Introduction
Het vasculaire endotheel is niet alleen een barrièrelaag die bloed en weefsel scheidt, wordt het beschouwd als een grote endocriene klier die zich uitstrekt over de gehele vaatstelsel met een oppervlakte van 400 vierkante meter 1. Het welzijn van het endotheel essentieel vasculaire homeostase. Disfunctionele endotheel participeert in diverse cardiovasculaire aandoeningen, zoals atherosclerose, vasculitis en ischemie / reperfusie letsel, etc. 2-4. Tot op heden worden de specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij deze ziekte instellingen niet goed begrepen als gevolg van de diffuse anatomische aard van het endotheel.
De muis is een belangrijk model voor het onderzoek, omdat genetische manipulatie technieken zijn meer ontwikkeld in muizen dan in elke andere zoogdiersoorten. Echter de isolatie van primaire muis endotheelcellen als bijzonder moeilijk omdat de geringe omvang van de aorta maakt enzymatic vertering van endotheel onpraktisch. Verklaarden sommige procedures voor het isoleren en zuiveren EC vereist 5-7.
Het doel van dit protocol is een eenvoudige methode te isoleren en te expanderen endotheliale cellen van de muis aorta zonder speciale apparatuur. In dit protocol wordt de vers geïsoleerde aorta in kleine segmenten en gezaaid op een matrijs met het endothelium naar beneden om voor endotheliale kiemen. Na segmenten worden verwijderd, worden endotheelcellen uitgebreid in-endotheel voorkeur medium en zijn klaar voor experimenten na twee of drie passages. De voordelen van de beschreven werkwijze zijn de volgende: 1) aanzienlijk hoge aantallen endotheelcellen worden geoogst van een aorta; 2) levensvatbaarheid van de cellen is goed bewaard gebleven; en 3) geen speciale uitrusting of techniek nodig. Het een effectief middel van het identificeren van specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen endotheelcellen pathofysiologie. Voor degenen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van zijn primary gekweekte endotheelcellen van ofwel gen knock-out muizen, gen knock-in muizen of muizen ziekte model, dit protocol is erg handig en makkelijk om te oefenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van Aorta van Muizen
Al de hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Wayne State University.
- Zet de muis in de inductie kamer van het anesthesieapparaat. Stel de isofluraan stroom naar 4% samen met 25% verse lucht en 75% O2. Verdoven van de muis door inademing van isofluraan (4% voor inductie, ± 1,0% voor het onderhoud) in combinatie met 25% lucht fris en 75% O 2 via inductie kamer, gevolgd door een speciale neuskegel. LET OP: anesthesie met isofluraan kan worden geleverd in 75% zuurstof / 25% lucht of in 100% zuurstof.
- Controleer de muis om de 5 min tot het juiste niveau van de anesthesie wordt bereikt (gebrek aan terugtrekking tot teen knijpen).
- Neem de muis uit de inductie kamer en blijven isofluraan inhalatie echter de speciale neuskegel die is aangesloten op het anesthesieapparaat. Schakel deisofluraan stroom naar 1% anesthesie te handhaven.
- Hoewel het onder narcose, zet de muis op een operatie pad, gepositioneerd op zijn rug. Gebruik laboratorium tape om de ledematen te beveiligen.
- Gebruik een warmtelamp om de muis te warm te houden. Houd de lamp in een redelijke afstand van de muis, zodat de muis zal niet oververhitting.
- Spray de borst met 70% ethanol.
- Gebruik dissectie schaar om de buik te openen vanaf de middellijn, en bloot de abdominale aorta. Open de borstholte bloot en het hart en de longen.
- Snijd de aorta abdominalis in het midden met dissectie schaar om het bloed vrij.
- Vul een 1 ml spuit (25 G naald) met 1 ml PBS dat 1000 U / ml heparine. Injecteer PBS dat 1000 U / ml heparine aan de linkerventrikel en de aorta perfuseren. Duw het hart en de longen met een pincet in de grote slagaders naar de rechterkant van de muizen om de thoracale aorta bloot.
- Snel verwijderen van de thoracale aorta met behulp van micro-dissection tang en zet het in ijskoud 1x PBS (steriele), dan is de container te vervoeren in een laminaire luchtstroom kap.
- Plaats een 1 ml injectiespuit voorzien van 25 G naald in een uiteinde van de aorta, en voorzichtig spoel de aorta met ijskoude PBS om het bloed te verwijderen.
- Gebruik micro-dissectie tang om zoveel mogelijk van de bijgevoegde vetweefsel en kleine zijdelingse vaartuigen af mogelijk.
