Introduction
Attualmente considerato il gold standard di cranio-maxillo-facciale (CMF) Trattamenti difetto osseo, trapianto di innesti autologhi raccolti è ostacolato da procedure di innesto complesse, sito donatore la morbilità e la disponibilità limitata 1. Una particolare difficoltà sta plasmando e fissa l'autotrapianto rigida saldamente nel difetto al fine di ottenere osteointegrazione e per prevenire il riassorbimento dell'innesto. L'ingegneria dei tessuti è stata studiata come una strategia alternativa per autotrapianto e sostituti ossei sintetici (ad esempio cemento osseo) 2,3. Fondamentale per il successo di un approccio di ingegneria tissutale è un ponteggio con un set specifico di proprietà. In primo luogo, al fine di raggiungere l'osteointegrazione, il ponteggio deve formare stretto contatto con il tessuto osseo adiacente 4. Il ponteggio deve essere anche osteoconduttivo, permettendo la migrazione delle cellule, la diffusione dei nutrienti e neotissue deposizione 4,5. Questo comportamento viene generalmente raggiunta con sca biodegradabileffolds esibendo un poro morfologia fortemente interconnesso. Infine, il ponteggio deve essere bioattivo in modo da promuovere l'integrazione ed il legame con circostante tessuto osseo 5.
Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare una impalcatura ingegneria dei tessuti con queste proprietà. È importante sottolineare che questa impalcatura mostra la capacità di "auto-fit" in difetti irregolari CMF grazie al suo comportamento memoria di forma 6. Polimeri a memoria di forma Thermoresponsive (SMPS) sono noti per subire un cambiamento di forma in seguito all'esposizione al calore 7,8. SMP è formata da "NETPoint" (cioè legami crociati chimici o fisici), che determinano la forma permanente e "segmenti di commutazione", che mantengono la forma temporanea e recuperano la forma permanente. I segmenti di commutazione presentano una temperatura di transizione termica (T trans) corrispondente sia alla transizione vetrosa (Tg) o fondere transizione (T m) del polimero. ComeDi conseguenza, SMP può essere deformata in sequenza in una forma temporanea a T> T trans, fisso a forma temporaneo T <T trans, e recuperato alla forma permanente a T> T trans. Così, un ponteggio SMP potrebbe realizzare "self-fitting" all'interno di un difetto CMF come segue 6. Dopo l'esposizione a scaldare salina (T> T trans), un ponteggio SMP sarebbe diventato malleabile, permettendo un ponteggio cilindrica genericamente preparato per essere in un difetto irregolare pressato a mano, con recupero della forma promuovere l'espansione del ponteggio al confine difetto. Al raffreddamento (T <T trans), l'impalcatura sarebbe tornato al suo stato relativamente più rigida, con forma fissità mantenere la sua nuova forma temporanea all'interno del difetto. In questo protocollo, una impalcatura SMP è preparato da policaprolattone (PCL), un polimero biodegradabile studiato ampiamente per la rigenerazione dei tessuti e altre applicazioni biomediche 9-11. Per la memoria di forma, the T m di PCL funge T trans e varia tra 43 e 60 ° C, a seconda del peso molecolare del PCL 12. In questo protocollo, il T trans (vale a dire T m) del patibolo è 56,6 ± 0,3 ° C 6.
Per raggiungere osteoconduttività, un protocollo è stato sviluppato per rendere scaffold SMP basati PCL con pori altamente interconnessi basati su un metodo 6,13,14-colata solvente particolato lisciviazione (SCPL). Polycaprolactone diacrilato (PCL-DA) (M n = ~ 10.000 g / mol) è stata utilizzata per permettere una rapida, reticolazione fotochimica ed è stato sciolto in diclorometano (DCM) per consentire solventi colata sul modello sale. Dopo polimerizzazione fotochimica ed evaporazione del solvente, il modello di sale è stato rimosso per lisciviazione in acqua. La dimensione media del sale regola dimensione dei pori patibolo. È importante sottolineare che il modello sale era fusa con acqua prima di solvente di fusione per ottenere pori interconnectivity.
