Introduction
البطانة الوعائية ليست سوى طبقة الحاجز الذي يفصل بين الدم والأنسجة، وأنها تعتبر الغدة الصماء الواسعة التي تمتد فوق الشجرة الوعائية كامل مع مساحة 400 متر مربع 1. رفاه البطانة ضروري لتوازن الأوعية الدموية. تشارك البطانة المختلة وظيفيا في مختلف اضطرابات القلب والأوعية الدموية، بما في ذلك تصلب الشرايين، والأوعية الدموية والإصابات نقص التروية / ضخه، الخ 2-4. حتى الآن، والآليات الخلوية والجزيئية المحددة المعنية في إعدادات المرض هذه ليست مفهومة جيدا نظرا لطبيعة التشريحية تنتشر من البطانة.
الفأر هو نموذجا هاما للبحوث لتقنيات التلاعب الوراثية هي الأكثر نموا في الفئران مما كانت عليه في أي نوع من الثدييات الأخرى. ومع ذلك، يعتبر عزل الخلايا البطانية الأورطي الفئران الأولية صعبة للغاية بسبب صغر حجم الشريان الأورطي يجعل enzymatجيم الهضم من البطانة غير عملي. ذكرت بعض الإجراءات لعزل وتنقية ECS تتطلب 5-7.
والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام طريقة بسيطة لعزل وتوسيع الخلايا البطانية من الشريان الأورطي الماوس دون استخدام أي معدات خاصة. في هذا البروتوكول، هو قطع الشريان الأورطي المعزولة حديثا الى شرائح صغيرة والمصنفة على مصفوفة مع البطانة أسفل للسماح تنتشر البطانية. بعد إزالة شرائح، يتم توسيع الخلايا البطانية في متوسطة يفضل البطانة ونحن على استعداد لإجراء التجارب بعد يومين أو ثلاثة مقاطع. مزايا الطريقة الموصوفة هي: 1) ارتفاع عدد كبير من الخلايا البطانية يتم حصادها من الشريان الأورطي واحد؛ 2) وبقاء الخلية الحفاظ عليها بشكل جيد. و3) لا تحتاج إلى معدات خاصة أو تقنية. ويوفر وسيلة فعالة لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية محددة في الفيزيولوجيا المرضية الخلايا البطانية. بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في دراسة العلاقات العامةimary الخلايا البطانية مثقف من أي الجينات الفئران خروج المغلوب، الجينات تدق في الفئران، أو نموذج المرض الفئران، وهذا البروتوكول هو مفيد جدا وسهلة لممارسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل الشريان الأورطي من الفئران
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي للجامعة واين ستيت.
- ضع الماوس في غرفة تحريض على آلة التخدير. ضبط تدفق الأيزوفلورين إلى 4٪ بالتزامن مع 25٪ الهواء النقي و 75٪ O 2. تخدير الماوس عن طريق استنشاق الأيزوفلورين (4٪ لتحريض، ± 1.0٪ للصيانة) جنبا إلى جنب مع 25٪ الهواء النقي و 75٪ O 2 عن طريق غرفة تحريض تليها مخروط الأنف مخصص. ملاحظة: التخدير مع isoflurane يمكن تسليمها في 75٪ أكسجين / 25٪ الهواء أو في الأكسجين 100٪.
- تحقق الماوس كل 5 دقائق حتى يتم الوصول إلى مستوى مناسب من التخدير (عدم الانسحاب لقرصة أخمص القدمين).
- خذ الماوس للخروج من غرفة تحريض ومواصلة استنشاق الأيزوفلورين على الرغم من مخروط الأنف مخصص متصل آلة التخدير. تبديلالأيزوفلورين تتدفق إلى 1٪ للحفاظ على التخدير.
- ولئن كان تحت التخدير، ووضع الماوس على لوحة جراحة المتمركزة على ظهرها. استخدام شريط المختبر لتأمين أطرافه.
- استخدام مصباح التدفئة للحفاظ على الحارة الماوس. إبقاء مصباح في مسافة مناسبة من الماوس بحيث الماوس سوف عدم الإفراط في الحرارة.
- رش الصدر مع 70٪ من الإيثانول.
- استخدام مقص تشريح لفتح البطن من خط الوسط، وفضح الشريان الأورطي البطني. فتح تجويف الصدر وكشف القلب والرئتين.
- قطع الشريان الأورطي البطني في منتصف مع مقص تشريح للافراج عن الدم.
- ملء حقنة 1 مل (25 إبرة G) مع 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1000 وحدة / مل من الهيبارين. حقن تحتوي على برنامج تلفزيوني 1000 U / مل من الهيبارين إلى البطين الأيسر والشريان الأورطي يروي. دفع القلب والرئة مع ملقط في الشرايين الكبيرة إلى الجانب الأيمن من الفئران لفضح الشريان الأورطي الصدري.
- بسرعة إزالة الشريان الأورطي الصدري باستخدام دى الصغيرملقط ssection ووضعها في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X (المعقم)، ثم نقل الحاوية إلى غطاء محرك السيارة الصفحي تدفق الهواء.
- إدراج حقنة 1 مل مزودة 25 G إبرة في نهاية واحدة من الشريان الأورطي، وطرد بلطف الشريان الأورطي مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني لإزالة الدم.
- استخدام ملقط تشريح الصغرى لإزالة أكبر قدر من الأنسجة الدهنية المرفقة والسفن الصغيرة الجانبية ممكن.
- على الفور نقل الشريان الأورطي إلى البطانية المتوسطة النمو.
- قطع الشريان الأورطي إلى 1 حلقات ملم باستخدام شفرة مشرط معقم. حصاد حوالي 8-10 حلقات في الشريان الأورطي.
- فتح كل حلقة الأبهر باستخدام زوج من مقص تشريح الصغيرة.
2. البذور في قطاعات الأبهري على مصفوفة
- عندما لا تكون قيد الاستعمال، والحفاظ على النمو مصفوفة انخفاض عامل في -20 درجة مئوية إلى منع التصلب. وضع النمو مصفوفة انخفاض عامل في 4 درجات مئوية على الأقل بين عشية وضحاها للسماح للذوبان الكامل.
- Precool لوحة والماصة 6 جيدا النصائح ل-20 درجة مئوية لمدة على الأقل10 دقائق. وضع لوحة 6 جيدا على الجليد ومعطف بئر واحدة من لوحة مع 1 مل من المصفوفة دون إدخال أي فقاعات الهواء. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح للمصفوفة ليصلب.
- زرع قطع الشريان الأبهر على مصفوفة طدت باستخدام العقيمة ملقط تشريح الصغرى. توضع قطع التجويف جنبا إلى أسفل على المصفوفة دون لمس البطانة. ضع 3-4 شرائح الأورطي قريبة من بعضها البعض في المصفوفة.
- إضافة ما يكفي من البطانية المتوسطة نمو الخلايا للحفاظ على قطاعات الرطب (~ 200 ميكرولتر).
- احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 لمدة 4 إلى 6 ساعات. في نهاية اليوم، إضافة يكفي المتوسطة لتغطية القطاعات الأبهري.
- مراقبة شريحة الأبهر تنتشر بشكل دوري تحت المجهر على النقيض من المرحلة. تحقق مستوى متوسط ونمو الخلايا كل يوم. إضافة المتوسطة إذا لزم الأمر للحفاظ على قطاعات الأورطي تغطيتها.
- في اليوم ال 4، وإزالة بلطف على المديين المتوسط وإزالة الأورطي شرائح وROM المصفوفة باستخدام إبرة معقمة دون انقطاع الخلايا البطانية المتنامية.
- إضافة 2 مل من المتوسط نمو الخلايا البطانية الجديدة والسماح باستمرار الخلايا البطانية في الانتشار على مصفوفة ل2-3 أيام.
3. الركض الأولي للخلايا الفأر الأورطي غشائي
- معطف قارورة T12.5 جديدة مع الجيلاتين (0.1٪)، احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تغسل الصحون مصفوفة بعناية مع معقم 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من بروتين محايد (50 U / مل) إلى لوحات مصفوفة ويحضن في درجة حرارة الغرفة على منصة الروك مع اهتزاز في بعض الأحيان. فحص الخلايا تحت المجهر على النقيض من المرحلة للتأكد من فصل غالبية الخلايا.
- إضافة 2 مل من D-فال لإبطال نشاط بروتين محايد.
- جمع طاف بعناية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. غسل لوحة مع 2 مل D-فال وجمع طاف.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 900 x ج لمدة 5 دقائق في رودرجة حرارة م.
- إعادة تعليق بيليه خلية في 4 مل من البطانية المتوسطة نمو الخلايا ولوحة في قارورة T12.5 المغلفة مع الجيلاتين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة.
- استبدال المتوسطة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حتى تكون 85٪ - 90٪ متموجة.
4. الركض من خلايا الفأر الأورطي غشائي
- معطف اثنين من قوارير T12.5 جديدة مع الجيلاتين (0.1٪)، احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قبل الحرارة التربسين-EDTA (0.25٪ التربسين، 0.02 EDTA في برنامج تلفزيوني) وبرنامج تلفزيوني العقيمة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- غسل خلايا بعناية مع معقم 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني.
- إضافة 0.5 مل من التربسين-EDTA (0.25٪ التربسين، 0.02 EDTA في برنامج تلفزيوني)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 1 دقيقة أو حتى غالبية الخلايا تتحول الجولة.
- إضافة 2 مل من البطانية المتوسطة نمو الخلايا لوقف عملية الهضم. ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا في حدود الوقت قارورة عدة. إذا لزم الأمر، واستخدام خليةمكشطة لجمع الخلايا.
- جمع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. الطرد المركزي تعليق خلية في 900 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إعادة تعليق بيليه خلية في 4 مل من البطانية المتوسطة نمو الخلايا ولوحة في 2 قوارير T12.5 المغلفة مع الجيلاتين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة.
- استبدال المتوسطة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حتى تكون 85٪ - 90٪ متموجة.
- استخدام الماوس الخلايا البطانية الأورطي بعد 2-3 الممرات.
5. توصيف خلايا الفأر الأورطي غشائي
- إعادة لوحة الخلايا.
- معطف لوحة 6 جيدا مع الجيلاتين (0.1٪)، احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. شطف لوحة مع برنامج تلفزيوني.
- وقبل حرارة التربسين-EDTA وبرنامج تلفزيوني العقيمة إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- غسل الخلايا العقيمة مع برنامج تلفزيوني 3 مرات. إضافة 0.5 مل من التربسين / EDTA إلى الخلايا، واحتضان ل~ 1 دقيقة في 37 ° C سص حتى غالبية الخلايا تتحول الجولة.
- إضافة 2 مل من البطانية المتوسطة نمو الخلايا لوقف عملية الهضم. ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا في حدود الوقت قارورة عدة. إذا لزم الأمر، واستخدام مكشطة خلية لجمع الخلايا.
- جمع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. الطرد المركزي تعليق خلية في 900 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل طاف، اعادة تعليق الخلايا البطانية في المتوسط نمو الخلايا. البذور الخلايا في لوحة 6 جيدا المغلفة مع الجيلاتين في كثافة 3 × 10 5 / جيد.
- احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 للسماح للخلايا لنعلق على سطح الثقافة.
- ديل-AC-LDL المستحوذ والجولق -lectin ملزمة.
- تخزين 1،1'-dioctadecyl-3،3،3 "، 3'- tetramethylindo-carbocyanine المسمى بيركلورات LDL الأسيتيل (ديل-AC-LDL) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. قبل التلوين، وذوبان الجليد ديل-AC-LDL على الجليد. والمحاليل الأسهم ديل-AC-LDLنشوئها هو 1 ملغ / مل. تخزين FITC المسمى الجولق الأوروبي راصة (الجولق -Lectin، 1 ميكروغرام / مل) في 4 درجات مئوية. السهم الجولق -Lectin الحل هو 1 ملغ / مل. متجر هويشت 33342 في 4 درجات مئوية. السهم هويشت 33342 الحل هو 100 ميكروغرام / مل.
- إضافة 10 ميكرولتر من دل-AC-LDL حل الأسهم إلى 1 مل من مستنبت لجعل تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
- قبل التلوين، وإزالة المتوسطة من العمر وغسل الخلايا في كل بئر مع الوسيلة الجديدة.
- إزالة هذه الوسيلة الجديدة وإضافة تلطيخ المتوسطة ديل-AC-LDL.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.
- غسل الخلايا العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات.
- إضافة 1 مل من 10٪ من الفورمالين لإصلاح الخلايا. وضع لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- غسل الخلايا العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات. تجنب الضوء.
- إضافة 1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني 1X أن يحتوي على 10 ميكرولتر من الجولق -Lectin.
- احتضان الخلايا في غرفة من درجات الحرارةإعادة في الظلام لمدة 1 ساعة.
- إزالة الجولق-كتين عن طريق غسل الخلايا العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات.
- إضافة هويشت 33342 إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل، واحتضان 10 دقيقة في الظلام.
- عرض مضان من دل-AC-LDL (الأحمر والإثارة الطول الموجي 576 نانومتر)، الجولق -Lectin (الأخضر والإثارة الطول الموجي 519 نانومتر) وهويشت (الأزرق والإثارة الطول الموجي 361 نانومتر) مع المجهر الفلورسنت المقلوب.
- تلطيخ الفلورسنت لCD31، VEGFR2، أنوش، VE كادهيرين وCalponin.
- متجر FITC مترافق مكافحة فأر CD31 الأجسام المضادة، أنوش الأجسام المضادة، VE كادهيرين الأجسام المضادة، FITC مترافق مفتش المضادة للأرنب في 4 درجات مئوية في الظلام. متجر VEGFR2 الأجسام المضادة في -20 درجة مئوية.
- غسل الخلايا العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات.
- إضافة 1 مل من 10٪ من الفورمالين لإصلاح الخلايا. وضع لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- غسل الخلايا العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات.
- وصمة عار CD31، إضافة 1 مل من 1X العقيمةبرنامج تلفزيوني يحتوي على 10 ميكرولتر من CD31-FITC الأجسام المضادة. وصمة عار إما VEGFR2، أنوش، VE كادهيرين أو calponin، إضافة 1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني 1X يحتوي على 4 ميكرولتر من VEGFR2، أنوش، VE كادهيرين أو calponin الأجسام المضادة الأولية، على التوالي.
- احتضان الخلايا على الجليد لمدة 1 ساعة في الظلام.
- إزالة الأجسام المضادة عن طريق غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني العقيمة 3 مرات.
- لتلطيخ VEGFR2، أنوش، VE كادهيرين أو calponin، إضافة 1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني 1X أن يحتوي على 10 ميكرولتر من FITC مترافق مفتش المضادة للأرنب. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 1 ساعة في الظلام. إزالة مفتش عن طريق غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني العقيمة 3 مرات.
- إضافة هويشت 33342 إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل، واحتضان 10 دقيقة في الظلام.
- عرض مضان CD31، VEGFR2، أنوش، VE كادهيرين، calponin (الأخضر والإثارة الطول الموجي من 518-535 نانومتر) وهويشت (الأزرق والإثارة الطول الموجي 361 نانومتر) مع المجهر الفلورسنت المقلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البطانية الإيراق خلية
خلية البطانية عفوية تنتشر بدأ من شريحة الماوس الشريان الأورطي. سمح للقطاع الماوس الشريان الأورطي في النمو على النمو مصفوفة انخفاض عامل ثم في بطانة الأوعية الدموية المتوسطة نمو الخلايا لمدة 4 أيام. عادة ما تظهر تنتشر الخلايا البطانية في 2-4 أيام. اتخذت Photomicrographs يوم 4 (الشكل 1). كما هو مبين في الصور، وتهاجر العديد من الخلايا البطانية بعيدا عن هذا الجزء. استمرت براعم شكلت حديثا لتمتد من القطاع والفرع.
الظواهر الخلية البطانية
هذه الخلايا أظهرت مباراة المغزل على شكل وحصاة كبيرة مثل بعد مرور الأولي (الشكل 2A). وصفت الخلايا المرفقة مع ديل-AC-LDL والجولق -Lectin لمدة ساعة واحدة. كما هو مبين في الشكلين 2B-2E، فإن معظم الخلايا كانت ايجابية انقر نقرا مزدوجا لديل-AC-LDL امتصاص (الحمراء)، والجولق -Lectin ملزمة (الخضراء). وفي الوقت نفسه، بعد مرور الثاني، وكانت أكثر من 95٪ من الخلايا إيجابية للصفائح الدموية البطانية خلية التصاق جزيء 1 (CD31، PECAM-1، الشكل 2F)، VEGFR2 (الشكل 2G)، VE كادهيرين (الشكل 2H)، أنوش ( الشكل 2I) ولكن سلبية لCalponin (الشكل 2J) الذي هو على نحو سلس علامة الخلية العضلية.
الشكل 1. الخلية البطانية التبرعم. وكان المصنف الماوس شريحة الأبهر على النمو مصفوفة انخفاض عامل والمثقف في المتوسط نمو الخلايا البطانية. خلية البطانية تنتشر بدأ في وقت مبكر من يوم 2 (A، بار = 100 ميكرون)، وزاد في 2 التالية - 3 أيام (B، C، بار = 100 ميكرون). تمت إزالة هذا الجزء في يوم 4 (D، بار = 500 ميكرون).
الشكل 2. غشائي الظواهر الخلية. الخلايا المرفقة تعرض على شكل مغزل وحصاة كبيرة مثل مباراة (A، بار = 100 ميكرون)، مضان المزدوج إيجابية من دل-AC-LDL والجولق -Lectin (BE، بار = 100 ميكرون). وفي الوقت نفسه، الصفائح الدموية البطانية خلية التصاق جزيء 1 (CD31، PECAM-1)، VEGFR2، VE كادهيرين، أنوش كانت ايجابية في> 95٪ من الخلايا بعد مرور الثاني (FI، بار = 100 ميكرون) وكانت معظم هذه الخلايا سلبي لCalponin تلطيخ، والتي هي على نحو سلس علامة الخلية العضلية (J، بار = 100 ميكرون).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتوضح هذه الدراسة طريقة بسيطة لعزل والبطانية الثقافة خلايا من الشريان الأورطي الماوس دون أي معدات خاصة. وأشار تلطيخ المناعي أن غالبية الخلايا كانت الخلايا البطانية بعد مرور الثاني. ويشار إلى أن خلايا في الثانية لمرور الثالث هي مناسبة لفي التجارب المختبرية والتجارب المجراة لدراسة البيولوجيا البطانية.
ملاحظات رئيسية من البروتوكول
هناك خمس نقاط حاسمة في هذا الإجراء. أولا، يتم مسح لمعة الأوعية الدموية مع برنامج تلفزيوني يحتوي على الهيبارين للحد من تنشيط الخلايا البطانية وتشكيل الجلطة. ثانيا، الوقت بين السكتة القلبية والبذر من شريحة الأبهر على مصفوفة أمر بالغ الأهمية لبقاء البطانة. في حين تطهير الأنسجة الدهنية شبه الشرايين والأنسجة الضامة، وتجنب تمتد الشريان الأورطي والحد من الوقت الذي يقضيه في هذه الخطوة إلى 10-15 دقيقة. ثالثا، صبمجرد وسائل الاعلام ما يكفي لتغطية شرائح بعد المصنفة فيها. أيضا وسائل الإعلام الكثير سوف يتسبب في قطاعات الأورطي لتعويم. رابعا، مستنبت يحتوي على نسبة عالية من البطانية تكملة نمو الخلايا، مما يجعل الخلايا البطانية تنمو بشكل أسرع بكثير مما كانت عليه عندما مثقف في نمو الخلايا البطانية متوسطة 2. وثمرة من الخلايا البطانية قمع أنواع أخرى من الخلايا مثل خلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية. خامسا، توقيت لإزالة جزء الأبهر من مصفوفة أمر بالغ الأهمية لنقاء الخلايا البطانية أيضا. هذه الخطوة يمنع تلوث الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء. يجب إزالة هذا الجزء قبل تطوير شبكة الأنابيب. سوف إزالة تأخر شريحة الأبهر يؤدي إلى تلوث أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الليفية أو خلايا العضلات الملساء. يرجى ملاحظة أن هذا النهج يستخدم أيضا لدراسة الأوعية الدموية في المختبر، وتشكيل الشعرية مثل الهياكل يدل على قدرة الأوعية الدموية للجزء الشريان الأبهر. استنادا لدينا البريدمحبي، إذا تم إزالة الشرائح بعد بنية تشبه الشعرية يتطور بشكل كامل، وحدوث خلايا العضلات الملساء زيادة التلوث بشكل كبير. ولذلك، فإننا نرى أن نقطة زمنية أفضل لإزالة هذا الجزء هو عندما تبدأ الشبكة لتكون واضحة ولكن لم يتم تطويرها بشكل كامل. في هذه الطريقة، ونحن قادرون على حصد أكبر عدد ممكن من الخلايا البطانية ممكن مع الحفاظ تلوث من قبل خلايا العضلات الملساء إلى أدنى حد ممكن.