- Onmiddellijk over de aorta endotheel groeimedium.
- Snijd de aorta tot 1 mm ringen met een steriele scalpel. Harvest ongeveer 8 - 10 ringen per aorta.
- Open elke ring aorta met een paar micro-dissectie schaar.
2. Zaad van de Aorta segmenten op Matrix
- Wanneer niet in gebruik, houdt de groeifactor gereduceerde matrix -20 ° C om stolling te voorkomen. Zet de groeifactor gereduceerde matrix 4 ° C ten minste gedurende de nacht volledig ontdooien toe.
- Voorkoelen een 6-wells plaat en pipetpunten tot -20 ° C gedurende ten minste10 minuten. Zet de 6-wells plaat op het ijs en de vacht een putje van de plaat met 1 ml matrix zonder dat er eventuele luchtbellen. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 20 minuten om de matrix te stollen.
- Implanteer de aorta stukken op de gestolde matrix steriele micro-dissectie pincet. Leg de stukken lumen-side-down op de matrix zonder het aanraken van het endotheel. Place 3-4 aorta segmenten dicht bij elkaar op de matrix.
- Voeg net genoeg endotheliale celgroei medium aan segmenten natte (~ 200 pi) te houden.
- Incubeer de plaat bij 37 ° C onder 5% CO2 gedurende 4 tot 6 uur. Aan het eind van de dag precies zoveel medium om de aorta segmenten bestrijken.
- Houd u aan de aorta-segment kiemen periodiek onder een fasecontrastmicroscoop. Controleer gemiddeld niveau en de celgroei elke dag. medium toe te voegen indien nodig aorta segmenten bedekt te houden.
- Op de 4e dag, verwijder voorzichtig de medium en verwijder de aorta segmenten from de matrix met behulp van een steriele naald zonder onderbreking van de groeiende endotheelcellen.
- Voeg 2 ml van nieuwe endotheliale celgroei medium en laat de endotheelcellen blijven prolifereren op matrijs van 2 - 3 dagen.
3. Eerste Passage van de muis endotheelcellen
- Coat nieuw T12.5 kolf met gelatine (0,1%), incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Was de platen matrix zorgvuldig met steriel 37 ° C PBS.
- Voeg 2 ml neutraal protease (50 U / ml) aan de matrix platen en incubeer bij kamertemperatuur op platform rocker met af en toe schudden. Controleer de cellen onder een fase-contrast microscoop om ervoor te zorgen dat de meerderheid van de cellen worden losgemaakt.
- Voeg 2 ml D-Val de neutrale protease te inactiveren.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof voorzichtig in een 15 ml centrifugebuis. Was de plaat met 2 ml D-Val en het verzamelen van de bovenstaande vloeistof.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 900 xg gedurende 5 minuten bij room temperatuur.
- Resuspendeer de celpellet in 4 ml van endotheliale celgroei medium en plaat het T12.5 kolf bekleed met gelatine. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 uur.
- Vervang het medium. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 totdat ze 85% - 90% confluent.
4. Passage van de muis endotheelcellen
- Laag twee nieuwe T12.5 flessen met gelatine (0,1%), incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Voorverwarmen trypsine-EDTA (0,25% trypsine, 0,02 EDTA in PBS) en steriel PBS bij 37 ° C gedurende ongeveer 15 minuten.
- Was de cellen voorzichtig met steriel 37 ° C PBS.
- Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA (0,25% trypsine, 0,02 EDTA in PBS) en incubeer bij 37 ° C gedurende ~ 1 minuut of totdat de meeste cellen ronddraaien.
- Voeg 2 ml van endotheliale celgroei medium om de destructie te stoppen. Pipet de celsuspensie op en neer binnen de kolf meerdere malen. Gebruik indien nodig een celschraper om de cellen te verzamelen.
- Verzamel de celsuspensie in een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 900 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de celpellet in 4 ml van endotheliale celgroei medium en plaat 2 T12.5 flessen bekleed met gelatine. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 uur.
- Vervang het medium. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 totdat ze 85% - 90% confluent.
- Gebruik de muis endotheelcellen na 2-3 passages.
5. Analyse van de muis endotheelcellen
- Re-bord van de cellen.
- Coat een 6-wells plaat met gelatine (0,1%), incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Spoel de plaat met PBS.
- Verwarm de trypsine-EDTA en steriele PBS tot 37 ° C gedurende ongeveer 15 minuten.
- Was de cellen met steriel PBS 3 keer. Voeg 0,5 ml trypsine / EDTA aan de cellen geïncubeerd ~ 1 min bij 37 ° C or totdat het merendeel van de cellen ronddraaien.
