Summary
De novo lipogenese og β-fedtsyreoxidation udgør vigtige metaboliske veje i hepatocyt, veje, der forstyrres i flere metaboliske lidelser, herunder fedtlever sygdom. Her demonstrerer vi isolering af muse primære hepatocytter og beskrive kvantificering af β-fedtsyre oxidation og lipogenese.
Protocol
Alle dyreforsøg skal udføres i overensstemmelse med lokale og føderale lovgivning og med godkendelse af en institutionel IACUC og stråling sikkerhed administration.
1. Fremstilling
- Adskillige dage før assayet, optø 500 ml flaske Liver Digest Medium (LDM), og genfryses ~ 35 ml portioner i 50 ml koniske rør. Opbevar ved -20 ° C indtil brug.
- En dag forud for assayet, pre-sterilisere rene dissektion værktøjer ved autoklavering.
- På dagen for assayet, behandler den nødvendige mængde 24-brønds dyrkningsplader med kollagen.
- Bland 1 del 3 mg / ml rottehalecollagen med 50 dele PBS. Der tilsættes ca. 500 pi til hver brønd i en 24-brønds plade og inkuberes i 3-5 minutter ved stuetemperatur (RT). Fjern kollagen og lad pladen lufttørre i hætte. Gentag mindst en yderligere gang.
Bemærk: Kollagen belægning kan udføres op til en uge i adVance, og pladerne opbevares ved 4 ° C forseglet i plastfolie.
- Bland 1 del 3 mg / ml rottehalecollagen med 50 dele PBS. Der tilsættes ca. 500 pi til hver brønd i en 24-brønds plade og inkuberes i 3-5 minutter ved stuetemperatur (RT). Fjern kollagen og lad pladen lufttørre i hætte. Gentag mindst en yderligere gang.
- Forbered LDM til analyse: Thaw LDM og varme til 37 ° C og justering af pH til 7,4 ved anvendelse af 1 N KOH. Filter ved hjælp 0,2 um sprøjte filter og sted i en recirkulerende 42 ° C vandbad.
- Varm 25 ml Lever perfusionsmediet til 42 ° C i recirkulerende vandbad.
- Forbered 90% kolloidt silica overtrukket med polyvinylpyrrolidon: Tilsæt 1 ml 10X DPBS til 9 ml kolloidt silica overtrukket med polyvinylpyrrolidon. Indstil pH til 7,4 ved anvendelse af 0,1 N HCI. Filter med en steril 0,2 um sprøjtefilter. Opbevar ved stuetemperatur.
- Varm udpladningsmedium til 37 ° C.
2. Isolering af Primary Mouse Hepatocytter
- Oprette peristaltisk pumpe, slanger og dissektion tabel: steriliseres slangen ved skylning med 5 ml 70% ethanol i destilleret vand efterfulgt af 10 ml sterilt vand. Placer slangen i Liver perfusionsmediet og køre pumpe til at fyldehele længden af slangen.
- Sacrifice musen ved institutionelt godkendt metode.
- Dissekere åbne bughulen: Spray musen maven rundhåndet med 70% ethanol. Ved stump-ende saks, lave en midtlinjeincision gennem dermis længde af maven og afspejler sideværts. Lav en tilsvarende snit i bughinden at eksponere indvoldene.
- Med et stumpt instrument, forsigtigt forskyde tarmene at blotlægge den abdominale vaskulatur Find den abdominale vena cava inferior (IVC) og placere en sutur under blodkarret, distalt i forhold til nyrevenen
- Distalt for suturen, placere en nål og kateter i IVC, føre det ud over det niveau af suturen. Mens kanylen stadig på plads, binde suturen omkring kateteret til at holde det på plads. Fjern forsigtigt nålen. Hvis det gøres korrekt, blod med strømning gennem kateteret.
- Ved hjælp af en pipette, fylde det resterende område i kateteret med perfusion medium, såledesat ingen luft er til stede. Med stor omhu, lægger slangen til kateteret.
- Dissekere åben lunge hulrum: forsigtigt afspejle de essentielle lever lapper at eksponere membranen. Punktere forsigtigt membranen med skarpe spids saks, derefter foretage en lateral snit til at eksponere pleurahulen, idet man undgå galdeblære og pleural kar. Placer en bulldog klemme omkring thorax vena cava inferior lige proximalt til den hepatiske vene.
- Skær portalen vene og tænd for pumpen ved 3 - 4 ml / min. Perfundere leveren med Liver Perfusion Medium i 5 minutter under anvendelse af ca. 20 ml perfusionsmedium.
