Introduction
O endotélio vascular é não só uma camada de barreira que separa o sangue e os tecidos, considera-se um grande glândula endócrina que se estende ao longo de toda a árvore vascular com uma área de superfície de 400 metros quadrados 1. O bem-estar do endotélio é essencial para a homeostase vascular. O endotélio disfuncional participa em várias desordens cardiovasculares, incluindo a aterosclerose, vasculite e a lesão de isquemia / reperfusão, etc. 2-4. Até à data, os mecanismos celulares e moleculares específicos envolvidos nestas configurações de doença não são bem compreendidos, devido à natureza anatómica difusa de endotélio.
O rato é um modelo importante para a pesquisa porque as técnicas de manipulação genética são mais desenvolvidos em ratos do que em quaisquer outras espécies de mamíferos. No entanto, o isolamento de células endoteliais de aorta de murino primário é considerado particularmente difícil devido ao pequeno tamanho da aorta torna enzymatIC digestão do endotélio impraticável. Alguns relataram procedimentos para isolar e purificar ECs exigem 5-7.
O objetivo deste protocolo é a utilização de um método simples para isolar e expandir células endoteliais da aorta do rato sem o uso de qualquer equipamento especial. Neste protocolo, a aorta isolada de fresco é cortada em pequenos segmentos e semearam-se sobre uma matriz com o endotélio virada para baixo para permitir a germinação endotelial. Após segmentos são removidos, as células endoteliais são expandidos em forma favorecida do endotélio e está pronto para experimentos após dois ou três passagens. As vantagens do método descrito são as seguintes: 1) consideravelmente elevados números de células endoteliais são colhidas a partir de um único aorta; 2) a viabilidade das células é bem preservada; e 3) é necessário nenhum equipamento ou técnica especial. Ele fornece um meio eficaz de identificar mecanismos celulares e moleculares específicos na fisiopatologia das células endoteliais. Para aqueles que estão interessados em estudar prcélulas endoteliais cultivadas imary de ambos os camundongos knock-out de genes, gene knock-in ratos, ou um modelo de doença murino, este protocolo é muito útil e fácil de praticar.
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Protocol
1. Isolamento de aorta de ratinhos
Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Wayne State University.
- Coloque o mouse na câmara de indução da máquina de anestesia. Defina o fluxo de isoflurano a 4% em conjunto com 25% de ar fresco e 75% de O 2. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (4% para indução, ± 1,0% para manutenção) em conjunto com 25% de ar fresco e 75% de O 2, por intermédio da câmara de indução seguida por um cone de nariz dedicado. NOTA: Anestesia com isoflurano pode ser entregue em 75% de ar, de oxigénio / 25% ou 100% em oxigénio.
- Verifique o mouse a cada 5 minutos até que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de retirada pitada tep).
- Aqui o rato para fora da câmara de indução e continuar a inalação de isoflurano que o cone do nariz dedicado que é ligado ao equipamento de anestesia. alternar aisoflurano fluir para 1% para manter a anestesia.
- Embora seja sob anestesia, coloque o mouse sobre um bloco de cirurgia, posicionadas em suas costas. Use fita de laboratório para proteger os membros.
- Use uma lâmpada de aquecimento para manter o rato quente. Mantenha a lâmpada em uma distância adequada do mouse para que o rato não vai mais ao calor.
- Pulveriza-se a caixa com 70% de etanol.
- Use tesouras de dissecação para abrir o abdómen da linha média, e expor a aorta abdominal. Abrir a cavidade torácica e expor o coração e os pulmões.
- Corte a aorta abdominal no meio com uma tesoura de dissecção para liberar o sangue.
- Encha uma seringa de 1 ml (com 25 g de agulhas) com 1 ml de PBS contendo 1.000 U / ml de heparina. Injectar PBS contendo 1.000 U / ml de heparina no ventrículo esquerdo e a aorta perfundir. Empurrar o coração e o pulmão com uma pinça com as grandes artérias para o lado direito dos ratinhos para expor a aorta torácica.
- remover rapidamente da aorta torácica utilizando micro-diforceps ssection e colocá-lo em 1x PBS gelado (estéril), em seguida, transportar o recipiente em uma capa de fluxo de ar laminar.
- Inserir uma seringa de 1 ml, equipado com 25 agulhas G em uma das extremidades da aorta, e lavar suavemente a aorta com PBS gelado para remover o sangue.
