Introduction
El endotelio vascular es no sólo una capa de barrera que separa la sangre y el tejido, se considera una amplia glándula endocrina que se extiende sobre todo el árbol vascular con una superficie de 400 metros cuadrados 1. El bienestar del endotelio es esencial para la homeostasis vascular. El endotelio disfuncional participa en diversos trastornos cardiovasculares, incluyendo la aterosclerosis, vasculitis y las lesiones por isquemia / reperfusión, etc. 2-4. Hasta la fecha, los mecanismos celulares y moleculares específicos implicados en estos ajustes de la enfermedad no se comprenden bien debido a la naturaleza anatómica difusa de endotelio.
El ratón es un modelo importante para la investigación porque las técnicas de manipulación genética están más desarrollados en ratones que en cualquier otra especie de mamífero. Sin embargo, el aislamiento de células endoteliales aórticas primaria murino se considera particularmente difícil debido a que el pequeño tamaño de la aorta hace enzymatdigestión ic de endotelio poco práctico. Algunos informaron procedimientos para aislar y purificar las CE exijan 5-7.
El objetivo de este protocolo es el uso de un método simple para aislar y expandir las células endoteliales de la aorta de ratón sin utilizar ningún equipo especial. En este protocolo, la aorta recién aisladas se corta en pequeños segmentos y se sembró sobre una matriz con el endotelio hacia abajo para permitir la germinación endotelial. Después de segmentos se eliminan, las células endoteliales se expandieron en medio del endotelio favorecida y están listas para experimentos después de dos o tres pasajes. Las ventajas del método descrito son que: 1) considerablemente alto número de células endoteliales se obtienen de una sola aorta; 2) la viabilidad celular está bien conservada; y 3) no se necesita ningún equipo o técnica especial. Se proporciona un medio eficaz para la identificación de los mecanismos celulares y moleculares específicos en la fisiopatología de las células endoteliales. Para aquellos que estén interesados en el estudio de prLas células endoteliales cultivadas imary de cualquiera de los genes de ratones knock-out, genes knock-en ratones, o un modelo murino de la enfermedad, este protocolo es muy útil y fácil de practicar.
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Protocol
1. Aislamiento de la aorta de los ratones
Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Wayne.
- Poner el ratón en la cámara de inducción de la máquina de anestesia. Ajuste el flujo de isoflurano al 4% en relación con el 25% de aire fresco y 75% de O 2. Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano (4% para la inducción, ± 1,0% para el mantenimiento) en combinación con 25% de aire fresco y 75% de O 2 a través de la cámara de inducción seguida de un cono de nariz dedicado. NOTA: La anestesia con isoflurano se puede entregar en 75% de aire de oxígeno / 25% o en el 100% de oxígeno.
- Verifique el ratón cada 5 minutos hasta que el nivel adecuado de anestesia se alcanza (falta de retirada de pizca dedo del pie).
- Tome el ratón fuera de la cámara de inducción y continuar la inhalación de isoflurano pesar de que el cono de la nariz dedicado que está conectado a la máquina de anestesia. conmutar elisoflurano fluya a 1% para mantener la anestesia.
- Si bien es bajo anestesia, poner el ratón sobre un bloque de la cirugía, situado en su parte posterior. Use cinta de laboratorio para asegurar las extremidades.
- Utilice una lámpara de calentamiento para mantener caliente el ratón. Mantenga la lámpara en una distancia apropiada del ratón de manera que el ratón no se sobre-calor.
- Pulverizar el pecho con un 70% de etanol.
- Use las tijeras de disección para abrir el abdomen de la línea media, y exponer la aorta abdominal. Abrir la cavidad torácica y exponer el corazón y los pulmones.
- Cortar la aorta abdominal en el medio con tijeras de disección para liberar la sangre.
- Llene una jeringa de 1 ml (con 25 aguja G) con 1 ml de PBS que contenía 1000 U / ml de heparina. Inyectar PBS que contenía 1000 U / ml de heparina para el ventrículo izquierdo y la aorta perfundir. Empuje el corazón y el pulmón con pinzas en las grandes arterias hasta el lado derecho de los ratones para exponer la aorta torácica.
- eliminar rápidamente la aorta torácica mediante micro-difórceps ssection y ponerlo en 1x PBS helado (estéril), y luego transportar el contenedor en una campana de flujo laminar.
