med 10 ul renset virus fra trinn 5.9) 3.
  2. Høste celler tre timer etter infeksjon. Fjern medium og legge trypsin å dekke hele godt og ruge på tre7 ° C og 5% CO2 i 5 min. Spyl av cellene med trypsin ved anvendelse av en pipette og spinne ned cellene ved 890 x g i 3 minutter ved RT.
  3. Suspender pelleterte cellene i 200 ul DPBS og vaske dem grundig for å fjerne frie (ikke-infeksiøs) vektor partikler. Sentrifuger i 3 minutter ved 890 xg ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspender cellepelleter i 200 ul frisk DPBS.
    Merk: For nøyaktig bestemmelse av den smittsomme titer, er det viktig å fjerne alle ikke-infeksiøse viruspartikler fra celleoverflatene ved trypsinbehandling og grundig vasking.
  4. Å bestemme den totale viral partikkeltall (smitte partikler og ikke-smittsomme partikler = fysisk titer), høste ikke-infisert HEK293 celler fra to brønner uten trypsin ved å spyle av cellene med deres kultur medium med en pipette.
  5. Spinne ned cellene i 3 minutter ved 890 xg ved romtemperatur. Kast medium og resuspender pelleted celler i 200 ul DPBS. Subsequently tilsett 1 pl og 10 pl av renset HCAdV preparatet direkte til cellene, henholdsvis. Bruk ikke infiserte celler som bakgrunn, for å sikre like vilkår for gDNA isolasjon og påfølgende q-PCR.
  6. Isolere gDNA fra HEK293-celler som stammer fra trinn 7.3) og 7.5)
    1. Vortex cellene resuspendert i 200 ul DPBS (trinn 7.3 og 7.4) i 3 sekunder, tilsett 200 ul SDS-løsning. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS) og 20 pl proteinase K (20 mg / ml) og vortex suspensjon i 3 sek. Inkuber 12- 16 timer ved 55 ° C og riste langsomt. Deretter tilsett 2 pl av RNase A (20 mg / ml) og inkuberes i 30 min ved 37 ° C.
    2. Legg 350 mL av fenol: kloroform: isoamylalkohol og sentrifugeres i 2 minutter ved 15000 x g. Overfør supernatanten til et nytt rør og gjenta dette trinnet en gang
    3. Overfør supernatanten til et nytt rør, tilsett 50 pl natriumacetat (pH 5, 3 M) og 1 ml iskald EtOH (99.8%) og bland suspensjon. CentriFUGE prøvene i 10 minutter ved 15.000 xg for å pelletere genomisk DNA.
    4. Deretter fjerner supernatanten, tilsett 500 ul av 70% EtOH og sentrifuge i 2 minutter ved 15000 x g. Fjern supernatanten, tilsett 500 ul av 70% EtOH og det hele rystes i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter sentrifugeres i 2 minutter ved 15000 x g.
    5. Fjern supernatanten og lufttørke DNA-pellet. Ikke tørk DNA-pellets i lang tid, som det vil være vanskeligere å få gDNA i løsning. Resuspender DNA-pelleten i 120 pl av dH 2 O og inkuber i ~ 1 time ved 37 ° C under rysting. Dersom DNA-oppløsningen vises viskøs, rist den i flere timer ved 37 ° C, og inkuber ved 55 ° C i ~ 1 time.
  7. For å bestemme infeksiøse HCAdV-partikler og absolutte HCAdV partikler, generere en standardkurve av 10 1 - 10 åtte kopier av et plasmid som bærer GOI inneholdt i HCAdV genomet.
  8. Bestem totale partikler og smittsomme partikler ved å analysere de samme mengder gDNA av infisert HEK293 calen fra trinn 7.3) og 7.4) gjelder qPCR bruker 400 nM av primere spesifikke for GOI finnes i HCAdV genomet.