- Use uma pinça micro-dissecção para remover o máximo do tecido adiposo em anexo e pequenos vasos laterais possível.
- Imediatamente transferir a aorta para meio de crescimento endotelial.
- Corte a aorta em rodelas de 1 mm usando uma lâmina de bisturi estéril. Colheita aproximadamente 8 - 10 anéis por aorta.
- Abra cada anel aórtico usando um par de tesouras micro-dissecção.
2. As sementes dos segmentos da aorta em Matrix
- Quando não estiver em uso, mantenha a matriz reduzida do fator de crescimento em -20 ° C para evitar a solidificação. Coloque a matriz reduzida pelo factor de crescimento em 4 ° C, pelo menos durante a noite para permitir um descongelamento completo.
- Pré-arref ecimento de 6 poços de placa e pontas de pipeta para -20 ° C durante pelo menos10 min. Colocar a placa de 6 poços em gelo e um revestimento das cavidades da placa com 1 ml de matriz sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Colocar a placa num incubador de 37 ° C durante 20 min para permitir que a matriz se solidificar.
- Implantar as peças da aorta para a matriz solidificada usando uma pinça micro-dissecção estéreis. Coloque as peças lúmen de cabeça para baixo sobre a matriz, sem tocar no endotélio. Colocar 3 - 4 segmentos aórticos próximos uns dos outros na matriz.
- Adicionar meio de crescimento de células endoteliais apenas o suficiente para manter os segmentos molhado (~ 200 mL).
- Incubar a placa a 37 ° C sob 5% de CO2 durante 4 a 6 h. No final do dia, adicionar meio apenas suficiente para cobrir os segmentos aórticos.
- Observar o segmento da aorta sprouting periodicamente sob um microscópio de contraste de fase. Verifique o nível médio e crescimento celular a cada dia. Adicionar meio se necessário para manter segmentos da aorta cobertos.
- No dia 4 th, remova gentilmente o meio e retire a segmentos da aorta from a matriz, utilizando uma agulha estéril sem interromper as células endoteliais que crescem.
- Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais novo e permitir que as células endoteliais continuam a proliferar na matriz durante 2 - 3 dias.
3. Passaging inicial das células endoteliais da aorta do rato
- Revestimento de um novo frasco T12.5 com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min.
- Lavam-se as placas cuidadosamente com matriz estéril 37 ° C de PBS.
- Adicionar 2 ml de proteinase neutral (50 U / mL) para as placas de matriz e incubar à temperatura ambiente no balancim plataforma com agitação ocasional. Verifique as células em um microscópio de contraste de fase para garantir que a maioria das células são separadas.
- Adicionar 2 mL de D-Val para inactivar a proteinase neutro.
- Recolhe-se o sobrenadante cuidadosamente num tubo de centrífuga de 15 mL. Lava-se a placa com 2 ml de D-Val e recolher o sobrenadante.
- Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min a RooTemperatura m.
- Re-suspender o sedimento de células em 4 ml de meio de crescimento de células endoteliais e placa no balão T12.5 revestidos com gelatina. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 h.
- Substituir o meio. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO2 até que eles são 85% - 90% confluentes.
4. Passaging das células de camundongo aórtica endoteliais
- Revestimento dois novos frascos T12.5 com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min. Pré-aqueça Tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, 0,02 EDTA em PBS) e PBS estéril a 37 ° C durante cerca de 15 min.
- Lavam-se as células cuidadosamente com estéril 37 ° C de PBS.
- Adicionar 0,5 mL de Tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, 0,02 EDTA em PBS) e incuba-se a 37 ° C durante ~ 1 min ou até que a maioria das células se virar.
- Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais para parar a digestão. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo dentro dos frascos de várias vezes. Se necessário, utilizar uma célularaspador para recolher as células.
- Recolha a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Re-suspender o sedimento de células em 4 ml de meio de crescimento de células endoteliais e da placa em balões de 2 T12.5 revestidas com gelatina. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 h.
- Substituir o meio. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO2 até que eles são 85% - 90% confluentes.
- Use as células endoteliais da aorta de rato após 2 - 3 passagens.
5. Caracterização das células de camundongo aórtica endoteliais
- Re-placa das células.
- Bata de uma placa de 6 poços com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min. Lavar a placa com PBS.