- Voeg 2 ml van endotheliale celgroei medium om de destructie te stoppen. Pipet de celsuspensie op en neer binnen de kolf meerdere malen. Indien nodig een celschraper om de cellen te verzamelen.
- Verzamel de celsuspensie in een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 900 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in endotheliale celgroei medium. Zaad de cellen in 6-well plaat gecoat met gelatine aan de dichtheid van 3 x 10 5 / putje.
- Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 om de cellen te hechten aan het kweekoppervlak.
- Dil-ac-LDL uptaken en Ulex -lectin bindend.
- Bewaar de 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo carbocyanine-perchloraat gelabelde geacetyleerde LDL (Dil-Ac-LDL) bij -20 ° C. Voordat kleuring, ontdooien Dil-ac-LDL op ijs. De voorraad Dil-ac-LDL solutie is 1 mg / ml. Bewaar de FITC-gelabelde Ulex europaeus agglutinine (Ulex -Lectin, 1 ug / ml) bij 4 ° C. De voorraad Ulex -Lectin oplossing is 1 mg / ml. WINKEL Hoechst 33342 bij 4 ° C. De voorraad Hoechst 33342 oplossing is 100 ug / ml.
- Voeg 10 ul van Dil-Ac-LDL stockoplossing aan 1 ml kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml te maken.
- Voorafgaand aan kleuring, verwijder de oude medium en was de cellen in elk putje met een nieuw medium.
- Haal het nieuwe medium en voeg de Dil-ac-LDL kleuring medium.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 1 uur.
- Was de cellen met steriel 1x PBS 3 keer.
- Voeg 1 ml 10% formaline om de cellen te repareren. Plaats de plaat kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min.
- Was de cellen met steriel 1x PBS 3 keer. Vermijd licht.
- Voeg 1 mL steriel 1x PBS dat 10 pi van Ulex -Lectin bevat.
- Incubeer de cellen bij kamertemperatuur temperatuopnieuw in het donker gedurende 1 uur.
- Verwijder de Ulex-lectine door de cellen te wassen met steriele PBS 1x 3 keer.
- Voeg Hoechst 33342 tot een eindconcentratie van 1 ug / ml, incubeer 10 minuten in het donker.
- Bekijk de fluorescentie van Dil-Ac-LDL (rood, excitatiegolflengte van 576 nm), Ulex -Lectin (groen, excitatiegolflengte van 519 nm) en Hoechst (blauw excitatie golflengte van 361 nm) met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
- Fluorescerende kleuring voor CD31, VEGFR2, eNOS, VE cadherine en calponine.
- WINKEL FITC-geconjugeerd anti-muis CD31 antilichaam, eNOS antilichaam, VE-cadherine antilichaam FITC-geconjugeerd anti-konijnen IgG bij 4 ° C in het donker. WINKEL VEGFR2 antilichaam bij -20 ° C.
- Was de cellen met steriel 1x PBS 3 keer.
- Voeg 1 ml 10% formaline om de cellen te repareren. Plaats de plaat kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min.
- Was de cellen met steriel 1x PBS 3 keer.
- Om CD31 vlekken, voeg 1 ml steriel 1xPBS dat 10 pl CD31-FITC antilichaam bevat. Om vlekken hetzij VEGFR2, eNOS, VE-cadherine of calponine, voeg 1 ml steriel 1x PBS dat 4 pl VEGFR2, eNOS bevat, VE-cadherine of calponine primaire antilichaam, respectievelijk.
- Incubeer de cellen op ijs gedurende 1 h in het donker.
- Verwijder de antilichamen door de cellen te wassen met steriele PBS 3 keer.
- Voor de kleuring van VEGFR2, eNOS, VE-cadherine of calponine, voeg 1 ml steriel PBS dat 1 x 10 pl FITC-geconjugeerd anti-konijn-IgG bevat. Incubeer de cellen op ijs gedurende 1 h in het donker. Verwijder de IgG door de cellen te wassen met steriele PBS 3 keer.
- Voeg Hoechst 33342 tot een eindconcentratie van 1 ug / ml, incubeer 10 minuten in het donker.
- Bekijk de fluorescentie van CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherine calponine (groen, excitatie golflengte van 518-535 nm) en Hoechst (blauw, excitatie golflengte van 361 nm) met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotheelcellen Kiemen
Spontane endotheelcellen kiemen gestart vanuit een muis aorta segment. De muisaorta segment liet men groeien op een groeifactor gereduceerde matrix dan in endotheliale celgroei medium voor 4 dagen. De endotheelcellen kiemen verschijnt meestal in 2-4 dagen. Microfoto's werden genomen op dag 4 (Figuur 1). Zoals getoond in de foto's, talrijke endotheelcellen migreren van het segment. De nieuw gevormde spruiten blijven uitstrekken van het segment en de tak.
Endotheelcellen Fenotypes
Deze cellen aangetoond spoelvormige en geplaveide-achtige optredens na de eerste passage (Figuur 2A). De gehechte cellen werden gemerkt met Dil-Ac-LDL en Ulex -Lectin een uur. Zoals getoond in Figuren 2B-2E meeste cellen dubbele positief voor Dil-Ac-LDL opname (rood) en Ulex -Lectin binding (groen). Ondertussen, na de tweede doorgang, meer dan 95% van de cellen positief voor bloedplaatje endotheliale celadhesiemolecule 1 (CD31, PECAM-1, figuur 2F) waren, VEGFR2 (figuur 2G), VE-cadherine (Figuur 2H), eNOS ( figuur 2I) maar negatief voor calponine (figuur 2J), een gladde spiercel marker.
Figuur 1. endotheelcellen Sprouting. aortasegment muis werd gezaaid groeifactor gereduceerde matrix en gekweekt in endotheelcellen groeimedium. Endotheelcellen kiemen al op dag 2 (A, bar = 100 urn) gestart en verhoogd in de volgende 2-3 dagen (B, C, bar = 100 urn). Het segment werd verwijderd op dag 4 (D, bar = 500 pm).
Figuur 2. endotheelcellen fenotypes. De bijgevoegde cellen weer te geven spoelvormige en geplaveide-achtige verschijningen (A, bar = 100 micrometer), dubbel-positieve fluorescentie van Dil-ac-LDL en Ulex -Lectin (BE, bar = 100 pm). Ondertussen bloedplaatje endotheliale celadhesiemolecule 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-cadherine eNOS waren positief in> 95% van de cellen na de tweede doorgang (FI, bar = 100 urn) De meeste van de cellen waren negatief voor calponine kleuring, die een gladde spiercel marker (J, bar = 100 urn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie toont een eenvoudige methode om te isoleren en cultuur endotheliale cellen van een muis aorta zonder speciale apparatuur. De immunofluorescentie kleuring gaf aan dat de meerderheid van de cellen endotheliale cellen na de tweede doorgang. Er wordt gesuggereerd dat cellen in tweede tot derde doorgang geschikt voor in vitro en in vivo experimenten endothele studie biologie.
De Key Notes from the Present Protocol
Er zijn vijf belangrijke punten in de procedure. Eerst wordt het vasculaire lumen gespoeld met PBS met heparine endotheliale celactivering en stolselvorming minimaliseren. Ten tweede, de tijd tussen hartstilstand en het zaaien van aortasegment op matrix is kritisch voor endotheel levensvatbaarheid. Bij het wissen van de peri-arteriële vetweefsel en bindweefsel, voorkomen uitrekken van de aorta en de tijd besteed aan deze stap te 10 beperken - 15 min. Ten derde, gietmedia net genoeg om de segmenten bedekken nadat ze zijn geënt. Teveel media zal de aorta segmenten te zweven. Ten vierde, het kweekmedium bevat een hoge concentratie van endotheliale celgroei te vullen, waardoor endotheliale cellen groeien veel sneller dan wanneer gekweekt in groeimedium endotheliale-2. De uitgroei van endotheliale cellen te onderdrukken andere celtypen, zoals gladde spiercellen en fibroblasten. Ten vijfde, de timing aortasegment van matrix verwijderen is ook kritisch om de zuiverheid van endotheelcellen. Deze stap voorkomt vervuiling van fibroblasten en gladde spiercellen. Het segment moet worden verwijderd voordat de ontwikkeling van het buizennetwerk. Latere verwijdering van aortasegment zal leiden tot verontreiniging van andere celtypes, zoals fibroblasten of gladde spiercellen. Let op dat deze benadering ook gebruikt om angiogenese in vitro en de vorming van capillaire structuren geeft angiogenese capaciteit van de aorta segment. Op basis van onze experience, indien de segmenten worden na de capillaire structuur volledig ontwikkelt, de incidentie van gladde spiercellen verontreiniging drastisch. Daarom vinden wij dat de beste tijdstip te verwijderen het segment is wanneer het netwerk begint zichtbaar te zijn, maar is niet volledig ontwikkeld. Zo kunnen we zoveel endotheelcellen mogelijk terwijl contaminatie door gladde spiercellen tot een minimum te oogsten.