  9. Still PCR-programmet som følger: pre-inkubering ved 95 ° C i 10 min, forsterkning i 40 sykluser på 95 ° C i 10 sek, 55 ° C i 10 sekunder og 72 ° C i 20 sek. På basis av standardkurven (trinn 7.7), interpolere det totale antall av adenovirus genomene i reaksjonen.
  10. Beregne antallet av adenovirus genomene i det endelige vektoren preparatet ved hjelp av følgende formular: (Antall HCAdV / vekt i ng av gDNA i reaksjons) x (vekt i ng av DNA fra alle cellene i den infiserte fatet / volum virus i ul) .
    MERK: Den typiske rekkevidde for absolutte og infeksiøs viruspartikler avkastning er rundt 1x10 7 -1x10 8 viral partikler / mikroliter. Titere som er ti ganger større eller mindre enn vist her kan betraktes som normal. Høyere titere ville være en forbedring. Med hensyn til forholdet mellom absolutte HCAdV particles til smittsomme HCAdV partikler, viser erfaring at ca 5- 10% av absolutte HCAdV partiklene er smittsom (figur 7A).
  11. For å bestemme forurensningsnivåer med HV, utføre qPCR ved å amplifisere en del av adenovirus sen gen 3 (L3) som er tilstede i HV genomet. Bruke et plasmid som bærer det adenovirale sent gen 3 (L3) for å generere en standardkurve (trinn 7.7).
  12. I denne reaksjonen gjelder 400 nM av primere L3 frem 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'og L3 omvendt 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3 "sammen med 300 nM av L3-spesifikk probe 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
  13. Still PCR-programmet som følger: pre-inkubasjon / aktivering ved 95 ° C i 10 min, forsterkning i løpet av 40 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min. Bruk noen universell probe PCR MasterMix for qPCR reaksjon. På basis av standardkurven (trinn 7.7), beregne antallet ifectious HV partikler i den endelige vektor forberedelse. Se (figur 7A) for typiske avkastning for HV partikler.
  14. Til slutt beregner forholdet mellom absolutte infeksiøse partikler av HCAdV hv forurensningsnivåer for å vurdere kvaliteten av vektoren preparatet.
    MERK: Inntil nå en liten del av gjenværende HV ikke kan utelukkes. Vanligvis er andelen av HV-forurensning er ~ 5% av infeksiøse partikler eller mindre, noe som er akseptabelt (figur 7B). Selvfølgelig som mindre HV som mulig er ønskelig, særlig dersom vektoren preparatet skal brukes for dyreforsøk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her representative eksempler for kloning, forsterkning og rensing av HCAdV preparater vises. En oversikt over kloningsstrategien (figur 1), og representative eksempler for kloning og frigivelse av HCAdV genomet ved restriksjonsenzym fordøye er anordnet (figur 2). En typisk begrensning mønster etter utgivelsen av GOI-uttrykk kassett fra pHM5 av PI- SCE jeg og I- Ceu jeg fordøye og påfølgende fenol-kloroform ekstraksjon og EtOH nedbør (se trinn også 1.2- 1.5) vises (Figur 2A). Typisk vil en ~ 3 kb bånd som tilsvarer den pHM5 plasmid ryggrad og et andre bånd som tilsvarer ekspresjonskassetten av GOI kan observeres. Båndet som inneholdt den GOI-ekspresjonskassetten blir så renset fra agarosegel. Det rensede GOI-ekspresjonskassetten blir analysert på en agarosegel sammen med den rensede, defosforylert pAdVFTC at wsom fordøyet med PI- SCE I, og I- Ceu I henholdsvis (trinn 1.7) til å verifisere den riktige størrelse og for å estimere den relative mengden av molekyler for etterfølgende ligering (figur 2B). Etter ligering (se trinn 1.8) etterfulgt av fenol-kloroform ekstraksjon og EtOH nedbør og Swa jeg fordøye å eliminere uncut pAdFTC