- Pré-aqueça o Tripsina-EDTA e PBS estéril a 37 ° C durante cerca de 15 min.
- Lavam-se as células com PBS estéril 3 vezes. Adicionar 0,5 mL de Tripsina / EDTA para as células, incubar durante ~ 1 min a 37 ° C óR até que a maioria das células se virar.
- Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais para parar a digestão. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo dentro dos frascos de várias vezes. Se necessário, utilizar um raspador de células para recolher as células.
- Recolha a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante, re-suspender as células em meio de crescimento de células endoteliais. Semear as células em placas de 6 poços revestidas com gelatina a uma densidade de 3 x 10 5 / poço.
- Incubam-se as células durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que as células se fixem à superfície da cultura.
- Dil-ac-LDL captado e Ulex -lectin vinculativo.
- Armazenar o 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo carbocianina marcado com perclorato de LDL acetilada (Dil-ac-LDL) a -20 ° C. Antes da coloração, descongelar Dil-ac-LDL em gelo. A solu estoque Dil-ac-LDLção é de 1 mg / mL. Armazenar a aglutinina marcado com FITC Ulex europaeus (Ulex -Lectin, 1 ug / mL) a 4 ° C. A solução Ulex -Lectin estoque é de 1 mg / mL. Loja Hoechst 33342 a 4 ° C. A 33342 solução de Hoechst é de 100 mcg / mL.
- Adicionar 10 ul de solução de estoque Dil-ac-LDL a 1 mL de meio de cultura para obter uma concentração final de 10 ug / mL.
- Antes da coloração, remover o meio velho e lavar as células em cada poço com o novo meio.
- Retire o novo meio e adicione o meio de coloração Dil-ac-LDL.
- Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 1 h.
- Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
- Adicionar 1 ml de formol a 10% para fixar as células. Colocar a placa à temperatura ambiente durante cerca de 30 min.
- Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes. Evite luz.
- Adicione 1 mL estéril 1x PBS que contém 10 ml de Ulex -Lectin.
- Incubar as células a temperatu quartore no escuro durante 1 h.
- Remover o Ulex-LECTINA por lavagem das células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
- Adicionar a Hoechst 33342 para concentração final de 1 ug / ml, incubar 10 min no escuro.
- Ver a fluorescência do Dil-ac-LDL (vermelho, comprimento de onda de excitação de 576 nm), Ulex -Lectin (verde, excitação comprimento de onda de 519 nm) e Hoechst (azul, excitação comprimento de onda de 361 nm) com um microscópio de fluorescência invertido.
- coloração fluorescente para CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina e calponina.
- Loja anticorpo anti-ratinho CD31 conjugado com FITC, anticorpo eNOS, VE-caderina de anticorpo, anti-IgG de coelho conjugado com FITC, a 4 ° C no escuro. Loja anticorpo VEGFR2 em -20 ° C.
- Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
- Adicionar 1 ml de formol a 10% para fixar as células. Colocar a placa à temperatura ambiente durante cerca de 30 min.
- Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
- Para manchar CD31, adicione 1 mL de 1x estérilPBS que contém 10 ml de anticorpo CD31-FITC. Para manchar quer VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina, adicione 1 mL de estéril 1x PBS que contém 4 mL de VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina anticorpo primário, respectivamente.
- Incubar as células em gelo durante 1 h no escuro.
- Remover os anticorpos por lavagem das células com PBS estéril 3 vezes.
- Para a coloração de VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina, adicionar 1 ml de PBS estéril 1x que contém 10 ul de IgG anti-coelho conjugado com FITC. Incubar as células em gelo durante 1 h no escuro. Remover o IgG por lavagem das células com PBS estéril 3 vezes.
- Adicionar a Hoechst 33342 para concentração final de 1 ug / ml, incubar 10 min no escuro.
- Ver a fluorescência de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina, calponina (verde, comprimento de onda de excitação de 518-535 nm) e Hoechst (azul, comprimento de onda de excitação de 361 nm) com um microscópio de fluorescência invertido.
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Representative Results
Sprouting celular endotelial
células endoteliais espontânea brotando iniciado a partir de um segmento do mouse aorta. O segmento de rato aorta foi deixada crescer numa matriz reduzida pelo factor de crescimento, em seguida, em meio de crescimento de células endoteliais durante 4 dias. O surgimento de células endoteliais normalmente aparece em 2 - 4 dias. As fotomicrografias foram tomadas no dia 4 (Figura 1). Como mostrado nas figuras, numerosas células endoteliais migram para longe do segmento. Os brotos recém-formados continuam a estender a partir do segmento e ramo.