Bioattività è stata impartita al ponteggio SMP dalla formazione in situ di un rivestimento polydopamine sulle pareti dei pori 6. Bioattività è spesso introdotto ponteggi dall'inclusione di vetro o vetroceramica riempitivi 15. Tuttavia, questi possono dare origine a indesiderati fragili proprietà meccaniche. La dopamina ha dimostrato di formare un aderente, polydopamine strato sottile su una varietà di substrati 16-19. In questo protocollo, l'impalcatura SMP è stato sottoposto ad una soluzione leggermente basica (pH = 8,5) di dopamina per formare un rivestimento di nanothick polydopamine su tutte le superfici murali pori 6. Oltre a migliorare idrofilicità superficiale per migliorare l'adesione cellulare e la diffusione, polydopamine ha dimostrato di essere bioattivo in termini di formazione di idrossiapatite (HAP) in seguito all'esposizione al liquido corporeo simulato (SBF) 18,20,21. In un ultimo passaggio, l'impalcatura rivestito viene esposto a trattamento termico a 85 ° C (T> T trans) which porta a ponteggi densificazione. Il trattamento termico è stato precedentemente notato per essere essenziale per il comportamento a memoria di forma patibolo, forse a causa di domini cristallini PCL riorganizzazione di maggiore vicinanza 14.
Abbiamo inoltre descritti i metodi per caratterizzare il comportamento auto-montaggio all'interno di un modello di difetto irregolare, plasmare il comportamento in termini di memoria prove di compressione meccanica ciclico-termici deformazione controllata (cioè recupero della forma e modellare la fissità), poro morfologia, e in bioattività vitro. Strategie per adattare le proprietà impalcature sono anche presentati.
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Protocol
1. Synthesizing PCL-DA macromero
- Eseguire la reazione acrylation.
- Pesare 20 g di PCL-diol (M n = ~ 10.000 g / mol) in un 250 ml pallone da fondo dotati di ancoretta magnetica Teflon coperto.
- Sciogliere il PCL-diolo in DCM.
- Aggiungere 120 mLlof DCM al pallone (concentrazione = 0,17 g / ml).
- Collocare un setto di gomma liberamente nel collo del pallone in modo da evitare l'accumulo di pressione evitando anche l'evaporazione di DCM.
- Mescolare la soluzione per ~ 30 min a ~ 250 rpm per sciogliere completamente il polimero.
- Aggiungere ~ 6,6 mg di 4-dimetilamminopiridina (DMAP) alla soluzione e sciogliere sotto agitazione.
- Collocare un setto di gomma saldamente nel collo del pallone. Lasciare che la soluzione per continuare a mescolare.
- Il setto di gomma, eliminare delicatamente il pallone con N 2 per ~ 3 min utilizzando un positivo N 2 ago pressione in ingresso e un ago apertocome valvola di sfogo.
- Rimuovere l'ingresso N 2 e uscita.
- Aggiungere 0,56 ml (4,0 mmoli) di trietilammina (Et 3 N) goccia a goccia con una siringa di vetro dotato di un ago inserito attraverso il setto di gomma.
- Aggiungere 0,65 ml (8,0 mmoli) di cloruro di acriloile gocciolata mediante una siringa di vetro dotato di un ago inserito attraverso il setto di gomma.
- Restituisce l'ingresso N 2 al pallone e permettere ai contenuti di mescolare sotto pressione positiva di N 2 per ~ 30 min.
- Preriscaldare bagno d'olio a 55 ° C.
- Dopo l'assegnato ~ 30 min, rimuovere l'ingresso N 2 e sostituire il setto con un condensatore.
- Immergere il pallone nel bagno d'olio preriscaldato.
- Lasciare il contenuto del pallone per mescolare per 20 ore.
- Dopo il assegnato 20 ore, togliere il pallone dal bagno d'olio e lasciare raffreddare il contenuto alla RT.
- Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere DCM solvente dal pallone.
- Purify il greggio prodotto PCL-DA.
- Per il matraccio, aggiungere ~ 135 ml di acetato di etile e sciogliere il greggio PCL-DA.
- Filtro a gravità la soluzione attraverso carta da filtro in un pallone a fondo tondo pulite 250 ml. (Nota: La soluzione può addensare sulla carta da filtro, non facilmente passando caso affermativo, applicare accuratamente leggero calore con una pistola di riscaldamento..)
- Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere acetato di etile solvente dal pallone.
- Per il matraccio, aggiungere ~ 140 ml di DCM e sciogliere il greggio PCL-DA.
- Trasferire il contenuto di un 500 ml imbuto separatore.
- Per l'imbuto, aggiungere 13,5 ml di 2 M di carbonato di potassio (K 2 CO 3).
- Tappare l'imbuto. Mescolare delicatamente i due strati invertendo l'imbuto e ruotare delicatamente una o due volte, avendo cura di scaricare la pressione tramite il rubinetto. Ripetere 3 volte.
- Sostituire il tappo con uno strato di Parafilm e lasciare che la miscela da separare O / N (~ 12 ore).
- Raccogliere il fondo, ostrato di Ganic in un pallone da 250 ml Erlenmeyer.
- Aggiungere ~ 5 g di solfato di magnesio anidro (MgSO4) al pallone e miscelare delicatamente.
- Gravity filtrare il composto attraverso carta da filtro qualitativo e in un ambiente pulito da 250 ml pallone fondo.
- Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere DCM solvente dal pallone.
- Secco sotto alto vuoto per rimuovere residui di DCM. (Nota: PCL-DA deve essere conservato al riparo dalla luce.)
- Confermare acrylation con 1 H NMR 22,23.
2. Preparare il SMP Scaffold (Figura 1)
- Preparare il modello di sale fuso.
- Utilizzare un setaccio 425 micron per ottenere cloruro di sodio (NaCl) particelle ~ 460 ± 70 micron di diametro. (Nota: dimensione media delle particelle può essere confermata da microscopia elettronica a scansione [SEM] le immagini con il software ImageJ.) 14
- Per una fiala di vetro 3 ml (ID = 12.9 mm), aggiungere 1,8 g di NaCl precedentemente setacciata.
- Aggiungere lentamente, in quattro porzioni, 7,5% in peso (in base al peso del sale) acqua DI (0,146 g) al flaconcino. Mescolare con una spatola metallica dopo l'aggiunta di ogni porzione di acqua.
- Tappare la fiala, avvolgere nel tessuto e posizionare verticalmente in una provetta da centrifuga. Centrifugare per 15 minuti a 3220 x g.
- Rimuovere il tappo e lasciare asciugare O / N (~ 12 ore).
- In una nuova fiala di vetro, preparare una "soluzione macromero" combinando 0,15 g di PCL-DA per ml di DCM. (Nota:. Per un patibolo, ~ 1 ml di soluzione devono essere preparati) Cap e mescolare la soluzione ad alta velocità su un vortex per ~ 1 min.
- In una nuova fiala di vetro 3 ml, preparare una "soluzione di fotoiniziatore" basata su 10% in peso 2,2-dimetossi-2-fenil acetofenone (DMP) in 1-vinil-2-pirrolidinone (NVP). Combinare 0.115 g di DMP in 1 ml di NVP. (Nota: Per un ponteggio, ~ è richiesto di 180 ml.) Cap, avvolgerlo in un foglio di alluminio (per bloccare la luce) e mescolare la soluzione ad alta velocità su un vortexper ~ 1 min. (Nota: se preparata in anticipo, la soluzione deve essere conservata in frigorifero e al riparo dalla luce.)
- Avvolgere la fiala contenente la soluzione macromero (escluso il tappo) con un foglio di alluminio (per bloccare la luce) e inserirlo tramite pipetta 15 vol% (in base al volume totale della soluzione macromero) della soluzione fotoiniziatore. Cap e mescolare la soluzione ad alta velocità su un vortex per ~ 1 min.
- Avvolgere il flaconcino contenente il modello di sali fusi (escluso il tappo), con un foglio di alluminio (per bloccare la luce) e aggiungere tramite pipetta la soluzione macromero / fotoiniziatore precedentemente preparato (~ 0,6 ml o fino a quando il modello è completamente coperto).
- Tappare la fiala, avvolgere nel tessuto e posizionare verticalmente in una provetta da centrifuga. Centrifugare per 10 minuti a 1.260 xg per distribuire la soluzione macromero tutto il modello.