og påfølgende fenol-kloroform ekstraksjon og EtOH nedbør (trinn 1.9), Rings produkter er forvandlet til bakterier og kloner er valgt på ampicillin inneholder LBi agar plater. Vanligvis titalls til hundrevis av kloner oppnås, som 5- 10 kloner er forberedt for plasmid DNA mini-preparater. Et restriksjonsmønsteret av en analytisk HincII-digest av positive og negative kloner sammen med en tom pAdFTC som negativ kontroll (se også trinn 1.10) er vist (figur 2C). Her positive kloner ikke viser et 5 kb båndet, som er tilstede i tom pAdFTC og negative kloner, og et 1,7 kb-fragment visessom ikke er tilstede i den tomme pAdFTC og negative kloner. For denne respektive GOI dette indikerer tha kloning var vellykket. En positiv klon som er blitt renset via midiprep ble deretter kuttet med Ingen tI å frigjøre HCAdV-genomet bærer GOI fra pAdVFTC-GOI (trinn 2.2). Endelig Ingen tI spaltet DNA ist renset to ganger ved hjelp av fenol-kloroform ekstraksjon og etanol utfelling for å sikre høy renhet av DNA for etterfølgende transfeksjon inn i 116-celler. Analyse av en liten brøkdel av No tI spaltet pAdVFTC-GOI på en agarosegel viser en ~ 9 kb bånd som tilsvarer den pAdFTC plasmid ryggrad og en stor band av opp til ~ 36 kb (avhengig av størrelsen på GOI ekspresjonskassetten) svarende til HCAdV genomet (figur 2D). En oversikt over amplifisering og rensing rørledning er skjematisk vist (figur 3). Representative eksempler på overvåkingen av vektoren pre-amplifikasjon prosess er gitt ( vist (figur 4A). Legg merke til at antall vektorgenomer descreases vanligvis i løpet av de første passasjer og kraftig øker i senere passasjer. En vektor kopiantall av 10 6 - ti 7 per 15 000 celler er tilstrekkelig til å infisere 116 celler for produksjon i stor skala i en 3 l spinnerflaske. Dersom GOI innenfor HCAdV vektoren genom inneholder en ekspresjonskassett GFP, kan pre-amplifikasjonsprosessen (seksjon 2) også bli overvåket av fluorescerende mikroskopi. Representative bilder av hver passering blir vist (figur 4B). Legg merke til at antall GFP positive celler avtar vanligvis i løpet av første passasjer og sterkt øker i slutten av passasjer. Hvis antallet GFP positive celler når ~ 100%, ble vektoren amplifisert sufficiently å infisere 116 celler for produksjon i stor skala i en 3 l spinnerflaske. Storskala forsterkning Fremgangsmåte ifølge et HCAdV inneholdende GFP ekspresjonskassett ble overvåket ved mikroskopisk analyse av kulturmedium og celler som ble overført fra den roterende kolbe til en vevskulturskål. Mikroskopiske bilder av celler som produserer HCAdV i suspensjonskultur (se trinn 4.4 og 4.11) er gitt (Figur 4C). Legg merke til at cellene vokser i klynger som indikerer at den foregående cellevekst var tilstrekkelig, og cellene er friske. Ved bruk av fluorescerende mikroskopi ~ 100% av disse cellene ble GFP positiv, hvilket indikerer effektiv transduksjon av suspensjonsceller i bioreaktoren og effektiv vektor produksjon. Vektorpartikler ble renset fra mediet og cellene i 3 liter suspensjonskultur av CsCl-ultrasentrifugering. Representative bilder av HCAdV vektoren rensing ved anvendelse av CsCl-densitetsgradient-ultrasentrifugering er vist (figur 5). Etter enn første sentrifugering ved hjelp av en CsCl skritt gradient vanligvis to bandene er observert. Den øvre bånd inneholder tom av partielle kapsider, mens det nedre båndet består av DNA-vektor inneholdende partikler (trinn 5.4- 5.5) (Figur 5A). DNA inneholdende vektorpartikler blir deretter høstet (trinn 5,6) og slått sammen for en andre