Os fenótipos de células endoteliais
Essas células demonstraram aparências fusiformes e paralelepípedos-like após a passagem inicial (Figura 2A). As células ligadas foram marcadas com Dil-ac-LDL e Ulex -Lectin durante uma hora. Tal como mostrado nas Figuras 2B-2E, a maioria das células foram duplamente positiva para Dil-ac-LDL captação (vermelho) e Ulex -Lectin ligação (verde). Enquanto isso, após a segunda passagem, mais do que 95% das células foram positivas para plaquetas molécula de adesão de células endoteliais 1 (CD31, PECAM-1, a Figura 2F), VEGFR2 (Figura 2G), VE-caderina (Figura 2H), eNOS ( a Figura 2I), mas negativa para calponina (Figura 2J), que é um marcador de células do músculo liso.
Figura 1. endotelial celular Sprouting. segmento da aorta do rato foi semeado em matriz reduzida pelo factor de crescimento e cultivadas em meio de crescimento de células endoteliais. Células endoteliais brotando começou tão cedo como no dia 2 (A, bar = 100 mm) e aumento nos seguintes 2 - 3 dias (B, C, bar = 100 mm). O segmento foi removido no dia 4 (D, barra = 500 um).
Figura 2. endoteliais fenótipos celulares. As células ligadas exibir fusiformes e paralelepípedos-like aparências (A, bar = 100 mm), fluorescência double-positivo de Dil-ac-LDL e Ulex -Lectin (BE, bar = 100 mm). Enquanto isso, plaquetas molécula de adesão de células endoteliais 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-caderina, eNOS foram positivos em> 95% das células após a segunda passagem (FI, barra = 100 uM) A maior parte das células eram negativas para a coloração calponina, que é um marcador de células do músculo liso (J, barra = 100 uM).
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Discussion
Este estudo demonstra um método simples para isolar e endotelial cultura células de uma aorta mouse sem qualquer equipamento especial. A coloração por imunofluorescência indicou que a maioria das células eram células endoteliais após a segunda passagem. Sugere-se que as células na segunda para a terceira passagem são adequados para in vitro e in vivo para estudar a biologia endotelial.
As Notas-chave do Protocolo Present
Há cinco pontos críticos do procedimento. Em primeiro lugar, o lúmen vascular é lavada com PBS contendo heparina para minimizar a activação da célula endotelial e a formação de coágulos. Em segundo lugar, o tempo entre a paragem cardíaca e a semeadura de segmento aórtico em matriz é crítico para a viabilidade endotélio. Enquanto limpar o tecido adiposo peri-arterial e do tecido conjuntivo, evitar esticar a aorta e limitar o tempo gasto nesta etapa a 10 - 15 min. Em terceiro lugar, despejeapenas meios suficientes para cobrir os segmentos após serem semeadas. O excesso de material fará com que os segmentos da aorta para flutuar. Em quarto lugar, o meio de cultura contém uma elevada concentração de suplemento de crescimento de células endoteliais, células endoteliais fazendo crescer muito mais rapidamente do que quando cultivadas em meio-2 de crescimento endotelial. O crescimento de células endoteliais irá suprimir outros tipos de células, tais como células do músculo liso e f ibroblastos. Em quinto lugar, o tempo para remover segmento aórtico da matriz também é crítico para a pureza das células endoteliais. Este passo evita a contaminação por fibroblastos e células musculares lisas. O segmento deve ser removido antes do desenvolvimento da rede de tubos. remoção tardia do segmento aórtico irá resultar na contaminação de outros tipos de células, tais como fibroblastos ou células do músculo liso. Por favor note que esta abordagem também é usado para estudar a angiogênese in vitro ea formação de capilar como estruturas indica a capacidade angiogênese do segmento de aorta. Com base em nossa experience, se os segmentos são removidos depois de a estrutura do tipo capilar desenvolve inteiramente, a incidência de células musculares lisas contaminação aumenta dramaticamente. Portanto, achamos que o melhor ponto de tempo para remover o segmento é quando a rede começa a ser visível, mas não está totalmente desenvolvido. Desta forma, somos capazes de colher tantas células endoteliais quanto possível, mantendo a contaminação por células do músculo liso para um mínimo.