Bemærk: Leveren bør straks skifte fra rød til grå / tan. Hvis dele af leveren forbliver rød, sandsynligvis angiver, at det dårlig perfusion, og sandsynligheden for en vellykket isolation er stærkt formindsket. Under perfusion, være omhyggelig med at sikre, at mediet ikke løber ud og at der ikke bobler ind i slangen. - Efter 5 minutters inkubation, stoppumpen og overføre slangen til Liver Digest Medium. Genstarte pumpen og perfundere leveren for en anden 10 - 15 min (indtil mediet er opbrugt).
- Ved afslutningen af perfusionen, stoppe pumpen. Leveren skal have en rødlig farvetone og forekommer noget forstørret. Udskære leveren ved omhyggelig dissektion. Fjern galdeblære og overføre leveren til 10 cm vævskulturskål.
- I et bio-kabinet, tilsættes 10 ml udpladningsmedium (tabel 1) til leveren. Forsigtigt skrabe leveren ved hjælp af enten pincet eller en skalpel for at fjerne hepatocytterne. Filtrer suspensionen under anvendelse af en 100 um cellefilter og overføres til en 50 ml konisk rør. Vask pladen med yderligere 10 ml Belægning Medium og pool i 50 ml konisk rør.
- Pelletere cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 350 xg, 4 ° C.
- Aspirer mellemstore og resuspender pellet i 10 ml Belægning Medium og der tilsættes 10 ml 90% kolloid silica belagt med polyvinylpyrrolidone. Bland forsigtigt og centrifuger som i trin 2.11. Efter centrifugering vil et lag af døde celler være flydende på toppen af blandingen, medens de levende celler vil bundfælde på bunden.
- Aspirer døde celler og medium. Vask 2 gange med 20 ml udpladningsmedium, centrifugeres som i 2.11.
- Resuspender celler i 10 ml medium. Plating Tæl cellerne med et hæmocytometer og placere 9 x 10 4 celler / brønd i kollagen-behandlede 24-brønds dyrkningsskåle. Inkuber i et 37 ° C vævsdyrkningsinkubator i 2 timer. Hver plade kan anvendes til enten fedtsyreoxidationen assay eller lipogenese-assay.
- Eventuelt ændre brønde til vedligeholdelsesmedium (tabel 1) og dyrkning ved 37 ° C. Celler kan dyrkes i 2 - 3 dage uden at påvirke analyseresultaterne.
3. fedtsyreoxidationen Assay
Advarsel: Brug af radioaktivitet kan være farlige. Alle indkøb, opbevaring, håndtering og disposal af radioaktivt materiale skal udføres i overensstemmelse med de institutionelle, statslige og føderale bestemmelser og retningslinjer.
- 16 - 20 timer før assay vaskes celler 2 gange med varmt PBS. Skift af cellerne til serumfrit serumudsultning Medium (tabel 1) med 20 nM glucagon og inkuberes natten over ved 37 ° C.
Bemærk: Fordi kalvefosterserum indeholder en ukendt koncentration af metaboliske hormoner (f.eks insulin, glucagon), serum sulte cellerne for at fjerne eventuelle forstyrrende virkninger dette vil have på assayet. Celler er levedygtige i serumudsultning medium for> 24 timer. Glucagon behandling anvendes til at stimulere fedtsyreoxidation inden hepatocytterne. - Om morgenen af assayet forberede præinkubation Medium: Resuspender en passende mængde natriumpalmitat i ultrarent vand for at lave en 100 mM opløsning og opvarmes til 70 ° C i 10 minutter. I mellemtiden forberede den nødvendige mængde (0,5 ml pr brønd i en plade med 24 brønde)DMEM med 25 mM HEPES, 1% BSA fraktion V og 20 nM glucagon. Opvarm til 37 ° C.
- Når solubiliseret, tilføje Palmitate til en slutkoncentration på 250 uM til mediet. Skift hepatocytter til at pre-inkuberingsmedium og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer. Reservere nogle præinkubation medium ved 37 ° C til senere brug.
- Under inkubationen, tørre en passende mængde af 14C-palmitat (0,5 uCi / brønd) ved fordampning under nitrogengas.
- For eksempel at måle 24 prøver i en 24-brønds plade, overføre 120 pi 0,1 uCi / ml 14C-palmitat til et 1,5 ml rør. Langsomt afdampe ethanolen opløsningsmidlet ved indblæsning af nitrogengas i opløsningen fra en afstand på 3-5 cm i et stinkskab. Opløsningsmidlet skal inddampes i ca. 30 - 40 min, hvorefter tør 14C-palmitat i bunden af røret.
- Ca. 15 minutter før afslutningen af inkubationen resuspender 14C-palmitat i 0,1 N NaOH (12,5 pl / uCi). Der inkuberes ved 70 ° C i 10 minutter. Tilføj tre volumener varm Præinkubering Medium og blandes ved pipettering op og ned.
- Spike hver brønd med 25 pi fortyndet 14 C-palmitat. Bland ved forsigtigt at vippe pladen og inkuber ved 37 ° C i 90 minutter. Dette er assaypladen.
- Under inkubationen forberede filtrerpapir Plate (figur 1).
- Fjern låget fra en steril 24-brønds plade. Placer en 2 cm x 2 cm stykke filtrerpapir i bunden af hver af brøndene. Overlay pladen med et stykke 4 "x 7" parafilm.
- Ved hjælp af en stor rektangulær genstand, såsom en mikropipette tip boksen gnide parafilm på brøndene at perforere parafilm ved brønden åbninger og skabe en tætning i resten af pladen. Fjern de perforerede cirkler af parafilm nu dækker brøndene. Pladen skulle nu være tæt dækket med parafilm på alle områder undtagen godt openings.
- 10 min før afslutningen af inkubationen tilsættes 200 pi 3 N NaOH til hver brønd af filtrerpapiret Plate, at sikre filtrerpapiret absorberer al væsken.
- Eventuelt før frysning, overføre mediet til en frisk 24-brønds plade. Efter vask en gang med PBS, lysere de resterende celler i 0,1 N HCI og beregne proteinindhold ved BCA-assay.
- Ved slutningen af inkubationen lynfrys Assaypladen i flydende nitrogen. Vær omhyggelig med at sikre hver brønd er helt frosset, før du fortsætter.
- Tilsættes 100 pi 70% perchlorsyre til hver brønd i assaypladen. Umiddelbart dække med filtrerpapiret Plate. Placer pladerne på en orbitalryster og klippe ved orbital hastighed på 80 rpm ved stuetemperatur i 2 timer.
- Efter inkubationen behandle prøverne:
- For at måle CO 2 fraktionen, overføre filter papir firkanter til 4 ml væskescintillations- væske i en scintillationshætteglas og foranstaltning 14C signal.
- Til måling af syreopløselige materiale, overføre 400 pi medium til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 minutter. Tilsættes 100 pi af den resulterende supernatant til 500 pi 2: 1 chloroform-methanol (vol / vol), og vortex kortvarigt.
- Tilsæt 250 pi vand til blandingen, og vortex igen. Centrifugér prøver i 10 minutter ved 3000 x g. Transfer 200 pi af den øvre fase til 4 ml flydende scintillationsvæske i et scintillationshætteglas og måle 14C signal.
4. lipogenese Assay
- Aftenen før analysen påbegyndes, vaske cellerne 2 gange med varmt PBS. Skift hepatocytterne til serumudsultning Medium med 100 nM insulin. Inkuber natten over ved 37 ° C.
Bemærk: Fordi kalvefosterserum indeholder en ukendt koncentration af metaboliske hormoner (f.eks insulin, glucagon), Serum sulte cellerne for at fjerne eventuelle forstyrrende virkninger dette kan have på analysen. Celler er levedygtige i serumudsultning medium for> 24 timer. Insulin anvendes i dette assay til at stimulere lipogenese. - Gør lipogenese Medium: serumudsultning Mellem med 100 nM insulin, 10 uM kold acetat og 0,5 uCi 3H-acetat per brønd. Skift celler til lipogenese Medium og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer. Omfatter alle forbindelser af interesse, der skal testes.
- Efter inkubationsperioden vaskes cellerne 2 gange med PBS. Lyserer celler ved at skrabe i 120 pi 0,1 N HCI. Reserve 10 pi for protein assay (vurdering af, BCA assay), og overførsel 100 pi til 1,5 ml mikrofugerør.
- Uddrag lipider ved tilsætning af 500 pi 2: 1 chloroform-methanol (vol / vol). Vortex kort og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter. Tilsæt 250 pi vand, vortexes og inkuberes ved stuetemperatur i yderligere 5 min. Centrifuger prøver 10 min ved 3.000 xg RT. Omhyggeligtoverføre nederste fase til 4 ml flydende scintillationsvæske i et scintillationshætteglas og måle 3H-aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyt isoleringer typisk resultere i 1 - 3 x 10 7 totale celler. Efter inkubation natten over, vil cellerne blive vist sekskantede, hvoraf mange vil blive binucleated (figur 2). Sunde celler skal være blottet for granuleringer eller blærer, som er tegn på celledød.
Generelt er fedtsyreoxidation assay kørt i tre til fire replikater pr testforbindelse. Tæller for CO 2 prøver er cirka en femtedel af dem, der stammer fra den sure opløseligt materiale. Vi typisk beregne forholdet mellem CO 2 til syreopløseligt materiale som et mål for fuldstændig oxidation (dvs. den mængde oxideret via citronsyre cyklus). Stoffer, der fremmer cellulær respiration, såsom carbonyl cyanid-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP) vil forskyde dette forhold mod CO 2, der mere oxidation via TCA-cyklus. Inhibitorer af respirationskæden vil mindske oxidering på hele(Figur 3). Når lodsning dette assay, er det bedst at indbefatte en ikke-cellekontrol at verificere proceduren producerende celle-specifik aktivitet.
Den lipogenese-analysen er oftest i forhold til et nul tidspunkterne kontrol (celler behandlet med substrat umiddelbart før høst). Assayet skal være lineært i forhold til tiden gennem mindst fire timers inkubation. Forbindelser, der forbedrer fedtsyreoxidation, såsom FCCP eller mindsker ATP-syntese, såsom oligomycin, vil reducere lipogenisk aktivitet (figur 4).
Figur 1: Fremstilling af filterpladen at forberede filterpladen som beskrevet i trin 3.6, fjerne dækslet fra en steril 24-brønds plade. Placer en 2 cm x 2 cm stykke filtrerpapir i bunden af hver brønd. Overlay hele pladen med en 7 "x 4" stykke parafilm, og gnid pladen til stramt at tætne toppen af brøndene. Dette vil generere perforerede cirkler af parafilm over såvel åbninger, som bør fjernes. Efter tilsætning af perchlorsyre i trin 3.9, Filtret Plate stramt over assaypladen at frembringe en forsegling.
Figur 2: primære hepatocytter i kultur fasekontrast billeder af sunde og usunde primære muse hepatocytter 16 timer efter udpladning i collagenovertrukne 24-brønds plader. Scale bar, 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fedtsyreoxidation med Primær Mus hepatocytter in Culture 14 C-palmitat oxidation til (A) CO 2, (B) syreopløseligt materiale, og (C) forholdet mellem CO 2 til syreopløseligt materiale fra primære hepatocytter inkuberet med køretøjet, FCCP eller oligomycin. Data er gennemsnit ± SEM. * p <0,05, ** p <0,01 vs. køretøj med én-tailed t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: lipogenese i dyrkede Primær Mouse hepatocytter (A) lipogenisk aktivitet vs. tid i primære hepatocytter behandlet med 3H-acetat og (B) lipogen aktivitet i nærvær af køretøjet, oligomycin eller FCCP. Data er gennemsnit ± SEM. *** p <0,001 vs. køretøj ved en-halet t-test.
| Tabel 1 | |||
| Dyrkningsmedier | |||
| Udpladningsmedium | |||
| DMEM | 500 ml | ||
| FBS | 10% | ||
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
| Dexamethason | 1 uM | ||
| Insulin | 0,1 uM | ||
| Vedligeholdelsesmedium | |||
| DMEM | 500 ml | BSA fraktion V | 0,2% |
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
| Dexamethason | 0,1 uM | ||
| Insulin | 1 nM | ||
| Sult Medium | |||
| DMEM | 500 ml | ||
| BSA fraktion V | 0,2% | ||
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tiden fra offer til perfusion bør være mindre end 3 minutter for ideel perfusion og collagenasefordøjelse af leveren. Når perfusion med perfusionsmediet påbegyndes, skal leveren straks ændre udseende fra rød til bleg. Efter ca. 10 minutters inkubation med LDM, vil leveren synes hævede og pink. I tilfælde af at perfusionen er utilstrækkelig, kan leveren ikke udviser disse ændringer, og det vil typisk resultere i en lavere hepatocyt udbytte.
Efter vasketrinene kan isolerede hepatocytter opbevares i flere timer i suspension på is før udpladning. Når forgyldt, dyrkede hepatocytter kræver flere timer at overholde og spredt ud. Efter 2 timer inkubation i Plating Medium, vil hepatocytter forblive lille og rund. Efter inkubation natten over, vil hepatocytter påtage sig en mere karakteristisk sekskantet udseende, hvoraf mange vil blive binucleated. Hvis præparatet er usunde, calen vil udstille mange granuleringer og lejlighedsvis blæredannelse, indikerer celledød. For bedst bevare levedygtigheden kultur, bør medierne skiftes hver 24 timers og agtpågivenhed for at minimere eksponeringen for åbne luft.
Natriumpalmitat er uopløselig i vand ved stuetemperatur, men efter inkubation ved 70 ° C bør opløses fuldstændigt. Udsættelse for RT vil forårsage lipid til at størkne hurtigt, derfor er det nødvendigt at arbejde hurtigt. Når palmitat er blevet opløst i præinkubation Medium, er det vigtigt at opretholde mediet ved 37 ° C for at opretholde opløselighed af lipiderne.
Som nævnt ovenfor, for at sikre nøjagtige resultater fra fedtsyreoxidationen assay skal mediet være helt frosset i flydende nitrogen. Dette forhindrer enhver undvigelse af CO 2 under tilsætningen af perchlorsyre til brøndene. Umiddelbart efter tilsætningen af perchlorsyre til de frosne prøver, skal assaypladen være tæt Covered af Filter Paper Plate, og sørg for at tilpasse pladerne til overførsel af gas mellem brøndene. Da filterpapiret gennemvædes med et overskud af NaOH, støkiometrien af reaktionen er i stand til at opfange det frigivne CO 2 som NaHCO3. Eksperimenter følger denne protokol har genereret reproducerbare resultater, med typiske replikater der% CV ≤ 10. Hvis det er nødvendigt, syreopløseligt materiale fra fedtsyreoxidationen assay eller cellelysatet fra lipogenese-assay er i stand til at blive opbevaret ved -80 ° C og behandles senere uden nogen mærkbar virkning på resultaterne. De ovenfor beskrevne assays giver mulighed for en relativt simpel og tid effektiv mekanisme til at vurdere lipidmetabolisme i primære hepatocytter isoleret fra muselever. Ved anvendelse af ex vivo kultur, at disse metoder teste virkningerne af en række betingelser for fedtsyreoxidation og lipogenese. Denne protokol kan tilpasses til at vurdere betydningen af genetiske ændringer på disse proceSSES imidlertid isoleringen af hepatocytter tid-begrænsende og dermed in vivo analyser kan være mere egnet til at undersøge visse transgene dyremodeller. Hvis analyse af flere hepatocyt præparater er nødvendigt, kan normalisering af analyseværdier til proteinniveauer udføres som beskrevet i valgfrie trin 3.7.1 og anvendt til normalisering. Vi anbefaler assays udføres i flere præparater sammenlignes som relative ændringer i forhold til en passende kontrol.
Endelig har vi ikke udforsket muligheden for længere perioder kultur kan imidlertid hepatocytter udviser tilsvarende metaboliske egenskaber efter flere dage i kultur. Med let modifikation, kan denne protokol tilpasses for at muliggøre flere dages behandlinger forud for at vurdere virkningerne af forbindelser på lipidmetabolismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Perfusion Medium | Life Technologies | 17701038 | |
| Liver Digest Medium | Life Technologies | 17703034 | Aliquot and store at -20 °C |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10X DPBS | Corning | 46-013-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Life Technologies | 26140079 | |
| Collagen | Life Technologies | A1048301 | |
| Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone | GE Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |
| Penicillin / Streptomycin | Cellgro | 30-001-CI | |
| Insulin | Sigma | I0516-5ML | |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | |
| Albumin (BSA), Fraction V | MP Biomedicals | 103703 | |
| 24-Well Culture Dish | Corning Falcon | 353047 | |
| Tygon S3 Tubing | Cole Parmer | 06460-34 | |
| Male Leur Lock to 200 Barb Connectors | Cole Parmer | 45518-00 | |
| 24 G x 3/4" Catheter | SurFlo | SROX2419CA | |
| Perma-Hand Silk Suture | Ethicon | 683G | |
| Cell Strainer | Corning Falcon | 08-771-2 | |
| IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath | Fisher | 13-874-3 | |
| MasterFlex C/L Peristaltic Pump | MasterFlex | HV-77122-24 | |
| Microclamp | Roboz | RS-7438 | Pre-sterilize in autoclave |
| 5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors | Roboz | RS-6810 | Pre-sterilize in autoclave |
| 24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5130 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5137 | Pre-sterilize in autoclave |
| 60 ml Syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 50 ml conical tubes | Corning Falcon | 352070 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| CO2 Incubator | |||
| Serological pipets | |||
| 1,000, 200, 20 μl pipet and tips |
References
- Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).
- Lazo, M., et al. Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994. American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).
- Angulo, P.
- Adams, L. A., et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study. Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).
- Feldstein, A. E., et al. Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).
- Day, C. P., James, O. F. Steatohepatitis: a tale of two 'hits'. Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).
- Donnelly, K. L., et al. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).
- Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).
- Parks, E. J., Hellerstein, M. K. Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques. Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).
- Befroy, D. E., et al. Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy. Nature medicine. 20, 98-102 (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malaria journal. 6, 169 (2007).