ultrasentrifugetrinn til å konsentrere vektorpartikler. Dette trinnet resulterer vanligvis i et enkelt bånd av DNA inneholdende vektorpartikler som er endelig høstet for påfølgende dialyse (trinn 5.7- 5.8) (figur 5B). Dialysert vektorpreparater ble karakterisert ved å måle antall partikler absolutte, infeksiøse partikler og HV forurensning. En skjematisk skisse av titreringen fremgangsmåte (avsnitt 6 og 7) er anordnet (figur 6). Representative resultater for karakterisering av den endelige vektoren fremstilling er vist (figur 7). Stolpediagrammet viser typiske vektorpartikkel tall som eroppnådd ved fremgangsmåten som er beskrevet i denne protokollen. Absolutte partikler antall vektor partiklene ble bestemt av optisk tetthet (§ 6), smittsomme vektor partikler og HV forurensning ble målt ved qPCR (kapittel 7) (figur 7A). Erfaring viser at OD titer overvurderer antall viruspartikler. Absolutte virale partikler målt ved OD kan være 20- 500 ganger høyere enn infeksiøse viruspartikler, målt ved q-PCR. Smittsomme vektor partikler usally varierer mellom 5- 10% av absolutte partikler når begge ble målt med q-PCR (kapittel 7). Dersom vektoren preparatet har en meget god kvalitet, mer enn 20% av partiklene er absolutte smittsomme. Den typiske forholdet mellom HV og smittsomme HCAdV partikler (trinn 7.14) varierer vanligvis mellom 1-5% av smittsomme partikler (Figur 7B). Dette er akseptabelt som HV er replikering mangelfull. Likevel som mindre HV forurensning som mulig (<1% av smittsomme partikler) villevære foretrukket.

Figur 1
Figur 1. Flytskjema for kloning av GOI inn pAdFTC. Den GOI er klonet inn i MCS av pHM5 shuttle plasmid. Plasmider pAdFTC og pHM5-GOI er fordøyd med I- Ceu jeg og PI- SCE jeg og renset ved fenol-kloroform ekstraksjon og EtOH nedbør. Spaltet pHM5 blir applisert på en preparativ agarosegel for å rense genet av interesse (se også trinn 1.5), mens det spaltede pAdFTC plasmidet blir defosforylert. Deretter ble ligeringsreaksjonen med CIP-behandlet pAdFTC og transgenet ekspresjonskassetten er satt opp (se trinn 1.8), og etter fullførelse ble renset ved fenol-kloroform ekstraksjon og etanol utfelling. Den påfølgende Swa jeg digest av ligation produktet fulgt av fenol-kloroform ekstraksjon og EtOH nedbør hindrer vekst av kloner som bærer pAdFTC uten innsats. Svart trivinkler viser restriksjonsenzymgjenkjenningsseter; grå bokser indikerer AdV5 inverterte terminale gjentakelser (ITR), hvite bokser merket med Ψ indikere AdV5 emballasje signal indikerer rød pil promoter, grønne bokser indikerer transgenet (genet av interesse, GOI) som skal uttrykkes, blå bokser indikerer polyadenyleringssignal, orange eller blå Pilene viser antibiotikaresistensgener av plasmid ryggrad, hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Representative resultater for kloningsprosedyren og frigjøring av HCAdV genomet fra pAdVFTC. (A) Frigjøring av GOI-uttrykk kassett fra pHM5 av PI- SCE jeg og I- Ceu jeg digest (se også trinn 1.2- 1.5). (B) SCE jeg og I- Ceu jeg henholdsvis (trinn 1.7). (C) Analytisk HincII sammendrag av pAdVFTC kloner med og uten GOI (se også trinn 1.10). (D) Utgivelses av HCAdV-genomet bærer GOI fra pAdVFTC-GOI av Ingen tI digest (trinn 2.2) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