- Togliere il foglio di alluminio, stappando la fiala ed esporre alla luce UV (365 nm, 25 W) per 3 min. O asciugare / N.
- Rimuovere la "scaffol sale contenentid "dalla fiala con una pinzetta dopo aver realizzato e fratturazione della parte superiore della fiala di vetro.
- In un becher da 400 ml, ~ preparare 200 ml di acqua / etanolo solvente (1: 1 vol: vol).
- Mantenere il ponteggio sommerso in acqua / etanolo solvente per 4 giorni con variazioni giornaliere solvente.
- Rimuovere il patibolo dal solvente e asciugare O / N.
3. L'applicazione di Polydopamine Coating per SMP Scaffold (Figura 1)
- In 400 ml becher munito di ancoretta Teflon coperto, preparare ~ 200 ml di una soluzione di dopamina cloridrato (2 mg / ml in tampone Tris 10 mM, pH = 8,5, 25 ° C). Mescolare a ~ 150 rpm.
- Inserire un ago monouso (lunghezza = 40 mm; scartamento = 20) nel scaffold, ~ metà della distanza attraverso il ponteggio. Avvolgere un filo attorno al mozzo ago.
- Immergere il ponteggio (con il mozzo dell'ago sopra la superficie della soluzione) nella soluzione dopamina agitazione ancorando il filo al bordo del becher.
- Degassare il ponteggio inserendo una siringa nel mozzo dell'ago e usarlo per estrarre aria dal ponteggio. (Nota: degassamento è completa quando non più aria può essere rimosso e la soluzione è completamente infiltrato il ponteggio.)
- Mantenere il ponteggio immerso nella soluzione dopamina agitazione per 16 ore.
- Rimuovere il ponteggio dalla soluzione e rimuovere l'ago. Risciacquare con acqua deionizzata e asciugare in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente per 24 ore.
- Posizionare il patibolo in un forno 85 ° C per 1 ora.
- Lasciare che il patibolo raffreddare a temperatura ambiente. L'impalcatura cilindrico finale sarà ~ 6 mm di diametro x ~ 5 mm di altezza.
4. La valutazione del comportamento "Self-fitting"
- Preparare un "irregolare modello di difetto CMF" utilizzando un foglio di plastica rigida con spessore ~ 5 mm. Utilizzare un trapano per creare un vuoto all'interno del foglio di plastica con un diametro medio di poco inferiore ~ 6 mm, come mostrato nella Figura 2A.
- In abEaker, acqua deionizzata calore (che rappresenta l'uso clinico di soluzione fisiologica) ad una temperatura di ~ 60 ° C.
- Posizionare il patibolo nel bicchiere di ~ 60 ° C acqua. Utilizzare pinzette per spingere l'impalcatura di sotto della superficie dell'acqua, esponendo tutti i settori per l'acqua. Continuare per ~ 2 minuti o fino a quando il ponteggio viene notevolmente ammorbidito (Figura 2B).
- Rimuovere il patibolo dal bicchiere e premere immediatamente (a mano) nel modello di difetto.
- Lasciare raffreddare a RT (~ 5-10 min) (Figura 2C).
- Rimuovere dal difetto di osservare la nuova forma provvisoria fissa e il ritorno dello stato relativamente più rigido (Figura 2D).
5. Test Memoria plasmare il comportamento
- Utilizzando un analizzatore dinamico meccanico (DMA, ad esempio un TA Instruments Q800 qui usato), eseguire una prova di compressione deformazione controllata ciclica termica meccanica su un ponteggio in due cicli (N) per determinare la forma fissità (R f) eforma di recupero (R r) (Figura 3).
- Equilibrare a 60 ° C (T alto) per 5 min.
- Comprimere una massima deformazione (ε m = 50%) a 50% / min.
- Tenere a ε m (5 min).
- Raffreddare a 25 ° C (T basso) e mantenere per 10 minuti per fissare la forma temporanea.
- Rimuovere il carico.
- Misurare la deformazione ultima nello stato privo di stress (ε u).
- Riscaldare a 60 ° C (T alto) e mantenere per 10 minuti per recuperare la forma permanente.
- Misurare il ceppo recuperato (ε p).
- Mentre ancora a 60 ° C (T alto), avviare il ciclo ° 2 (N = 2) comprimendo la scaffold al 50% dell'altezza recuperato dopo il 1 ° ciclo (N = 1).
- Ripetere 5.1.3-5.1.8 Per N = 2.
- Calcolare R f e R r per N = 1 e 2 con le seguenti equazioni:
R f (N) = [ε u (N) / ε m] R r (N) = [ε m - ε p (N)] / [ε m - ε p (N -1)]
6. Visualizing dimensione dei pori e Pore interconnettività
- Usando la microscopia elettronica a scansione (SEM, ad esempio, una FEI Quanta SEM usati nel presente documento), osservare la dimensione dei pori e pori interconnettività.
- Con una pinzetta per tenere il patibolo SMP, immergere in N liquido 2 per 1 min.
- Rimuovere da N 2 liquido e frattura lungo il centro del ponteggio con una lama di rasoio pulito.
- Utilizzando nastro di carbonio, apporre una delle due metà SMP scaffold sul campionein scena con la superficie fratturata rivolta verso l'alto.
- Sputter cappotto con Au-Pt (~ 4 nm).
- Acquisire l'immagine SEM ad una tensione di accelerazione consigliata di 10-15 kV (Figura 4A).
7. Prova di Bioattività in vitro
- In una provetta da centrifuga da 50 ml, aggiungere ~ 30 ml di 1X SBF 24.
- Ottenere un ponteggio nella sua originale forma permanente cilindrico moulding. Tagliare il ponteggio a metà (lungo il bordo circolare) usando una lama pulita.
- Inserire un individuo a metà patibolo nel tubo da centrifuga preparato e berretto.
- Mantenere il tubo a 37 ° C in un bagno d'acqua in condizioni statiche senza modifiche SBF.
- Dopo 14 giorni, rimuovere l'impalcatura dalla SBF e asciugare all'aria per 24 ore.
- Con del nastro carbonio, apporre il patibolo sul palco del campione con la superficie fratturata rivolta verso l'alto.
- Sputter cappotto con Au-Pt (~ 4 nm).
- Acquisire l'immagine SEM ad un relodato tensione di accelerazione di 10-15 kV (Figura 4B).
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Representative Results
La risultante SMP scaffold basato PCL è in grado di auto-montaggio in un modello CMF difetto (Figura 2). Dopo una breve esposizione a caldo salina (~ 60 ° C), il patibolo cilindrica ammorbidisce permettendo al patibolo da premere manualmente in ed espandere all'interno del modello difetto. Dopo raffreddamento a RT, l'impalcatura è fissato nella sua nuova forma temporanea che è trattenuta dopo la rimozione dal difetto.
Il comportamento a memoria di forma di un ponteggio SMP viene quantificato prove di compressione meccanici ciclici-termico deformazione controllata in termini di forma fissità (R f) e recupero della forma (R r) (Figura 3). Per questo SMP scaffold basato PCL, valori (%) per cicli N = 1 e 2 sono: R f (1) = 102,5 0,7, R f (2) = 101,8 0,3, R r (1) 95,3 0,9 e R r (2) = 99,8 0,2 6.
L'impalcatura SMP mostra un poro morfologia fortemente interconnesso come osservatoda imaging SEM (Figura 4A). Questo è stato ottenuto mediante l'uso di un modello di sali fusi, formata mediante l'aggiunta di una piccola quantità di acqua al sale setacciata (Figura 1).
Dopo l'esposizione al corpo fluido simulato (SBF; 1X) per 14 giorni, imaging SEM conferma la formazione di HAP (Figura 4B) indicando così scaffold bioattività.
Figura 1. Schema per la preparazione di scaffold SMP rivestito con polydopamine. ASMP impalcatura è fabbricato mediante il protocollo descritto in base alla cura fotochimica di policaprolattone diacrilato (PCL-DA) utilizzando un metodo di particolato-lisciviazione-fusione solvente (SCPL) impiegando fuso template sale e l'applicazione di un rivestimento polydopamine bioattivo. Il trattamento termico finale a 85 ° C (T> T trans) induce scaffold densificazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. osservazione del comportamento auto-montaggio. Un ponteggio SMP cilindrica (~ 6 mm di diametro x altezza ~ 5 mm) è installato all'interno di un "modello di difetto irregolare" (A) nel modo seguente. Dopo il riscaldamento in acqua a ~ 60 ° C (T> T trans), l'impalcatura ammorbidisce e diventa malleabile (B) e quindi può essere premuto meccanicamente ("montata") all'interno del modello di difetto (C). Dopo raffreddamento a RT, l'impalcatura SMP viene rimosso e mantiene la sua forma nuova e temporanea fisso (D). Al successivo riscaldamento a ~ 60 ° C, l'impalcatura subisce recupero della forma alla forma cilindrica originale, generico. 
Figura 3. misurazione del comportamento a memoria di forma. Il comportamento a memoria di forma di un ponteggio SMP viene quantificata mediante una prova di compressione ciclica meccanico-termico deformazione controllata su un'impalcatura per determinare la forma fissità (R f) e recupero della forma (R r) sulla base misure di ε m, ε u, e ε p. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 4. Osservazione di pore interconnettività e la formazione di idrossiapatite (HAP). Immagini Rappresentante SEM di un non patinata, trattato termicamente SMP patibolo (scala bar = 200 micron) (A) e patinata, trattata termicamente patibolo dopo l'esposizione al SBF (1X) per 14 giorni (barra della scala = 50 micron) (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive la preparazione di una impalcatura basato PCL polydopamine rivestite cui sé-montaggio comportamento, nonché osteoinduttività e bioattività, rende di interesse per il trattamento di difetti ossei irregolari CMF. Aspetti del protocollo può essere modificato per cambiare varie caratteristiche patibolo.
Il protocollo inizia con acrylation di un PCL-diolo per consentire cura UV. Nell'esempio riportato, il PCL-diolo M n è ~ 10.000 g / mol. Tuttavia, regolando opportunamente quantità di cloruro di acriloile e Et 3 N usato durante la sintesi di PCL-DA, un diolo PCL con un maggiore o minore M n può essere utilizzato per aumentare o diminuire, rispettivamente, la densità di reticolazione.
Il modello di sali fusi è un componente importante per il protocollo (Figura 1). La dimensione media di sale determina la conseguente dimensione del patibolo pori. Nell'esempio descritto, la dimensione media sale era ~ 460 ± 70 &# 181; m. Mentre una dimensione più piccola di sale può essere utilizzato, va tenuto presente che l'impalcatura subisce contrazione durante la fase finale di trattamento termico che riduce la dimensione dei pori. Vagliatura del sale viene utilizzato per ridurre la distribuzione dimensionale sale e, di conseguenza, la distribuzione delle dimensioni dei pori. Per produrre un ponteggio con pori altamente interconnessi, fusione del sale è stata indotta mediante l'aggiunta di una piccola quantità di acqua (7,5% in peso in base al peso del sale). Questo è noto a dissolversi parzialmente isolate particelle di NaCl in un modello poragen continuo 25,26. A seconda della dimensione media di sale, la quantità di acqua aggiunta deve essere regolato 14. Inoltre, durante la fusione del sale, l'acqua deve essere aggiunto gradualmente, misto meccanico e infine centrifugati per assicurarne la distribuzione uniforme e l'imballaggio delle particelle di sale.
Dopo aver formato il modello di sali fusi, il PCL-DA viene disciolto in DCM per solvente colata. Nel protocollo descritto, un concentration di 0,15 g di PCL-DA per 1 ml di DCM è stato utilizzato. Questa concentrazione può essere aumentata o diminuita. Tuttavia, mentre concentrazioni crescenti si prevede un aumento patibolo modulo, può anche produrre ponteggi con minori pori interconnettività 14.
Una volta che la soluzione precursore è stato aggiunto sullo stampo di sale, la centrifugazione è utile aiutante nella sua diffusione nel modello. Dopo una rapida polimerizzazione UV, asciugatura ad aria permette l'evaporazione del solvente DCM. Dopo la rimozione dallo stampo, il ponteggio viene immerso in acqua / etanolo (1: 1 vol: vol) per 4 giorni per rimuovere il modello sale. Immagini SEM conferma la formazione di un poro morfologia altamente interconnessi (Figura 4A).
Un rivestimento polydopamine viene applicato alle pareti dei pori del ponteggio per impartire bioattività. A causa della risultante impalcatura ritiro, è preferibile applicare il rivestimento prima del trattamento termico finale passaggio 6. Inoltre, degasaggioil ponteggio mentre immerso nella soluzione acquosa dopamina assiste infiltrazione. I resti scaffold degassati sommersi nella soluzione per facilitare la copertura polydopamine uniforme. Una volta rivestito e risciacquato, l'impalcatura in precedenza bianco presenta un caratteristico colore marrone di polydopamine 21. Così, la copertura in tutta l'impalcatura può essere valutata mediante ispezione visiva dimezzando un ponteggio per confermare polydopamine diffusione.
Dopo l'applicazione del rivestimento polydopamine, un trattamento termico finale viene eseguita (85 ° C, 1 ora). Come notato, questo processo comporta scaffold restringimento. Tuttavia, il trattamento termico è essenziale per ottenere il comportamento a memoria di forma 14, forse a causa della riorganizzazione dei domini cristallini PCL (cioè segmenti di commutazione) in stretta vicinanza.
Come mostrato in Figura 2, l'impalcatura SMP raggiunto auto-montaggio in un modello di difetto a causa della sua forma thermoresponsive meMory natura. L'esposizione al caldo salina (~ 60 ° C) fusione indotta di domini cristallini PCL, in modo tale che l'impalcatura addolcita potrebbe essere premuto nel modello difetto. Quando è stata rilasciata la pressione manuale, il recupero della forma ha promosso l'espansione del patibolo per riempire i contorni irregolari. Al raffreddamento a RT, domini cristallini PCL riformati, che fissa il patibolo nella sua nuova forma temporanea che è stato trattenuto al momento della rimozione dal difetto. In precedenza, abbiamo confermato che i pori lungo i bordi del ponteggio rimosso rimasti molto aperto nonostante contatto con lo stampo 6.
Misurato con ciclico termici prove di compressione meccaniche deformazione controllata (Figura 3), il comportamento a memoria di forma ideale è caratterizzato da R f e R r valori di 100%. Per il patibolo SMP descritto, R valori F per cicli 1 e 2 erano leggermente> 100% 6. R f è stato precedentemente osservato per essere leggermente grmangiatore di 100% 14,27 a causa di un leggero aumento della tensione di pressione durante la fissazione forma dalla ricristallizzazione di segmenti PCL in più strutture compatte 27 o da ricristallizzazione compressione indotta di PCL. Inoltre, R R è aumentato da 1 a ciclo ciclo 2 6. Un aumento dei valori di R R è già stato notato per solidi 28,29,22 e 13,14,23 poroso SMP. Si ritiene che durante il primo ciclo, ceppo residui provenienti dalla lavorazione viene rimosso tale che aumenti recupero della forma nel ciclo successivo 7.
Il descritto impalcatura ingegneria tissutale realizza la serie specifica di proprietà critiche per il successo del trattamento di difetti ossei CMF. L'impalcatura dovrebbe facilitare osteointegrazione grazie alla sua capacità di "auto-fit" all'interno di un difetto osseo CMF irregolare. Osteoconduttività è previsto basa sulla interconnettività pori raggiunto così comebiodegradabilità patibolo. Infine, grazie al rivestimento polydopamine, l'impalcatura è bioattivo come indicato dalla formazione di HA nei test in vitro (Figura 4B). Questo bioattività è previsto per facilitare l'integrazione e il legame con il tessuto circostante osso. Così, questa impalcatura rappresenta un'alternativa di autotrapianto e sostituti ossei convenzionali per CMF riparazione difetto osseo.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano Texas A & M University Ingegneria e Experiment Station (TEE) per il sostegno finanziario di questa ricerca. Lindsay Nail ringrazia il sostegno della Texas A & M University Louis Stokes Alliance for Minority partecipazione (LSAMP) e la National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP). Dawei Zhang grazie alla Texas A & M University Tesi Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
| 4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
| Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
| Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
| Sieve | VWR | 47729-972 | |
| UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
References
- Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
- Elsalanty, M. E., Genecov, D. G.
- Hollister, S. J., et al.
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