As limitações do protocolo Present
Existem algumas limitações dos métodos descritos. Em primeiro lugar, existem as possibilidades de contaminação de fibroblastos e células musculares lisas, se os segmentos aórticos não são removidas antes de redes de tubos desenvolver. Os fibroblastos ou células de músculo liso podem começar a prender a matriz de proliferar e de 3 a 5 dias após a semeadura. Portanto, sempre remover os segmentos da aorta em tempo hábil. Como precaução secundário, mudando a forma 2 horas após re -plating as células para um novo balão também ajuda a eliminar a possibilidade de contaminação de fibroblastos e células musculares lisas. Em segundo lugar, estas células são cultivadas in vitro durante 7 - 10 dias após o isolamento. É possível que os seus fenótipos podem ser diferentes a partir de células endoteliais isoladas de fresco. Por exemplo, se as células endoteliais a partir de um modelo de rato de hiperlipidemia são cultivadas em meio de crescimento de células endoteliais, sem uma concentração elevada de lípidos, eles não são expostos ao ambiente de hiperlipidemia, que foram em animais. As células endoteliais cultivadas podem se comportar de forma diferente a partir de células endoteliais recentemente isoladas 8. Este problema existe em todas as células primárias in vitro em cultura e linhas celulares. Adicionando os estímulos patológicos para o meio de cultura para simular o ambiente in vivo pode ser uma solução.
As células endoteliais Demonstrar fenótipos diferentes em diferentes ramos vasculares
e_content "> O sistema vascular é uma estrutura hierárquica composta de artérias, veias e capilares. A heterogeneidade das células endoteliais que residem nas" zonas "específicas da vasculatura desempenha um grande papel na criação de diversidade funcional no sistema vascular 9,10. mesmo em um único leito vascular, como a aorta, existe heterogeneidade endotelial. fluxo sanguíneo laminar com o estresse de cisalhamento elevado na parte reta da aorta induz óxido nítrico sintase endotelial e trombomodulina 11. Portanto, as células endoteliais que reside na parte reta aorta demonstrar anti-coagulante, anti-adesiva, e propriedades anti-inflamatórias 12,13. em contraste, o fluxo sanguíneo turbulento em áreas onde ramo artérias ou virar bruscamente (arco aórtico) reduz a expressão endotelial de óxido nítrico sintase e induz os genes aterogénicas em endotelial células, isto é, a proteína quimiotáctica de monócitos-1 (MCP-1), e factores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), Resultando num fenótipo pró-inflamatória e aterosclerótica endotelial 6. Além disso, as células endoteliais nos vasos de cada órgão sofrer alterações adaptativas anatómicas e funcionais que são específicos para as funções de órgãos que de 14,15. No entanto, existe um consenso de que vários marcadores da superfície celular, genes funcionais e as actividades celulares pode ser utilizado para caracterizar a linhagem de células endoteliais. Estes marcadores de superfície celular de plaquetas incluem molécula de adesão celular endotelial (PCAM-1, CD31), o factor de von Willebrand (vWF), Endotelial Vascular-caderina (VE-caderina, CD144). Os genes funcionais utilizados mais frequentemente incluem sintase endotelial do óxido nítrico (eNOS) e de Crescimento Endotelial Vascular Receptor do Factor (VEGFR). As atividades celulares que são geralmente vistos na linhagem de células endoteliais incluem a captação de Dil-ad-LDL e lectina de ligação, que forma estruturas em forma de cordão na matriz.O significado e futuras aplicações de PriAs células cultivadas de ratinho mary aórtica endoteliais
O método aqui descrito é usado para estudar as células endoteliais macrovasculares. A importância deste protocolo é que ele fornece uma grande oportunidade para estudar as atividades específicas do endoteliais de moléculas alvo e pode ser feito em nocaute e modelos de camundongos transgênicos, tornando-se muito útil na investigação cardiovascular. A capacidade para crescer um número elevado de células endoteliais aórticas de rato sob condições definidas torna esta técnica ideal para definir melhor os fenótipos e funções do endotélio. Esta técnica melhora a praticabilidade de testar o potencial prospectivo da terapia à base de células endoteliais em modelos de murídeo, quer através de injecção intravenosa ou enxerto de células endoteliais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
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