. Figur 3. Prinsippskisse for høykapasitets adenovirusvektor forsterkning og rensing (A) HCAdV DNA transfeksjon og helper virus (HV) infeksjon: Transfeksjon linearisert HCAdV genom bærer GOI inn i HCAdV produsent cellelinje (116 celler [4]) og subsequent infeksjon med HV AdNG163R-2 [4].   (B) Amplifisering av HCAdV: Etter pre-forsterkertrinn ved serielt å overføre cellelysat i et nytt vevskulturskål og co-infiserer med HV, storskala produksjon utføres i en 3 liter suspensjonskultur (C) HCAdV rensing. For rensing, virus ble isolert ved ultrasentrifugering ved hjelp av cesiumklorid-gradienter (D) Dialyse:. Rensede HCAdV partiklene dialysert mot 2 liter lagringsbuffer. HCAdV, høykapasitets adenovirusvektor; ITR, adenovirus serotype 5 invertert terminal gjentar; Ψ, emballasje signal; HV, helper virus; MOI, mangfold av infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 <br /> Figur 4. Representative resultatene av amplifikasjonsprosessen (A) Overvåking av pre-forsterkning prosessen ved forsterkning av virale genomer bruker qPCR (se også pkt 3.),. (B) Dersom GOI inneholder GFP som et transgen, pre-amplifikasjonsprosessen kan overvåkes av fluorescerende mikroskopi. (C) Representative resultater av storskala amplifikasjonsprosessen i en roterende kolbe eksemplifisert for HCAdV koding GFP. Det venstre panelet viser et mikroskopisk bilde av infiserte 116 celler fra spinner kolbe. En prøve av kulturmedium, og cellene ble overført til en 60 mm vevskulturskål. Merk at klumper av forsterkede celler er synlige. Høyre panel viser samme bilde med fluorescerende mikroskopi. Nesten 100% av cellene er transdusert med HCAdV bærer GFP. Vennligst klikk her for åse en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Representative resultater etter CsCI gradientsentrifugering (A) etter å ha utført et skritt gradient (se også trinn 5.5),.. (B) Etter kontinuerlig gradient (se også trinn 5.7) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Skjematisk oversikt over titrering prosedyren. (A) Måling av infeksiøse partikler: Celler i en multi-brønn plate er infisert med forskjellige mengder renset virus og samlet opp som cellepelleter (B) Måling o.f absolutte partikler: ikke infisert cellene danner en multi-brønn blir oppsamlet ved trypsinering og sentrifugering. Etter resuspensjon renset virus tilsettes og genomisk DNA er isolert. (C) Isolering av genomisk DNA. (D) For å kvantifisere virale genomet kopiantall en kvantitativ PCR (q-PCR) er utført. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 7
Figur 7. Representative resultater for karakterisering av den endelige vektoren preparat. (A) Absolutte tall av partikler av en vektor preparat i henhold til den fremlagte protokoll bestemmes ved ulike metoder.: OD titer målt ved optisk densitet (punkt 6), smittsomme titer og HV forurensning måles ved qPCR (pkt 7) (B)Forholdet mellom totale infeksjons HCAdV partikler og HV forurensningsnivåer målt ved qPCRs (§ 7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen presenteres her tillater rensing av HCAdV vektorer basert på menneskelige adenovirus type 5 basert på tidligere beskrevne prosedyrer 4,12. Den HCAdV genom innenfor pAdFTC plasmidet er fri for alle adenovirus gener og bærer bare 5'- og 3'- Itrs og emballasjen signal. I denne strategien HV AdNG163R-2 4 gir alle nødvendige gener for effektiv virusproduksjon i trans. Dette gir en emballasje kapasitet på opp til 35 kb, noe som klart outcompetes første og andre generasjons AdVs eller brukte lentivirus (LV) - eller adeno assosiert virus (AAV) baserte vektorer. En annen fordel med HCAdV spesielt for in vivo anvendelser er det faktum at i motsetning til første eller annen generasjons AdVs de viser reduserte nivåer av cytotoksisk og immunogene bivirkninger forårsaket av ekspresjon av virale proteiner 5-8.