De beperkingen van het huidige protocol
Er zijn enkele beperkingen van de beschreven werkwijzen. Ten eerste zijn er kansen van verontreiniging van fibroblasten en gladde spiercellen, indien de aorta segmenten niet worden verwijderd voordat buis te ontwikkelen. De fibroblasten of gladde spiercellen kan gaan hechten aan de matrix en prolifereren 3 tot 5 dagen na het zaaien. Daarom is altijd de aorta segmenten te verwijderen in een tijdige wijze. Subsidiair voorzorg waarbij het medium 2 uur na re -plating de cellen op een nieuwe kolf helpt ook om de mogelijke verontreiniging van fibroblasten en gladde spiercellen elimineren. Ten tweede, deze cellen gekweekt in vitro gedurende 7-10 dagen na isolatie. Het is mogelijk dat hun fenotypes verschillen van vers geïsoleerde endotheliale cellen zijn. Bijvoorbeeld, als de endotheelcellen van een muismodel van hyperlipidemie gekweekt in endotheliale celgroei medium zonder een hoge concentratie van lipiden, zij worden niet blootgesteld aan de omgeving hyperlipidemische als in dieren waren. De gekweekte endotheelcellen kunnen zich anders gedragen uit vers geïsoleerde endotheelcellen 8. Dit probleem bestaat in alle in vitro gekweekte primaire cellen en cellijnen. Toevoegen van de pathologische stimuli in het kweekmedium te bootsen de in vivo omgeving kan een oplossing zijn.
Endotheliale cellen vertonen verschillende fenotypes in verschillende Vascular Branches
e_content "> Het vasculaire systeem is een hiërarchische structuur bestaande uit slagaders, aders en haarvaten. De heterogeniteit van endotheelcellen die in de specifieke" gebieden "van bloedvaten bevinden speelt een grote rol bij de opbouw functionele diversiteit in het vaatstelsel 9,10. zelfs in één vaatbed, zoals de aorta, endotheliale heterogeniteit bestaat. laminaire bloedstroom met hoge schuifspanning in het rechte deel van de aorta induceert endotheel stikstofoxide synthase en trombomoduline 11. Derhalve endotheelcellen die zich in het rechte deel van de aorta tonen anti-stollingsmiddel, anti-kleefmiddel, en anti-inflammatoire eigenschappen 12,13. daarentegen turbulente bloedstroom in gebieden waar bloedvaten branch of scherpe bocht (aortaboog) vermindert endotheel stikstofoxide synthase induceert expressie en atherogene genen in endotheliale cellen, dwz de monocyt chemotactisch eiwit-1 (MCP-1) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactoren (PDGF), Wat resulteert in een pro-inflammatoire en atherosclerotische endotheliaal fenotype 6. Bovendien, endotheelcellen in de bloedvaten van elk orgaan ondergaan anatomische en functionele adaptieve veranderingen die specifiek zijn voor dat orgaanfuncties 14,15 zijn. Toch is er een consensus dat verschillende celoppervlak markers, functionele genen en celactiviteiten kan worden gebruikt om karakteriseren endotheliale cellijn. Deze celoppervlak merkers omvatten Platelet endotheel adhesiemolecuul (PCAM-1, CD31), von Willebrand factor (vWF), Vasculaire Endotheliale-cadherine (VE-cadherine, CD144). De meest gebruikte functionele genen omvatten endotheel stikstofoxide synthase (eNOS) en vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGFR). De cel activiteiten die gewoonlijk worden waargenomen in endotheliale cellijn onder opname van Dil-ad-LDL en bindende lectine dat koord-achtige structuren vormen op de matrix.De betekenis en de toekomstige toepassingen van Primary Gekweekte Mouse endotheelcellen
De hier beschreven methode wordt gebruikt om macrovasculaire endotheliale cellen te bestuderen. De betekenis van dit protocol is dat het een grote kans om de endotheel-specifieke activiteiten van gerichte moleculen te bestuderen en kan in knockout en transgene muismodellen, waardoor het zeer nuttig in cardiovasculair onderzoek. Het vermogen om grote aantallen muis endotheelcellen groeien onder bepaalde omstandigheden maken het ideaal techniek om de fenotypes en functies van endotheel beter te definiëren. Deze techniek verbetert de bruikbaarheid van het testen van de potentiële mogelijkheden van endotheliale cellen gebaseerde therapie bij muizenmodellen, zowel via intraveneuze injectie of implantatie van endotheelcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
