La co-infezione umana è difficile da replicare in vitro. Tuttavia, i parassiti della malaria umana possono essere facilmente coltivati in vitro, così come le cellule mononucleate del sangue periferico umano appena isolate e naturalmente infettate dall'HIV. Ciò fornisce un modello eccellente per studiare le risposte immunitarie precoci ai parassiti della malaria nel contesto della co-infezione da HIV.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La co-infezione da malaria e HIV è una priorità sanitaria crescente. Tuttavia, la maggior parte della ricerca sulla malaria o sull'HIV si concentra attualmente su ciascuna infezione individualmente. Sebbene sia fondamentale comprendere le dinamiche della malattia per ciascuno di questi agenti patogeni in modo indipendente, è anche importante che le interazioni tra questi agenti patogeni siano studiate e comprese.
Abbiamo sviluppato un modello versatile in vitro di co-infezione HIV-malaria per studiare le risposte immunitarie dell'ospite alla malaria nel contesto dell'infezione da HIV. Il nostro modello consente lo studio dei fattori secreti nei surnatanti cellulari, nella superficie cellulare e nei marcatori proteici intracellulari, nonché dei livelli di espressione dell'RNA. Il disegno sperimentale e i metodi utilizzati limitano la variabilità e promuovono l'affidabilità e la riproducibilità dei dati.
Tutti i patogeni utilizzati in questo modello sono patogeni umani naturali (Plasmodium falciparum e HIV-1) e tutte le cellule infette sono naturalmente infettate e utilizzate fresche. Utilizziamo eritrociti umani parassitati con P. falciparum e mantenuti in coltura continua in vitro. Otteniamo cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate da volontari con infezione cronica da HIV. Ogni condizione utilizzata ha un controllo appropriato (P. falciparum parassitato vs. eritrociti normali) e ogni donatore infetto da HIV ha un controllo HIV non infetto, da cui le cellule vengono raccolte lo stesso giorno. Questo modello fornisce un ambiente realistico per studiare le interazioni tra i parassiti della malaria e le cellule immunitarie umane nel contesto dell'infezione da HIV.
Introduzione
Co-infezione, infezione da infezioni multiple concomitanti, è la norma in ambienti naturali. Co-infezione può avere un grande impatto sulla patologia della malattia e sulla gestione clinica di ogni infezione. Nel contesto di co-infezione, il vaccino e l'efficacia dei farmaci, così come test diagnostico, può essere influenzato negativamente (rivisto in 1). Tuttavia, nonostante la sua importanza, la maggior parte delle ricerche patogeno ritiene infezioni solo singoli.
La malaria e HIV-1 (HIV) sono le principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale. Aree di malaria e l'HIV endemicità condividono una vasta sovr....
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Protocollo
Questo protocollo richiede il reclutamento di donatori di siero e RBC da utilizzare per la cultura parassita, e l'HIV (+) e non infetti donatori per l'isolamento PBMC. Institutional Review Boards devono approvare tutti gli studi e tutti i donatori devono fornire il consenso informato prima di prelievo di sangue.
ATTENZIONE: Lavorare con campioni di sangue umano e dei parassiti della malaria umana richiede misure precauzionali. Indossare sempre un camice da laboratorio, guanti, e lavorare in un armadio di livello 2 biosicurezza. In caso di accidentale esposizione percutanea a malaria umana, riferire alla Salute e Sicurezza per il t....
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Risultati
I grafici rappresentano i livelli di produzione IFNγ da cellule NKT (figura 2), utilizzando CD56 + CD3 + γδ- cancelli avere la popolazione di cellule NKT (dati non mostrati). Le cellule sono state coltivate per 72 ore prima della colorazione. Una volta macchiati, 100.000 cellule CD3 + sono state acquistate sul citofluorimetro di ottenere abbastanza grandi popolazioni di NK, NKT e cellule γδ (cellule di interesse). Un minimo di 5.600 cellule NKT sono visualizzate su ogni grafico. Produzione di TNF è otte.......
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Discussione
Il nostro protocollo è stato ottimizzato al fine di studiare più realisticamente la co-infezione HIV-malaria in vitro. In primo luogo, i globuli rossi umani freschi e siero sono necessari per la cultura parassita della malaria. Questo è fondamentale per ottenere una popolazione sana di parassiti della malaria. Lisati parassiti non possono essere sostituiti per i parassiti dal vivo come la produzione di citochine è molto più rapido e intenso quando si utilizza dal vivo P. falciparum infettato R.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
C.A.M.F. e L.S. hanno partecipato alla progettazione del protocollo, all'acquisizione e all'analisi dei dati e alla stesura dell'articolo.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kain, il Dr. Loutfy, il Dr. Wasmuth e il Dr. Ayi per i loro contributi.
C.F. è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. è supportato da un OHTN Junior Investigator Development Award. Il presente lavoro è stato supportato da una sovvenzione operativa del Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 e 115160) e da una sovvenzione CIHR New Investigator Catalyst.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| anticorpi | alanina Sigma | A7377 | |
| (vedi altra tabella) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm con BD GolgiPlug | BD | 555028 | include brefeldina A, tampone cytofix/cytoperm e tampone permanente/lavaggio |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (senza calcio, senza magnesio) | Corning | 21-031-CV | |
| Siero fetale bovino | Sigma | F1051 | inattivare a caldo prima dell'uso |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamicina (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| ipossantina | Sigma | H9636 | |
| Ionomicina | Sigma | I3909 | |
| MEM aminoacidi non essenziali (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma P8139 | ||
| RPMI-1640 polvere | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 con L-glutammina e HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| bicarbonato di sodio (polvere, coltura cellulare) | Sigma | S5761 | |
| Piruvato di sodio (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (base Trizma) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | dipende dagli anticorpi utilizzati |
| Miscela di gas parassita | Per ordine | 3% CO2, 1% O2, saldo N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μ m unità | |||
| Vetrini Vetrini | |||
| T25 | |||
| Palloni T75 Fiasche | |||
| 50 ml | |||
| di coltura a 24 pozzetti | |||
| scollegate Pipette | |||
| tappate | Pipette Pasteur | ||
| pipette sterili per trasferimento emocitometro | |||
| citometro | |||
| a flusso (3 laser) | |||
| Anticorpi utilizzati per citometria a flusso | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluoroforo) 2 μ l |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluoroforo) 20 μ l |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluoroforo) 1 μ l |
| Biolegenda anti-CD14 | ; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotina (fluoroforo) 0,5 μ l Streptavin PE-TR (fluoroforo) 0,1 μ l |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluoroforo) 5 μ l |
| Anti-γ δ | Biolegend | 331212 | APC (fluoroforo) 5 μ l |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluoroforo) 5 μ l |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Blu Pacifico (fluoroforo) 1 μ l |
Riferimenti
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. I....
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