Likevel er den protokoll som er beskrevet her er mer tid ogarbeidsintensivt enn for andre virale vektorer som LV- eller AAV-vektorer samt første- eller annengenerasjons AdVs. En viktig hindring er kloning av store transgener og den påfølgende overføring til virusproduksjon plasmid pAdV-FTC. Bruken av homing endonukleaser PI- SCE I, og I- Ceu jeg gi kontrollert og dirigert innsetting av transgenet fra shuttle plasmid pHM5, men har den ulempe at de sterkt å holde seg til det spaltede DNA. Av den grunn mange fenol-kloroform oppryddings trinnene er nødvendig ved tilberedning plasmidfritt og stikk-DNA under kloning prosedyren. Derfor strengt følge gitt kloning protokollen er strengt anbefales. Etter kloning av HCAdV genomet frigjøres fra plasmidet pAdFTC med Not I restriksjonsenzym fordøye og deretter transfektert inn i produsent-cellelinje. Merk at innledende transfeksjonseffektiviteter er avgjørende for å oppnå tilstrekkelig virus forsterkning. Viktigere, protokollen og tilbyr flere skritthvor fremgangsmåten kan startes på nytt ved etterfølgende trinn mislykkes. I løpet av pre-amplifikasjon en tredjedel av lysatene kan lagres som backup for å starte prosedyren fra det punktet på nytt eller å forkorte en gjentagelse i tilfelle flere virus må produseres.

HCAdV frakte store, komplekse eller flere transgener eller viss stuffer DNA kan være forsterkende tregere enn forventet. Derfor er det viktig å nøye følge pre-amplifikasjonsprosessen før suspensjonskultur dyrkes i en roterende kolbe. Hvis pre-forsterkning ikke er vellykket, bør prosedyren stoppes og startes fra begynnelsen igjen. Ved pre-amplifikasjon er ineffektivt, kan ytterligere aging være nødvendig inntil virusmengden er høy nok til å infisere celler dyrket i en 3 L spinnerflaske. Som et alternativ til suspensjonskultur i en roterende kolbe, kan 20 til 30 150 mm vevdyrkningsskåler brukes for den endelige passasje. Dette kan imidlertid være mer tid og arbeidsintensivt.

For qPCR målinger gDNA kan enten renses via protokollen nevnt her, eller en hvilken som helst kommersielt tilgjengelig kit for isolering av gDNA fra dyrkede celler. Ved å bruke kommersielt tilgjengelig kit protokollen kan bli forkortet en dag, men en varierende del av HCAdV genom kopier som er tilstede i infiserte celler kan gå tapt under rensning, avhengig av den kit som brukes. Derfor HCAdV genomer blir litt underrepre- i følgende q-PCR-målinger sammenlignet med fremgangsmåten presentert i trinn 7.4).

ObtaiNed totale smitte titers i en siste vektor forberedelse avledet fra en spinner kolbe varierer fra 1 x 10 10 til 5 x 10 11 smittsomme partikler. Dette beløpet er tilstrekkelig til å utføre en rekke in vitro eksperimenter. Avhengig av målcellene, også flere in vivo forsøk kan gjennomføres. For eksempel, for å oppnå tilstrekkelig leveren transduksjon etter systemisk administrering 1 x 10 9 infeksiøse partikler er nødvendig.

Oppsummert, den brede celle tropisme og muligheten for å produsere kapsid-modifisert adenovirus sammen med den forbedrede sikkerhetsprofilen til HCAdV vektorer blottet for alle virale gener gjengi disse HCAdV vektorsystemet et meget verdifullt verktøy for genet terapeutiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Tags

Bioteknologi genavlevering adenovirusvektor høy kapasitet kloning helper avhengig spinner kultur system homing endonukleaser adenovirus genterapi
Kloning og storskala produksjon av høykapasitets adenovirusvektorer Basert på Human adenovirus type 5
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ehrke-Schulz, E., Zhang, W.,… More

Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter