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방법 논문

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

32.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52965

⸱

2016년 12월 19일

 ,  , 
1Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, 2Third Xiangya Hospital and the Institute of Vascular Disease and Translational Medicine, Central South University

이 논문에서

요약

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

초록

혈관 내피는 정상적인 혈관 항상성에 필수적입니다. 그 기능 장애는 다양한 심혈관 질환에 참여합니다. 마우스는 심혈관 질환 연구의 중요한 모델입니다. 본 연구는 특별한 장비 없이 쥐의 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 배양하는 간단한 방법을 보여줍니다. 내피 세포를 분리하기 위해 흉부 대동맥을 마우스 몸에서 빠르게 제거하고 부착된 지방 조직과 결합 조직을 대동맥에서 제거합니다. 대동맥은 1mm 고리로 자릅니다. 각 대동맥 고리를 열고 내피가 아래를 향하도록 하여 성장 인자 감소 매트릭스에 파종합니다. 세그먼트는 약 4일 동안 내피 세포 성장 배지에서 배양됩니다. 내피 발아는 빠르면 2일차부터 시작됩니다. 그런 다음 분절을 제거하고 세포가 합류점에 도달할 때까지 지속적으로 배양합니다. 내피 세포는 중성 단백질 분해 효소를 사용하여 수확하고 실험에 사용하기 전에 내피 세포 성장 배지에서 또 다른 두 계대 동안 배양됩니다. 면역형광 염색 결과, 두 번째 계대 후 대부분의 세포가 내피 세포의 전형적인 특성인 Dil-ac-LDL 흡수, 렉틴 결합 및 CD31 염색에 대해 이중 양성임을 나타냈습니다. 두 번째에서 세 번째 계대에 있는 세포는 내피 생물학을 연구하기 위한 시험관 내 및 생체 내 실험에 적합하다고 제안됩니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 특정 세포 및 분자 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

서론

혈관 내피 세포뿐만 아니라 혈액이나 조직을 분리하는 장벽 층, 그것은 400m2 (1)의 표면적 전체에 걸쳐 뻗어 혈관 트리 광대 내분비선 여겨진다. 내피의 복지는 혈관 항상성에 필수적이다. 역기능 내피는 동맥 경화증, 혈관염 및 허혈 / 재관류 손상 등 2-4 등 다양한 심혈관 질환에 참여하고 있습니다. 현재까지이 질환의 설정에 관련된 특정 세포 및 분자 메커니즘은 잘 의한 내피 세포의 확산 해부학 적 특성으로 이해되지 않습니다.

유전자 조작 기술은 다른 어떤 포유 동물 종에 비해 생쥐에서 개발되어 있기 때문에 마우스 연구의 중요한 모델이다. 대동맥의 작은 크기 enzymat하게 때문에 기본 쥐 대동맥 내피 세포의 분리는 특히 어려운 간주비현실적 내피 세포의 IC 소화. 일부는 분리 및 내장 컴퓨터가 5-7을 필요로 정화하는 과정을보고했다.

이 프로토콜의 목적은 특수한 장치를 사용하지 않고 마우스 대동맥 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 사용하는 것이다. 이 프로토콜에서 갓 격리 대동맥 작은 세그먼트로 절단 및 내피 세포 발아 수 있도록 아래로 향하게 내피 세포와 매트릭스에 시드. 세그먼트가 제거 된 후, 내피 세포는 내피 세포 선호 배지에서 확장되고 두 개 또는 세 개의 통로 후 실험에 대한 준비가되어 있습니다. 기술 된 방법의 이점은 그 1) 단일 대동맥 내피 세포 수확의 상당히 높은 수치; 2) 세포 생존 능력은 잘 보존된다 3) 특별한 장비 나 기술이 필요하지 않습니다. 이는 내피 세포의 병태 생리의 특정 세포와 분자 메카니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공한다. 홍보를 공부에 관심이있는 사람들을 위해어느 유전자 녹아웃 마우스에서 imary 배양 내피 세포, 유전자 녹아웃 생쥐 나 쥐 질병 모델이 프로토콜은 매우 유용하고 실천하기 쉽습니다.

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프로토콜

마우스에서 대동맥 1. 분리

여기에 설명 된 모든 절차가 웨인 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

  1. 마취 기계의 유도 챔버에 마우스를 넣습니다. 25 % 신선한 공기와 75 % O 2와 함께 4 %의 이소 플루 란 흐름을 설정합니다. 전용 코 콘 뒤에 유도 챔버를 통해 25 %의 신선한 공기와 75 % O 2와 함께 이소 플루 란 (유도 4 %가 유지 보수를 위해 ± 1.0 %)의 흡입에 의해 마우스를 마취. 주 : 이소 플루 란 마취 75 % 산소 / 25 % 공기, 100 % 산소로 전달 될 수있다.
  2. 마취의 적절한 수준 (발가락 핀치에 철수의 부족)에 도달 할 때까지 마우스마다 5 분을 확인합니다.
  3. 유도 챔버에서 마우스를 가지고 마취 기계에 연결되어있는 전용 코 콘하지만 이소 플루 란 흡입을 계속합니다. 스위치이소 플루 란 마취를 유지하기 위해 1 % 흐른다.
  4. 이 마취이지만, 그 뒷면에 위치하는 수술 패드에 마우스를 넣어. 사지를 확보하기 위해 실험실 테이프를 사용합니다.
  5. 마우스 따뜻하게 유지하기 위해 가열 램프를 사용합니다. 마우스를하지 않습니다 과열 있도록 마우스에서 적절한 거리에 램프를 유지합니다.
  6. 70 % 에탄올로 가슴 스프레이.
  7. 정중선에서 복부를 열고 복부 대동맥을 노출 해부 가위를 사용합니다. 흉강을 열고 심장과 폐를 노출합니다.
  8. 피를 해제 해부 가위로 중간에서 복부 대동맥을 잘라.
  9. 헤파린 1000 U / mL로 포함하는 PBS 1 mL를 (25 G 바늘) 1 ML의 주사기를 입력합니다. 좌심실에 헤파린 1000 U / mL로 포함 된 PBS를 주입하고 대동맥을 관류. 흉부 대동맥을 노출 마우스의 오른쪽에 큰 동맥에서 집게로 심장과 폐를 밀어 넣습니다.
  10. 신속 마이크로 다이를 사용하여 대동맥을 제거ssection 집게와 얼음처럼 차가운 1X PBS (멸균)에 넣어은 다음 층류 후드에 컨테이너를 운반 할 것.
  11. 대동맥의 한쪽 끝으로 25 G 바늘 장착 된 1 ML의 주사기를 삽입하고 부드럽게 혈액을 제거하는 얼음처럼 차가운 PBS와 대동맥을 세척하십시오.
  12. 가능한 한 첨부 된 지방 조직의 훨씬 작은 측면 혈관을 제거하기 위해 마이크로 해부 집게를 사용합니다.
  13. 즉시 성장 배지 내피 대동맥 옮긴다.
  14. 멸균 메스 블레이드를 사용하여 1mm 반지로 대동맥을 잘라. 수확 약 8 - 대동맥 당 10 반지입니다.
  15. 마이크로 해부 가위를 사용하여 각 대동맥 고리를 엽니 다.

2. 종자 매트릭스의 대동맥 세그먼트

  1. 사용하지 않을 응고 방지 -20 ° C에서 성장 인자 - 감소 된 매트릭스를 유지하는 경우. 완전한 해빙을 허용하기 위해 적어도 하룻밤 4 ° C에서 성장 인자 감소 행렬을 넣습니다.
  2. 적어도 -20 ℃로 6 웰 플레이트 및 피펫 팁을 사전 냉각10 분. 공기 방울을 도입하지 않고 행렬의 1 mL를 플레이트의 얼음과 코트에 잘 하나를 6 웰 플레이트를 넣습니다. 20 분 행렬이 응고 할 수 있도록하기위한 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다.
  3. 멸균 미세 해부 집게를 사용하여 응고 매트릭스 상 대동맥 개 임플란트. 내피를 건드리지 않고 루멘 측 다운 행렬에이 조각을 놓습니다. 매트릭스에 서로에 가까운 4 대동맥 세그먼트 - 3를 배치합니다.
  4. (~ 200 μL) 젖은 세그먼트를 유지하기 위해 충분한 내피 세포 성장 매체를 추가합니다.
  5. 4 ~ 6 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 접시를 품어. 하루가 끝날 때, 대동맥 세그먼트를 커버하도록 충분한 매체를 추가한다.
  6. 위상 대비 현미경으로 주기적으로 돋아 대동맥 세그먼트를 관찰한다. 중간 수준 및 세포 성장 매일 확인합니다. 적용 대동맥 세그먼트를 유지하기 위해 필요한 경우 매체를 추가합니다.
  7. 4 번째 날, 부드럽게 매체를 제거하고 대동맥 세그먼트 (F)을 제거성장 내피 세포의 중단없이 멸균 바늘을 사용하여 매트릭스 ROM.
  8. 새로운 내피 세포 성장 배지 2 mL를 넣고과 내피 세포가 2 매트릭스 증식을 계속 허용 - 삼일.

마우스 대동맥 내피 세포의 3. 초기과 Passaging

  1. 젤라틴 코트 (0.1 %)로 새로운 T12.5 플라스크를 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
  2. 멸균 37 ° C PBS로 조심스럽게 매트릭스 판을 씻으십시오.
  3. 매트릭스 판에 중립 단백질 분해 효소 (50 U / ㎖)의 2 mL를 넣고 가끔 흔들어와 플랫폼 로커에 실온에서 품어. 세포의 대부분이 분리되어 있는지 확인하기 위해 위상차 현미경으로 세포를 확인합니다.
  4. 중립 단백질 분해 효소를 불 활성화 D-발 2 ML을 추가합니다.
  5. 15 mL의 원심 분리기 튜브에 조심스럽게 상층 액을 수집합니다. 2 mL의 D-발과 접시를 씻고 뜨는를 수집합니다.
  6. 타나에서 5 분 동안 900 XG에 세포 현탁액을 원심m 온도.
  7. 젤라틴으로 코팅 T12.5 플라스크 내피 세포 성장 배지 플레이트 4 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 2 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션.
  8. 매체를 교체합니다. 90 % 합류 -가 85 %가 될 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션.

마우스 대동맥 내피 세포의 (4)과 Passaging

  1. 코트 두 개의 새로운 T12.5 플라스크는 젤라틴 (0.1 %)로, 30 분 동안 37 ° C에서 품어. 약 15 분 동안 37 ℃에서 예열 트립신 - EDTA (0.25 % 트립신, PBS 0.02 EDTA) 및 멸균 PBS.
  2. 멸균 37 ° C PBS로 조심스럽게 세포를 씻으십시오.
  3. 트립신 - EDTA (0.25 % 트립신, PBS 0.02 EDTA) 0.5 mL를 추가하고 ~ 1 분 또는 세포의 대부분이 라운드를 설정할 때까지 37 ° C에서 품어.
  4. 소화를 중지 내피 세포 성장 매체의 2 ML을 추가합니다. 위아래로 수회 플라스크 내의 세포 현탁액 피펫. 필요한 경우, 셀을 사용세포를 수집하는 스크레이퍼.
  5. 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집한다. 실온에서 5 분 동안 900 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
  6. 젤라틴으로 코팅이 T12.5 플라스크 내피 세포 성장 배지 플레이트 4 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 2 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션.
  7. 매체를 교체합니다. 90 % 합류 -가 85 %가 될 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션.
  8. 3 통로 -이 후 마우스 대동맥 내피 세포를 사용합니다.