- Inserte una jeringa de 1 ml equipado con 25 aguja G en un extremo de la aorta, y lavar suavemente la aorta con PBS enfriado en hielo para eliminar la sangre.
- El uso de fórceps micro-disección para eliminar la mayor cantidad de tejido adiposo adjunto y pequeños vasos laterales como sea posible.
- transferir inmediatamente la aorta endoteliales medio de crecimiento.
- Cortar la aorta en 1 anillos mm utilizando una hoja de bisturí estéril. Cosecha cerca de 8 - 10 anillos por aorta.
- Abrir cada anillo aórtico con un par de tijeras de microdisección.
2. Las semillas de los segmentos aórticos en Matrix
- Cuando no esté en uso, mantenga la matriz reducida del factor de crecimiento de los -20 ° C para evitar la solidificación. Ponga la matriz reducida del factor de crecimiento de 4 ° C al menos durante la noche para permitir que un deshielo completa.
- Pre-enfriar unos 6 pocillos de placas y consejos de pipeta a -20 ° C durante al menos10 minutos. Poner la placa de 6 pocillos en hielo y capa de un pocillo de la placa con 1 ml de matriz sin introducir burbujas de aire. Colocar la placa en una incubadora a 37ºC durante 20 min para permitir que la matriz se solidifique.
- Implantar las piezas de la aorta en la matriz solidificada con unas pinzas de disección micro-estériles. Colocar las piezas lumen del lado de abajo en la matriz sin tocar el endotelio. Coloque 3 - 4 segmentos aórticos cerca uno del otro en la matriz.
- Añadir la cantidad necesaria medio de crecimiento de células endoteliales para mantener húmeda segmentos (~ 200 l).
- Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO2 durante 4 a 6 h. Al final del día, añadir suficiente medio para cubrir los segmentos aórticos.
- Observe el segmento aórtico brotación periódicamente bajo un microscopio de contraste de fase. Comprobar el nivel de mediano y crecimiento de las células cada día. Se añade medio si es necesario para mantener los segmentos aórticos cubiertos.
- En el 4º día, retire suavemente el medio y eliminar los segmentos de aorta fesde la matriz usando una aguja estéril sin interrumpir las células endoteliales en crecimiento.
- Añadir 2 ml de nuevo medio de crecimiento de células endoteliales y permitir que las células endoteliales siguen proliferando en la matriz durante 2 - 3 días.
3. pases inicial de las células endoteliales aórticas de ratón
- Escudo un nuevo matraz T12.5 con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min.
- Lavar las placas de matriz estéril cuidadosamente con 37 ° C de PBS.
- Añadir 2 ml de proteinasa neutra (50 U / ml) a las placas de matriz y se incuba a temperatura ambiente en eje de balancín plataforma con agitación ocasional. Compruebe las células bajo un microscopio de contraste de fase para asegurarse de que la mayoría de las células se separan.
- Añadir 2 ml de D-Val para inactivar la proteinasa neutra.
- Recoger el sobrenadante cuidadosamente en un tubo de centrífuga de 15 mL. Lavar la placa con 2 ml de D-Val y recoger el sobrenadante.
- Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a Roola temperatura m.
- Vuelva a suspender el sedimento de células en 4 ml de medio de crecimiento de células endoteliales y la placa en el matraz T12.5 recubierto con gelatina. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 h.
- Reemplazar el medio. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que son 85% - 90% de confluencia.
4. pases de las células endoteliales aórticas de ratón
- Coat dos nuevos matraces T12.5 con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min. Pre-calor tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 0,02 en PBS) y PBS estéril a 37 ° C durante aproximadamente 15 min.
- Lavar las células cuidadosamente con estéril PBS 37 ° C.
- Añadir 0,5 ml de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 0,02 en PBS) y se incuba a 37 ° C durante ~ 1 min o hasta que la mayoría de las células darse la vuelta.
- Añadir 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales para detener la digestión. Pipetear la suspensión de células arriba y hacia abajo dentro de los tiempos matraz varios. Si es necesario, utilice una célularaspador para recoger las células.
- Recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Vuelva a suspender el sedimento de células en 4 ml de medio de crecimiento de células endoteliales y la placa en 2 frascos T12.5 recubiertas con gelatina. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 h.
- Reemplazar el medio. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que son 85% - 90% de confluencia.
- Use las células endoteliales de aorta de ratón después de 2 - 3 pasajes.
5. Caracterización de las células endoteliales de aorta de ratón
- Re-placa de las células.