والقيود المفروضة على البروتوكول
هناك بعض القيود من الأساليب المذكورة. أولا، هناك احتمالات التلوث من الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء، إذا لم يتم إزالة أجزاء الشريان الأبهر قبل تطوير شبكات الأنابيب. والخلايا الليفية أو خلايا العضلات الملساء قد تبدأ لتعلقها على مصفوفة وتتكاثر بعد البذر 3 إلى 5 أيام. لذلك، دائما إزالة شرائح الأبهري في الوقت المناسب. كإجراء احترازي الثانوي، وتغيير المتوسطة 2 بعد ساعات من إعادة -plating الخلايا على قارورة جديدة تساعد أيضا للقضاء على تلوث ممكن من الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء. ثانيا، هذه الخلايا يتم تربيتها في المختبر لمدة 7 - 10 أيام بعد العزلة. فمن الممكن أن الظواهر التي قد تكون مختلفة من الخلايا البطانية المعزولة حديثا. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا البطانية من نموذج الفأر من الدهون يتم تربيتها في البطانية المتوسطة نمو الخلايا دون تركيز عال من الدهون، فهي ليست معرضة للبيئة دهون الدم كما كانت في الحيوانات. الخلايا البطانية مثقف قد تتصرف بشكل مختلف من الخلايا البطانية المعزولة حديثا 8. وجود هذه المشكلة في جميع الخلايا الأولية في المختبر مثقف وخطوط الخلايا. إضافة مؤثرات المرضية في مستنبت لتقليد قد تكون البيئة في الجسم الحي حل.
الخلايا البطانية إثبات الظواهر المختلفة في فروع الأوعية الدموية مختلفة
e_content "> والأوعية الدموية هي بنية هرمية مكونة من الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية و، وعدم تجانس الخلايا البطانية الموجودة في" المناطق "محددة من الأوعية الدموية يلعب دورا كبيرا في خلق التنوع الوظيفي في 9،10 الأوعية الدموية. حتى في السرير الوعائي واحد، مثل الشريان الأورطي، وجود تجانس البطانية. تدفق رقائقي الدم مع إجهاد القص عالية في الجزء المستقيم من الشريان الأورطي يدفع البطانية سينسيز أكسيد النيتريك وthrombomodulin 11. لذلك، فإن الخلايا البطانية التي تتواجد في الجزء المستقيم الشريان الأبهر تثبت مكافحة تجلط الدم، ومكافحة المواد اللاصقة، وخصائص مضادة للالتهابات 12،13. وفي المقابل، تدفق الدم المضطرب في المناطق التي فرع الشرايين أو تتحول بشكل حاد (قوس الأبهر) يقلل البطانية التعبير أكسيد النيتريك سينسيز ويدفع الجينات تصلب الشرايين في البطانية الخلايا، أي بروتين-1 الوحيدات الكيميائي عوامل النمو المشتق من الصفيحات (MCP-1)، و (PDGFs)، مما أدى إلى الموالية للالتهابات وتصلب الشرايين النمط الظاهري البطانية 6. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا البطانية في الأوعية من كل جهاز تخضع التغييرات على التكيف التشريحية والوظيفية التي هي محددة لمهام هذا الجهاز في 14،15. ومع ذلك، هناك إجماع على أن علامات العديد من سطح الخلية والجينات الوظيفية والأنشطة الخلايا يمكن استخدامها لوصف نسب الخلايا البطانية. وتشمل هذه العلامات سطح الخلية صفائح الدم البطانية جزيء التصاق الخلية (PCAM-1، CD31)، عامل فون ويلبراند (VWF)، والأوعية الدموية غشائي كادهيرين (VE كادهيرين، CD144). وتشمل الجينات الوظيفية الأكثر استخداما البطانية سينسيز أكسيد النيتريك (أنوش) والأوعية الدموية غشائي عامل نمو مستقبلات (VEGFR). وتشمل أنشطة الخلية التي عادة ما ينظر في نسب الخلايا البطانية امتصاص ديل-AD-LDL وملزمة كتين، التي تشكل هياكل الحبل تشبه في المصفوفة.دلالة والمستقبلية تطبيقات الحزب الثوري المؤسسيخلايا ماري مثقف ماوس الأورطي غشائي
يتم استخدام الطريقة الموصوفة هنا لدراسة الخلايا البطانية الأوعية الكبيرة. وتكمن أهمية هذا البروتوكول هو أنه يوفر فرصة كبيرة لدراسة الأنشطة البطانية محددة من الجزيئات المستهدفة، ويمكن أن يتم ذلك في دور الستة عشر ونماذج الماوس المعدلة وراثيا، مما يجعلها مفيدة جدا في أبحاث القلب والأوعية الدموية. القدرة على النمو أعداد كبيرة من الماوس الخلايا البطانية الأورطي في ظل ظروف محددة يجعل هذه التقنية مثالية لتعريف أفضل للالظواهر وظائف البطانة. تحسن هذه التقنية من التطبيق العملي لاختبار إمكانات مستقبلية العلاج المبني على الخلايا البطانية في نماذج الفئران، إما عن طريق الحقن في الوريد أو engraftment من الخلايا البطانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