마우스 대동맥 내피 세포의 5. 특성

  1. 다시 플레이트 세포.
    1. 젤라틴 코트 (0.1 %)을 6- 웰 플레이트는 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. PBS와 함께 접시를 씻어.
    2. 사전 가열 약 15 분 동안 37 ° C에 트립신 - EDTA 및 멸균 PBS를.
    3. 멸균 PBS 3 회 세포를 씻으십시오. 세포에 0.5 트립신의 용액이 / EDTA를 추가, 37 ° C 오에 ~ 1 분 동안 품어세포의 대부분까지 r은 라운드를 켭니다.
    4. 소화를 중지 내피 세포 성장 매체의 2 ML을 추가합니다. 위아래로 수회 플라스크 내의 세포 현탁액 피펫. 필요한 경우, 세포를 수집하고 세포 스크레이퍼를 사용한다.
    5. 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집한다. 실온에서 5 분 동안 900 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
    6. 내피 세포 성장 배지에서 세포를 다시 일시 중지, 상층 액을 버린다. 잘 3 × 10 5 /의 밀도에 젤라틴으로 코팅 된 6 웰 플레이트에서 세포를 시드.
    7. 세포 배양 표면에 부착 할 수 있도록 밤새 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션.
  2. DIL-AC-LDL 바인딩 -lectin uptaken 및 Ulex.
    1. 의 1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3- '를 저장 3'- tetramethylindo - 카보시 과염소산 염 표지 -20 ° C에서 아세틸 화 LDL (DIL-AC-LDL). 염색하기 전에 얼음에 DIL-AC-LDL을 해동. 주식 DIL-AC-LDL의 SOLU기는 / mL의 1 밀리그램이다. 4 ° C에서 FITC 표지 Ulex의 europaeus의 응집소 (Ulex -Lectin, 1 μg의 / ㎖)를 저장합니다. 주식 Ulex -Lectin 솔루션은 1 ㎎ / ㎖이다. 저장 4 ° C에서의 Hoechst 33342. 주식의 Hoechst 33342 솔루션은 100 μg의 / mL로한다.
    2. 10 μg / ML의 최종 농도를 만들어 배지 1 ㎖에 DIL-AC-LDL 스톡 용액 10 μL를 추가한다.
    3. 염색하기 전에, 구 배지를 제거하고 새로운 배지를 각 웰에 세포를 세척 하였다.
    4. 새로운 매체를 제거하고 DIL-AC-LDL 염색 매체를 추가 할 수 있습니다.
    5. 1 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션.
    6. 멸균 1X PBS 3 회 세포를 씻으십시오.
    7. 세포를 해결하기 위해 10 % 포르말린 1 ML을 추가합니다. 약 30 분 동안 실온에서 접시를 넣습니다.
    8. 멸균 1X PBS 3 회 세포를 씻으십시오. 빛을 피하십시오.
    9. Ulex -Lectin 10 μL를 포함 1 mL의 멸균 1X PBS를 추가합니다.
    10. 객실 temperatu에서 세포를 품어1 시간 동안 어둠 속에서 재.
    11. 멸균 1X PBS 3 회 세포를 세척하여 Ulex-렉틴을 제거합니다.
    12. 1 μg의 / ㎖의 최종 농도 훽스트 33342를 추가 어둠 속에서 10 분을 품어.
    13. DIL-AC-LDL (빨강, 576 나노 미터의 여기 파장), Ulex -Lectin (녹색, 519 나노 미터의 여기 파장) 및 훽스트의 형광보기 (파란색, 361 나노 미터의 여기 파장) 거꾸로 형광 현미경.
  3. CD31, VEGFR2, eNOS에 대한 형광 염색, VE-cadherin의 및 Calponin합니다.
    1. 스토어 FITC 접합 항 - 마우스 CD31 항체, eNOS의 항체, VE-cadherin의의 4 ° C에서 항체, FITC 접합 항 - 토끼 IgG를을 어두운. -20 ° C에 보관 VEGFR2 항체.
    2. 멸균 1X PBS 3 회 세포를 씻으십시오.
    3. 세포를 해결하기 위해 10 % 포르말린 1 ML을 추가합니다. 약 30 분 동안 실온에서 접시를 넣습니다.
    4. 멸균 1X PBS 3 회 세포를 씻으십시오.
    5. CD31 얼룩하려면 1 mL의 멸균 1 배를 추가CD31-FITC 항체의 10 μL를 포함 PBS. 각각-VE cadherin의 또는 차 항체 calponin, 얼룩 하나 VEGFR2은 이노스는-VE cadherin의 또는 calponin, VEGFR2, eNOS의 4 μL를 포함 멸균 1X PBS의 1 mL를 넣어합니다.
    6. 어둠 속에서 1 시간 동안 얼음에 세포를 품어.
    7. 멸균 PBS 3 회 세포를 세척하여 항체를 제거합니다.
    8. VEGFR2의 염색을 위해 이노스는, VE-cadherin의 또는 calponin, FITC 접합 된 항 - 토끼 IgG를 10 μL를 포함 멸균 1X PBS의 1 mL를 넣어. 어둠 속에서 1 시간 동안 얼음에 세포를 품어. 멸균 PBS 3 회 세포를 세척하여 IgG를 제거합니다.
    9. 1 μg의 / ㎖의 최종 농도 훽스트 33342를 추가 어둠 속에서 10 분을 품어.
    10. CD31, VEGFR2 이노스의 형광보기, VE-cadherin의 반전 형광 현미경, calponin (녹색, 518-535 나노 미터의 여기 파장) 및 훽스트 (파란색, 361 나노 미터의 여기 파장은).

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결과

내피 세포 돋

자연 내피 세포는 마우스 대동맥 세그먼트에서 시작 발아. 마우스 대동맥 세그먼트는 4 일 동안 내피 세포 성장 배지에서 성장 인자 - 감소 된 매트릭스에서 성장시켰다. 4 일 - 내피 세포의 발아는 보통 2에 나타납니다. 현미경은 4 일 (그림 1)에 촬영했다. 사진에 나타낸 바와 같이, 다수의 내피 세포 떨어진 부분에서 이동한다. 새로 형성된 콩나물 세그먼트와 지점에서 확장하는 것을 계속한다.

내피 세포 표현형

이 세포는 초기 통로 (그림 2A) 후 스핀들 모양과 조약돌 같은 모습을 보여 주었다. 부착 된 세포를 DIL-AC-LDL로 1 시간 Ulex -Lectin로 표지 하였다. 도 2b 내지도 2e에

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토론

이 연구는 특별한 장비없이 마우스 대동맥에서 세포를 분리 및 배양 내피하는 간단한 방법을 보여줍니다. 면역 염색 세포의 대부분이 제 2 통로 후 내피 세포이었던 것으로 나타났다. 제 3 통로에 두 번째의 세포는 시험 관내 및 내피 세포 생물학을 연구하는 생체 실험에 적합한 것이 좋습니다.

이 의정서에서 키 노트

절차에 오 중요한 포인트가 있습니다. 우선, 혈관 내강 내피 세포 활성화 및 혈전 형성을 최소화하기 위해 PBS 함유 헤파린 플러싱된다. 둘째, 심장 정지 및 매트릭스 상 대동맥 세그먼트의 시드들 사이의 시간은 내피 세포의 생존에 중요하다. 요정 - 동맥 지방 조직과 결합 조직을 삭제하는 동안, 대동맥 스트레칭 방지하고 10이 단계에 소요되는 시간 제한 - 15 분. 셋째, 부어그들은 접종 후 충분한 미디어 세그먼트를 커버합니다. 너무 많은 미디어가 대동맥...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국심장협회 과학자 개발 보조금 13SDG16930098 및 중국 국가과학재단 청소년상 81300240(PI: Wang)의 지원을 받았습니다. 원고 준비에 도움을 주신 Wayne State University의 Roberto Mendez에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4주 또는 6주 된 생쥐Jackson Laboratory#000664
멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)Gibco#10010-023
멸균 1x PBS 1,000U/mL의 헤파린을 함유Sigma AldrichH3149
내피 세포 성장 배지(Dulbeccos' 변형된 독수리' s 미디엄 [DMEM] with 25  mM HEPES [Gibco, #12320-032], 100  보충; &뮤; 소 신경 조직에서 g/mL 내피 세포 성장 보충제 [ECGS, Sigma, #2759], 10% 소 태아 혈청 [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000  U/mL 헤파린 [Sigma Aldrich, H3149], 10,000  U/mL 페니실린 및 10  mg/mL 스트렙토마이신 [Gibco, #15140-122])
성장 인자 감소 매트릭스BD Biosciences356231
중성 단백질 분해 효소 (Dispase, 1  U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) 및 D-Val 배지(D-Valine, 0.034  g/L, Sigma, #1255), Dulbeccos의 변형된 독수리' s 매체, 저포도당 (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)Life TechnologiesL3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)SigmaL9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibodyBD Biosciences553372
안티 마우스 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 항체세포 신호9698
안티 마우스 내피 산화 질소 합성효소Abcamab5589
안티 마우스 혈관 내피 - cadherinAbcam33168
안티 마우스 칼포닌Abcam700
FITC-conjugated anti-rabbit IgGSigmaF6005
1 mL 주사기, 25-G 니들 FisherScientific50-900-04222
100 mm Peri 접시Fisher Scientific07-202-516
6웰 세포 배양 플레이트Fisher Scientific08-772-1B
T12.5 배양 플라스크Fisher Scientific50-202-076
가위, 집게, 현미해부 가위 및 집게, 메스 칼날Fine Science Tools, Inc.
마취 기계 isoflurane웹스터 수의학 공급07-806-3204
가열 램프
원심 분리기 기계
반전 위상차 현미경
반전 형광 현미경
한

참고문헌

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