- Escudo una placa de 6 pocillos con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min. Aclarar la placa con PBS.
- Pre-calentar la tripsina-EDTA y PBS estéril a 37 ° C durante aproximadamente 15 min.
- Se lavan las células con PBS estéril 3 veces. Añadir 0,5 ml de tripsina / EDTA a las células, se incuba durante ~ 1 min a 37 ° C or hasta que la mayoría de las células de darse la vuelta.
- Añadir 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales para detener la digestión. Pipetear la suspensión de células arriba y hacia abajo dentro de los tiempos matraz varios. Si es necesario, utilizar un rascador de células para recoger las células.
- Recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Descartar el sobrenadante, volver a suspender las células en medio de crecimiento de las células endoteliales. Sembrar las células en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina a la densidad de 3 x 10 5 / pocillo.
- Se incuban las células durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2 para permitir que las células se unan a la superficie de cultivo.
- Dil-ac-LDL y especialmente captado Ulex -lectin vinculante.
- Almacenar el 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo carbocyanine perclorato marcado LDL acetilada (Dil-ac-LDL) a -20 ° C. Antes de la tinción, descongelar Dil-ac-LDL en hielo. La solu Stock Dil-ac-LDLción es 1 mg / mL. Almacenar la aglutinina marcada con FITC Ulex europaeus (Ulex -Lectin, 1 mg / ml) a 4 ° C. La solución madre Ulex -Lectin es 1 mg / mL. Tienda Hoechst 33342 a 4 ° C. La solución madre Hoechst 33342 es 100 mg / ml.
- Añadir 10 l de Dil-ac-LDL solución madre a 1 ml de medio de cultivo para hacer una concentración final de 10 mg / ml.
- Antes de la tinción, se elimina el medio viejo y se lavan las células en cada pocillo con medio nuevo.
- Retire el nuevo medio y se añade el medio de tinción Dil-ac-LDL.
- Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 1 h.
- Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces.
- Añadir 1 ml de formalina al 10% para fijar las células. Poner la placa en la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min.
- Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces. Evitar la luz.
- Añadir 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 10 l de Ulex -Lectin.
- Se incuban las células a temperatu de la habitaciónvolver en la oscuridad durante 1 h.
- Retire el Ulex-lectina por lavado de las células con PBS 1x estéril 3 veces.
- Añadir Hoechst 33342 a concentración final de 1 mg / ml, se incuban 10 min en la oscuridad.
- Ver la fluorescencia de Dil-ac-LDL (rojo, longitud de onda de excitación de 576 nm), Ulex -Lectin (verde, la excitación de longitud de onda de 519 nm) y Hoechst (azul, longitud de onda de excitación de 361 nm) con un microscopio de fluorescencia invertida.
- La tinción fluorescente para CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherina y calponin.
- Tienda FITC-conjugado anticuerpo anti-ratón CD31, anticuerpo eNOS, VE-cadherina anticuerpo, conjugado con FITC IgG anti-conejo a 4 ° C en la oscuridad. Tienda de anticuerpos VEGFR2 en -20 ° C.
- Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces.
- Añadir 1 ml de formalina al 10% para fijar las células. Poner la placa en la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min.
- Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces.
- Para la tinción de CD31, añadir 1 ml de 1x estérilPBS que contiene 10 l de anticuerpo CD31-FITC. Para teñir ya sea VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin, agregar 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 4 l de VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin anticuerpo primario, respectivamente.
- Se incuban las células en hielo durante 1 h en la oscuridad.
- Eliminar los anticuerpos por lavado de las células con PBS estéril 3 veces.
- Para la tinción de VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin, añadir 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 10 l de IgG anti-conejo conjugado con FITC. Se incuban las células en hielo durante 1 h en la oscuridad. Eliminar la IgG por lavado de las células con PBS estéril 3 veces.
- Añadir Hoechst 33342 a concentración final de 1 mg / ml, se incuban 10 min en la oscuridad.
- Ver la fluorescencia de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherina, calponin (verde, longitud de onda de excitación de 518 a 535 nm) y Hoechst (azul, longitud de onda de excitación de 361 nm) con un microscopio de fluorescencia invertida.
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Representative Results
Brote de la célula endotelial
espontánea de las células endoteliales brotación comenzó a partir de un segmento de la aorta del ratón. El segmento de aorta de ratón se dejó crecer en una matriz reducida del factor de crecimiento a continuación en medio de crecimiento de células endoteliales durante 4 días. El surgimiento de las células endoteliales por lo general aparece en 2 - 4 días. Las microfotografías se tomaron el día 4 (Figura 1). Como se muestra en las fotos, numerosas células endoteliales migran fuera del segmento. Los brotes recién formadas siguen se extienden desde el segmento y la rama.
Fenotipos de células endoteliales
Estas células demostraron apariciones en forma de huso y de adoquines-como después del paso inicial (Figura 2A). Las células unidas se marcaron con Dil-ac-LDL y Ulex -Lectin durante una hora. Como se muestra en las figuras 2B-2E, la mayoría de las células fueron doble positivas para Dil-ac-LDL absorción (rojo) y Ulex -Lectin unión (verde). Mientras tanto, después de que el segundo paso, más de 95% de las células fueron positivas para plaquetas molécula de adhesión de células endoteliales 1 (CD31, PECAM-1, la Figura 2F), VEGFR2 (Figura 2G), VE-cadherina (Figura 2H), eNOS ( Figura 2I) pero negativo para calponin (Figura 2J) que es un marcador de células del músculo liso.
Figura 1. Surgimiento de la célula endotelial. Ratón segmento aórtico se sembró en crecimiento matriz reducida del factor y se cultivaron en medio de crecimiento de células endoteliales. Células endoteliales brotación se inició ya en el día 2 (A, bar = 100 micras) y aumentó en los siguientes 2 - 3 días (B, C, bar = 100 micras). El segmento se eliminó en día 4 (D, bar = 500 m).
Figura 2. fenotipos de células endoteliales. Las células unidas muestran las apariencias de huso en forma de adoquines y similares (A, bar = 100 micras), la fluorescencia de doble positivo de Dil-ac-LDL y Ulex -Lectin (BE, bar = 100 micras). Mientras tanto, las plaquetas molécula de adhesión de células endoteliales 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-cadherina, eNOS fueron positivos en> 95% de las células después de la segunda pasaje (FI, bar = 100 micras) La mayoría de las células fueron negativos para la tinción calponina, que es un marcador de células del músculo liso (J, bar = 100 m).
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Discussion
Este estudio demuestra un método simple para aislar y endotelial cultura células de una aorta de ratón sin ningún equipo especial. La tinción de inmunofluorescencia indicó que la mayoría de las células eran células endoteliales después de la segunda pasaje. Se sugiere que las células en segundo-tercio paso son apropiados para in vitro e in vivo para estudiar la biología endotelial.
Las Notas clave de la presente Protocolo
Hay cinco puntos críticos en el procedimiento. En primer lugar, la luz vascular se lava con PBS que contenía heparina para reducir al mínimo la activación de células endoteliales y la formación de coágulos. En segundo lugar, el tiempo entre la parada cardiaca y la siembra de segmento aórtico en la matriz es crítica para la viabilidad endotelio. Mientras se elimina el tejido adiposo peri-arterial y el tejido conectivo, evitar el estiramiento de la aorta y limitar el tiempo dedicado a este paso a 10 - 15 min. En tercer lugar, vertersimplemente suficientes medios para cubrir los segmentos después de que se siembran. El exceso de medios de comunicación que los segmentos aórticos floten. En cuarto lugar, el medio de cultivo contiene una alta concentración de suplemento de crecimiento de células endoteliales, por lo que las células endoteliales crecen mucho más rápido que cuando se cultivan en medio de crecimiento endotelial-2. La derivación de células endoteliales suprimirá otros tipos de células tales como las células de músculo liso y fibroblastos. En quinto lugar, el tiempo para eliminar segmento aórtico de la matriz también es fundamental para la pureza de las células endoteliales. Este paso evita la contaminación por fibroblastos y células de músculo liso. El segmento se debe quitar antes del desarrollo de la red de metro. la eliminación retardada del segmento aórtico dará lugar a la contaminación de otros tipos de células tales como fibroblastos o células del músculo liso. Tenga en cuenta que este enfoque también se utiliza para estudiar la angiogénesis in vitro y la formación de estructuras capilares como indica la capacidad de la angiogénesis del segmento de aorta. Sobre la base de nuestro correoxperience, si los segmentos se eliminan después de la estructura de tipo capilar se desarrolla completamente, la incidencia de células de músculo liso contaminación aumenta dramáticamente. Por lo tanto, creemos que el mejor punto de tiempo para eliminar el segmento es cuando la red comienza a ser visible, pero no está completamente desarrollado. De este modo, somos capaces de cosechar tantas células endoteliales posible, manteniendo la contaminación por células de músculo liso a un mínimo.
Las limitaciones del protocolo actual
Hay algunas limitaciones de los métodos descritos. En primer lugar, hay posibilidades de contaminación de fibroblastos y células de músculo liso, si los segmentos de aorta no se eliminan antes de redes de tubos se desarrollan. Los fibroblastos o células del músculo liso pueden empezar a unir a la matriz y proliferar 3 a 5 días después de la siembra. Por lo tanto, no olvide retirar los segmentos de aorta de manera oportuna. Como medida de precaución secundaria, cambiando el medio 2 horas después de la re -plating las células a un nuevo matraz también ayuda a eliminar la posible contaminación de los fibroblastos y las células musculares lisas. En segundo lugar, estas células se cultivan in vitro durante 7 - 10 días después del aislamiento. Es posible que sus fenotipos pueden ser diferentes de las células endoteliales recién aisladas. Por ejemplo, si las células endoteliales de un modelo de ratón de la hiperlipidemia se cultivan en medio de crecimiento de células endoteliales sin una alta concentración de lípidos, no están expuestos al medio ambiente hiperlipidémicos como lo fueron en animales. Las células endoteliales cultivadas pueden comportarse de manera diferente a partir de células endoteliales aisladas recientemente 8. Este problema existe en todas las células primarias in vitro cultivadas y líneas celulares. Adición de los estímulos patológicos en el medio de cultivo para imitar el entorno in vivo puede ser una solución.
Las células endoteliales Demostrar diferentes fenotipos en diversas ramas vasculares
e_content "> El sistema vascular es una estructura jerárquica compuesta por arterias, venas y capilares. La heterogeneidad de las células endoteliales que residen en las" zonas "específicas de la vasculatura juega un papel importante en la creación de la diversidad funcional en el sistema vascular 9,10. incluso en un solo lecho vascular, tal como la aorta, existe heterogeneidad endotelial. el flujo de sangre laminar con el estrés de alto cizallamiento en la parte recta de la aorta induce óxido nítrico sintasa endotelial y trombomodulina 11. por lo tanto, las células endoteliales que reside en la parte recta de la aorta demostrar anti-coagulante, anti-adhesivo, y las propiedades anti-inflamatorias 12,13. por el contrario, el flujo sanguíneo turbulento en las zonas donde rama arterias o girar bruscamente (arco aórtico) reduce la expresión endotelial de óxido nítrico sintasa e induce genes aterogénicos en endotelial células, es decir, la proteína-1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1), y factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), Lo que resulta en un fenotipo endotelial pro-inflamatorio y aterosclerótico 6. Además, las células endoteliales en los vasos de cada órgano se someten a cambios de adaptación anatómicos y funcionales que son específicos de las funciones de ese órgano 14,15. No obstante, existe un consenso de que los marcadores de superficie celular, varios genes funcionales y actividades de las células se pueden utilizar para caracterizar el linaje de células endoteliales. Estos marcadores de superficie celular incluyen plaquetas molécula de adhesión celular endotelial (PCAM-1, CD31), factor de von Willebrand (vWF), endotelial vascular-cadherina (VE-cadherina, CD144). Los genes funcionales utilizados con mayor frecuencia son la sintetasa del óxido nítrico endotelial (eNOS) y del factor de crecimiento endotelial vascular del receptor (VEGFR). Las actividades de las células que se suelen ver en el linaje de células endoteliales, como la captación de Dil-ad-LDL y la lectina de unión, que forma estructuras similares a un cordón en la matriz.El significado y las futuras aplicaciones de PriLas células endoteliales de aorta de ratón en cultivo mary
El método descrito aquí se utiliza para estudiar las células endoteliales macrovasculares. La importancia de este protocolo es que proporciona una gran oportunidad para estudiar las actividades endoteliales específica de moléculas específicas y puede hacerse en modelos de ratones transgénicos knockout y, lo que es muy útil en la investigación cardiovascular. La capacidad de crecer un alto número de células endoteliales aórticas de ratón bajo condiciones definidas hace que esta técnica ideal para definir mejor los fenotipos y funciones del endotelio. Esta técnica mejora la practicidad de probar el potencial prospectivo de la terapia basada en células endoteliales en modelos murinos, a través de ya sea inyección intravenosa o injerto de las células endoteliales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
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